電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

この方法により、天然脂質二層環境におけるシトクロムBO3のような気体膜酵素のプロトン輸送活性の研究が可能となる。この単一酵素技術の主な利点は、電気化学を使用していつでも酵素反応を開始および停止する可能性です。ガラス注射器を使用して、5ミリグラムのアリコートを作るために、大腸菌からガラスバイアルに脂質極性エキスのクロロホルムストックの200マイクロリットルを転送します。

1ミリグラムの50マイクロリットルを1ミリグラムのユビキノン10を脂質に加えて、1〜100ユビキノン10の脂質の最終的な比率を作る。混合物に、脂質略記されたFDLLを標識した長波長さ1ミリグラムの20マイクログラムの蛍光色素を加える。クロロホルム溶液を短い渦で均質化し、穏やかな窒素またはアルゴン流の下でクロロホルムの大部分を蒸発させます。

少なくとも1時間真空下でさらに蒸発することによってクロロホルムの痕跡を完全に取り除きます。ユビキノン10 FDLLドライミックスの1アリコートに40ミリモルMOPS pH 7.4バッファーの312.5マイクロリットルを追加します。脂質膜が完全に再懸濁されるまで渦を混ぜ、超音波浴で2分間の処理を行う。

次に、リポソームの内部にカプセル化されるpH感受性蛍光色素である25ミリモルHPTSの125マイクロリットルを加えます。250ミリモルOGP界面活性剤の137.5マイクロリットルを追加します。渦を使用して混合した後、すべての脂質が界面活性剤ミセルに可溶化されていることを確認するために10分間超音波水浴中の混合物を超音波処理します。

その後、分散液を1.5ミリリットルのプラスチックチューブに移します。必要量のシトクロムBO3を加え、超純水を加え、合計容量を50マイクロリットルにします。ローラーミキサーで10分間摂氏4度で再構成混合物をインキュベートします。

次に、2つの1.5ミリリットルチューブキャップのそれぞれにポリスチレンマイクロビーズの50ミリグラムを量る。その後、別の2つの1.5ミリリットルチューブキャップにポリスチレンマイクロビーズの100ミリグラムを重量を量る。パラフィンフィルムでキャップを閉じて乾燥を防ぎます。

1.5ミリリットルのプラスチックチューブにポリスチレンマイクロビーズをキャップに入れ、準備された分散液で、ポリスチレンマイクロビーズの最初の50ミリグラムを再構成混合物に加えます。その後、チューブの底にマイクロビーズをもたらすために数秒間短いスピンを実行します。ローラーミキサーでサスペンションを摂氏4度でインキュベートし、ポリスチレンマイクロビーズが界面活性剤を30分間吸収できるようにします。

以下のように、ポリスチレンマイクロビーズおよびインキュベーションの添加を繰り返します。60分間のマイクロビーズを50ミリグラム加えます。その後、インキュベーションの60分間マイクロビーズの100ミリグラムを追加します。

そして最後に、100ミリグラムのマイクロビーズを120分間のインキュベーションに加えます。薄い先端を持つマイクロピペットを使用して、ポリスチレンマイクロビーズからプロテオリポソーム溶液を分離します。TI 45超遠心チューブのMOPSバッファーの90ミリリットルで分散を希釈します。

125,000回Gでタイプ45 TIローターを用いた分散液を1時間用いて分散液を1時間ペレット化する。超遠心分離後、上清を捨て、ペレットを再懸濁することなくMOPSバッファーでペレットをすすいします。リンスバッファーを廃棄した後、1.5ミリリットルのプラスチックチューブに懸濁液を移す前に、薄いチップマイクロピペットで前後にピペット化して、500マイクロリットルのMOPSバッファーでプロテオリポソームを再中断します。

12,000回Gで5分間遠心分離して破片を除去し、再構成したプロテオリポソームである上清を新しいバイアルに移す。2成分の低蛍光エポキシを使用して、蒸発した金の表面に9つのガラスカバースリップまで接着します。80°Cで4時間硬化させます。

自己組み立てモノ層で修正する直前に、ガラスカバースリップをシリコンウェーハからブレードで取り外します。カバースリップの薄さのために、カバースリップを取り外すときは、ガラスのスライドを割ったり壊したりしないように注意してください。切り離したばかりの金色コーティングされたカバースリップを6-marcaptohexanol溶液に浸し、一晩で20〜25度で放置し、自己組み立てられたモノレイヤーを形成します。

翌日、溶液から金でコーティングされたカバースリップを取り除き、水またはメタノールで短時間洗浄し、イソプロパノールで洗浄します。軽いガスの流れの下で金で塗られたカバースリップを乾かしなさい。テキストプロトコルで図解されているように分光電気化学セルに金でコーティングされたカバースリップを組み立てます。

ゴム製のOリングで定義された領域の外側に平らなワイヤーで金に接触し、その上の電気化学セルをしっかりとねじ込みます。電解質緩衝液を2ミリリットル加え、セル内に参照電極と補助電極を入れます。自己組み立てモノレイヤーの品質を確認し、テキストプロトコルで説明されているようにブランクを実行します。

電気化学細胞にプロポリアソームを1ミリリットルの最終脂質濃度あたり0.5ミリグラムで加え、ピペットとわずかに混ぜます。電極表面上のプロテオリポソームの吸収が終了するまで、室温で30〜60分待ちます。バッファー溶液を少なくとも10回変更してセルを洗浄しますが、電極表面を完全に乾燥させたままにしないでください。

さて、開いたセル電位で電気化学的インピーダンス分光法を実行し、金電極上の自己組み立て単層が変わらないのを確認します。スキャンレート10および100ミリボルト/秒でサイクリックボルタンモグラムを実行し、電気化学的キノン還元の発症電位でシトクロムBO3によるカタラティックユビキノール酸化および酸素還元を観察する。以前のように金電極を変更しますが、ミリリットルプロテオリポソームあたり5マイクログラムを使用してください。

単一酵素研究では、シトクロムBO3対脂質比を0.1~0.2%に低下させ、浸漬油を滴下し、次いで電気化学細胞を逆蛍光顕微鏡の60倍の油目的に置きます。FDLL蛍光に適したフィルタを使用して、電極表面に焦点を当てます。単一のリポソームは、顕微鏡目的の回折限界で明るいスポットとして現れるべきである。

FDLL の蛍光のイメージを取ります。顕微鏡のHPTS蛍光フィルターセットの1つに切り替えて、HTPSの蛍光が明瞭に見え、背景から区別できることを確認します。光が当てられていない場合は、光強度を上げます。

2つのHTPSフィルタセットを交互に行って、時を取る画像取得を行うように顕微鏡ソフトウェアをプログラムする。これを行うには、1 秒間の露出を設定し、メニュー アプリケーションに移動します。次に、ND取得を定義/実行し、2つのHTPSチャンネルを選択します。

画像取得の遅延を最小に設定します。この実験では、0.3 秒の遅延と 5 分の合計持続時間を使用します。テキスト プロトコルで示されているように、ポテンショスタットの設定を調整して、画像取得中の可能性を変更します。

今度は、両方の測定を同時に手動で開始することにより、同時に顕微鏡上でタイミング画像取得を実行し、ポテンショスタット上で電位配列を実行する。ここに示されているのは、3つの異なるカバレッジで電極に吸収されたリポソームの蛍光画像です。リポソームを含む染料は、明るいスポットとして画像に表示されます。

画像の中央部分は、背景の花びらレベルを明らかにするために写真漂白されました。2つのHTPSチャンネルの画像は、この実験で使用される7.4のpHに対応する2つのチャンネル間の比率が超不可解である。より多くのリポソームは、HpTSをカプセル化していないリポソームの存在を示すFDLLチャネルで見える。

HPTS と FDLL チャネルの違いは、より高いカバレッジでより顕著です。おそらく、高リポソームカバレッジでは、リポソームが表面上で破裂または融合する可能性が高いためです。ここで、2つのHTPSチャネル上のリポソームの花相の変化は、実験の300秒の間に対応する領域の3D表面プロットとして示される。

還元電位は60秒から180秒の間に適用された。2つのHPTSチャンネル対時間のボリュームメトリック強度比の対応するプロットが示されています。ここに示されているのは、シトクロムBO3含有量が1.3%である場合の単一画像内のすべての小胞pH変化の中央値であり、0.1〜0.3ボルトの電位が適用されるとpHの増加がはっきりと見える。

シトクロムBO3含有量が0.1%のはるかに低い値である場合、中央値の曲線は空のリポソームのものとほとんど区別できなくなります。残差はプロトンへのリポソームの透過性を増加させる可能性があるため、リポソームディスペンスから界面活性剤を完全に除去することが重要です。これらの方法は、よく使用される水溶性キノン類似体とは対照的に、天然の親油性キノン基質に関する特定の質問をすることを可能にする。

さらに、単一酵素実験では、プロトンが自由に後方に流れる陽子チャネルとしてタンパク質が作用する未知のリーク状態を同定した。