Name: 電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学ぼう、電気化学と蛍光顕微鏡を組み合わせた単一リポソーム測定法で、細胞色素bo3のプロトン輸送メカニズムをリアルタイムに解析する手法。この方法は膜酵素の機能解明に有用である。

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著者は、BBSRC (BB/P005454/1) の金融支援を認めます。NH は、VILLUM 財団若手研究者プログラムによって資金を供給されました。

<ol><li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Biomolecule+Kinetics%3A+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li>
<li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224(2014).</li>
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<li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li>
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<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+Not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
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<li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Protein+Structure+and+Molecular+Enzymology%22%5BJournal%5D)">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li>
<li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li>
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<li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li>
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<li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Time-resolved+fluorescence+microscopic+data+%28traces%29+of+individual+lipid+vesicles+with+proton+transport+activity%22">Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity</a>. , (2017).</li>
<li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+of+protons%2C+potassium+ions%2C+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li>
<li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria%29+inner+membrane+phospholipids%3A+No+effect+of+fatty+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li>
<li>Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li>
<li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li>
<li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li>
</ol>

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記載されているメソッドは、プロトン ポンプ リポソームに再構成することができます呼吸膜タンパク質の研究に適してキノン プールと電子を交換することができます。プロトン ポンプ機能は、pH に敏感な (レシオ) 染料リポソーム ルーメン (図 1 a) でカプセル化を使用して単一酵素レベルで監視できます。
メソッドは、サム18電極と電子を交換する脂質二重膜に組み込まれて、ユビキノン (または他のキノン) の能力に依存します。SAM 修飾金電極のプロパティは非常に固有です。リポソームは、吸着、サムと SAM に痩せて急速な酸化とリポソームのキノン プールの縮小を有効にする必要がありますする必要があります。重要なは、電極とリポソームとの相互作用は脂質の膜の整合性を損なわない十分に弱い必要があります。さらに、実験システムの詳細に応じていることが望ましい酸素還元などの側の金触媒反応に SAM の防ぐことができます。最後に、SAM を使用する潜在的なウィンドウ内で安定している必要があります...

酵素機構と反応速度論については、測定値が統計平均を表す酵素分子の数百万人に何千人もの人口を持つアンサンブルまたはマクロ レベルで通常取得されます。それは、ただし、酵素など複雑な高分子の行動における不均一性を発揮、アンサンブルのレベルで観察される分子メカニズムが必ずしも当てはまらないすべての分子のために知られています。最後の二十年の1中に新興の方法の様々 な個々 の分子スケールのような逸脱が広く単一酵素の研究によって確認されました。特に、個々 の酵素活動を蛍光検出は、酵素活動2,3の不均一性を調査したり、いわゆるメモリー効果 (低の期間によって成功した高い酵素活性の期間を発見に使用されています活動と逆)4,5。
多くの単一の酵素の研究は、酵素表面または空間的固定連続観測の視野で十分な長さのままに別の方法でに固定されている必要があります。酵素カプセル化リポソーム表面酵素または蛋白質蛋白質の相互作用の6,7による悪影響を防止しながら酵素固定化を有効にするのに示されています。また、リポソームは、その天然の脂質二分子膜環境の8,9,10で単一膜蛋白質を研究するユニークな可能性を提供しています。
膜タンパク質、トランスポーター、クラス蛋白質は脂質二重膜 (例えばリポソーム)11に再構成されたときにだけ勉強することができます動作、セル膜を渡る物質の方向転流を練習します。 12,13。たとえば、プロトン透過経路、原核生物と真核生物の電子輸送鎖のいくつかの酵素によって展示は ATP 合成に使用されるプロトン動機力を作成することによって細胞呼吸において重要な役割を果たしています。この場合、多くの場合このプロセスの詳細なメカニズムは、とらえどころのないままがプロトン ポンプ機能は電子伝達と結合されます。
最近では、プロトン ポンプの大腸菌(シトクロムbo3) ターミナル ユビキノール酸化酵素の単一の酵素の活性を研究する電気化学とカップル蛍光検出する可能性を示した14リポソームに再構成しました。これEからリポソームの内腔 pH 感応膜不浸透性蛍光色素のカプセル化によって達成されました。大腸菌極性脂質 (図 1 a)。タンパク質の量は、ほとんどリポソームは (ポアソン分布) によるとないまたは 1 つだけ溶解酵素の分子をも含んだに最適化されていました。シトクロムbo3の 2 枚の基板は、ユビキノンをソリューションでリポソームと (アンビエント) 酸素を形成脂質ミックスに追加することによって提供されました。リポソームは半透明な超滑らかな金電極、6 mercaptohexanol の自己組織化膜で覆われているまばら吸着します。最後に、電極は簡単な分光電気化学セル (図 1 b) の下部にマウントされています。キノン プールの酸化還元状態の電気化学的制御により、柔軟にトリガーしたり、または pH 感受性色素によってプロトン透過の結果としてリポソームのルーメン内の pH の変化を監視するために使用中にいつでもでも酵素反応を停止する 1 つ、酵素。使用して 2 番目、脂質バインド蛍光染料、サイズおよび個々 のリポソームのボリュームの蛍光強度を決定することができます、このように酵素のプロトン ポンプ機能の定量化。この手法を使用すると、特にわかったシトクロムbo3分子がプロトン動機力をすばやく消える自然リーク状態に入ることができます。この記事の目的は、詳細に単一リポソーム測定の手法を紹介します。

<table><tbody><tr><td>6-メルカプト-1-ヘキサノール (6MH)</td><td>シグマ</td><td>451088</td><td>97%</td></tr><tr><td>8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸 (HPTS)</td><td>BioChemika</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>アルミホルダー (電気化学セル)</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>30x30x7 mm; 内径 26 mm; 穴径 15 mm</td></tr><tr><td>補助電極</td><td></td><td></td><td>プラチナ線</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR化学薬品</td><td>83627</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌極性脂質</td><td>Avanti</td><td>100600C</td><td>25 mg/mL クロロホルム</td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>EPO-TEK</td><td>301-2FL</td><td>低蛍光エポキシ</td></tr><tr><td>フィジー (ImageJ 1.52d)</td><td></td><td></td><td>必要なプラグイン: StackReg および TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td></tr><tr><td>フィルターキューブ (「ATTO633」)</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>例:620/60 nm;DM:660 nm;Em:700/75 nm</td></tr><tr><td>フィルターキューブ(「HPTS1」)</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>例:470/20 nm;DM:500 nm;Em:535/48 nm</td></tr><tr><td>フィルターキューブ(「HPTS2」)</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>例:410/300 nm;DM:500 nm;Em:535/48 nm</td></tr><tr><td>フィルターキューブ(「テキサスレッド」)</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>例:560/55 nm;DM:595 nm;Em:645/75 nm</td></tr><tr><td>蛍光色素標識脂質(FDLL)</td>この研究では、<td>ThermoFisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td>TexasRed-DHPC(&λ;EXC 595 nm;&ラムダ;em 615 nm)</td></tr><tr><td>蛍光色素標識脂質 (FDLL) (代替)</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 633-161</td><td>ATTO633-DOPE を代替 (& ラムダ;EXC 630 nm;&ラムダ;em 651 nm)</td></tr><tr><td>ゲルろ過カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-33</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg、追加のタンパク質精製用</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>VWR International</td><td>631-0172</td><td>No 1.5</td></tr><tr><td>ガラスシリンジ</td><td>Hamilton</td><td>1725 RNR</td><td>250 &micro;L</td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td><td>T101/V1</td><td>容量 1.75 mL</td></tr><tr><td>Gold</td><td>GoodFellow</td><td></td><td>99.99%</td></tr><tr><td>グラミシン</td><td>Σ</td><td>G5002</td><td></td></tr><tr><td>硫酸水銀 参照電極</td><td>放射計 (ハッシュ)</td><td>E21M012</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>Minispin NL040</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプスTi</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>Andor</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ランプニ</td><td>コン</td><td>Intensilight C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.0.2</td>ニ<td>コン</td><td></td><td>顕微鏡取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>n-Octyl &beta;-D-glucopyranoside</td><td>メルフォード研究所</td><td>B2007</td><td></td></tr><tr><td>Nova 1.10</td><td>Metrohm</td><td></td><td>ポテンショスタット制御ソフトウェア</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; 60x/1.4 oil</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2017</td><td>OriginLab</td><td></td><td>プロットソフトウェア</td></tr><tr><td>Oリング(電気化学セル)</td><td>Orinoko</td><td></td><td>内径:16 mm; 断面積:1.5 mm</td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>ポリスチレンマイクロビーズ</td><td>Bio-RAD</td><td>152-3920</td><td>Biobeads, 20-50 mesh</td></tr><tr><td>ポテンショスタット</td><td>メトローム Autolab</td><td>PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>ポテンショスタット</td><td>CH 機器</td><td>CHI604C</td><td></td></tr><tr><td>スクリプティングソフトウェア</td><td>Matlab</td><td>R2017a</td><td>必要なツールボックス: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox','Optimization Toolbox'Silicon</td></tr> <tr><td>wafers</td><td>IDB Technologies Ltd</td><td>Si-C2 (N<100>P)</td><td>&Oslash; 25 mm、525 um厚</td></tr><tr><td>テフロンセル(電気化学セル)</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>外径:26 mm; 内径:13.5 mm</td></tr><tr><td>テンプルストリップ超フラットゴールド表面</td><td>Platypus Technologies</td><td>AU.1000.SWTSG</td><td>すぐに使える超フラットゴールド表面(厚さ100nm以下オンデマンド)</td></tr><tr><td>薄いマイクロピペットチップ</td><td>Sarstedt</td><td>70.1190.100</td><td>または同様のゲルローダーチップ200&micro;L</td></tr><tr><td>ユビキノン-10</td><td>シグマ</td><td>C-9538</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>L-80XP</td><td>Ti 45 ローター付き</td></tr><tr><td>超音波浴</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>FB15063</td><td></td></tr></tbody></table>

電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

電子のプロトン ポンプの酵素は ATP の生産に使用されるプロトン動機力を作成する、膜プロトン透過経路にチェーン カップル酸化還元反応を転送します。両親媒性膜タンパク質性の取り扱いには特に注意が必要ですし、プロトン透過経路のような膜輸送プロセスを勉強するとき、天然脂質環境に再構築は不可欠であります。ここで、例として大腸菌由来シトクロムbo3を取って膜酸化還元酵素のプロトン ポンプ機構の調査のために使用されている方法は詳細します。内腔のキノン プールとモニターの pH 変化の酸化還元状態を制御するは、電気化学および蛍光顕微鏡に組み合わせてです。酵素のコンテンツは、単一の酵素やトランスポーター リポソームあたりにスケール ダウンすることができますしながら蛍光顕微鏡の空間分解能によるリポソームの何百も同時に測定できます。それぞれ単一の酵素分析は、それ以外の場合全体の人口の行動によって隠されるかもしれない酵素機能動態のパターンを明らかにできます。我々 は、自動画像解析用スクリプトの説明を含めます。

6MH のサムと金変更カバー スリップ (電極) の品質は、電気化学インピー ダンス分光法による各実験の前にチェックされます。図 2 aは、リポソームが吸着した前後に電気化学インピー ダンス分光法を用いて代表的なコール ・ コール プロットを示しています。サムの品質で十分な場合、インピー ダンス分光法は半円形のコール ・ コール プロットの結果ほぼ純粋な容量性動作を示す必要があります。コール ・ コール プロットで半円の直径 2.5 3.0 μ F/cm2の範囲にあるべき電極表面の二重層容量に等しくなります。容量変更しないでください大幅リポソーム吸着容量のわずかな増加が注意した (高リポソーム カバレッジ、図 2 a下) または低インピー ダンスでのわずかなシフトを観測できます。周波数 (低リポソーム カバレッジ、図 2 a上)。
<p class="jove_co...

ここでは、プロトコルを提案単一リポソームの脂質膜を渡るプロトン透過の分子機構の研究例としてシトクロムbo3を使用します。電気化学、蛍光顕微鏡、単一小胞、含む単一または複数の酵素のルーメン内の pH の変化を組み合わせることを検出および分析できる個別に。

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

この方法により、天然脂質二層環境におけるシトクロムBO3のような気体膜酵素のプロトン輸送活性の研究が可能となる。この単一酵素技術の主な利点は、電気化学を使用していつでも酵素反応を開始および停止する可能性です。ガラス注射器を使用して、5ミリグラムのアリコートを作るために、大腸菌からガラスバイアルに脂質極性エキスのクロロホルムストックの200マイクロリットルを転送します。1ミリグラムの50マイクロリットルを1ミリグラムのユビキノン10を脂質に加えて、1〜100ユビキノン10の脂質の最終的な比率を作る。混合物に、脂質略記されたFDLLを標識した長波長さ1ミリグラムの20マイクログラムの蛍光色素を加える。クロロホルム溶液を短い渦で均質化し、穏やかな窒素またはアルゴン流の下でクロロホルムの大部分を蒸発させます。少なくとも1時間真空下でさらに蒸発することによってクロロホルムの痕跡を完全に取り除きます。ユビキノン10 FDLLドライミックスの1アリコートに40ミリモルMOPS pH 7.4バッファーの312.5マイクロリットルを追加します。脂質膜が完全に再懸濁されるまで渦を混ぜ、超音波浴で2分間の処理を行う。次に、リポソームの内部にカプセル化されるpH感受性蛍光色素である25ミリモルHPTSの125マイクロリットルを加えます。250ミリモルOGP界面活性剤の137.5マイクロリットルを追加します。渦を使用して混合した後、すべての脂質が界面活性剤ミセルに可溶化されていることを確認するために10分間超音波水浴中の混合物を超音波処理します。その後、分散液を1.5ミリリットルのプラスチックチューブに移します。必要量のシトクロムBO3を加え、超純水を加え、合計容量を50マイクロリットルにします。ローラーミキサーで10分間摂氏4度で再構成混合物をインキュベートします。次に、2つの1.5ミリリットルチューブキャップのそれぞれにポリスチレンマイクロビーズの50ミリグラムを量る。その後、別の2つの1.5ミリリットルチューブキャップにポリスチレンマイクロビーズの100ミリグラムを重量を量る。パラフィンフィルムでキャップを閉じて乾燥を防ぎます。1.5ミリリットルのプラスチックチューブにポリスチレンマイクロビーズをキャップに入れ、準備された分散液で、ポリスチレンマイクロビーズの最初の50ミリグラムを再構成混合物に加えます。その後、チューブの底にマイクロビーズをもたらすために数秒間短いスピンを実行します。ローラーミキサーでサスペンションを摂氏4度でインキュベートし、ポリスチレンマイクロビーズが界面活性剤を30分間吸収できるようにします。以下のように、ポリスチレンマイクロビーズおよびインキュベーションの添加を繰り返します。60分間のマイクロビーズを50ミリグラム加えます。その後、インキュベーションの60分間マイクロビーズの100ミリグラムを追加します。そして最後に、100ミリグラムのマイクロビーズを120分間のインキュベーションに加えます。薄い先端を持つマイクロピペットを使用して、ポリスチレンマイクロビーズからプロテオリポソーム溶液を分離します。TI 45超遠心チューブのMOPSバッファーの90ミリリットルで分散を希釈します。125,000回Gでタイプ45 TIローターを用いた分散液を1時間用いて分散液を1時間ペレット化する。超遠心分離後、上清を捨て、ペレットを再懸濁することなくMOPSバッファーでペレットをすすいします。リンスバッファーを廃棄した後、1.5ミリリットルのプラスチックチューブに懸濁液を移す前に、薄いチップマイクロピペットで前後にピペット化して、500マイクロリットルのMOPSバッファーでプロテオリポソームを再中断します。12,000回Gで5分間遠心分離して破片を除去し、再構成したプロテオリポソームである上清を新しいバイアルに移す。2成分の低蛍光エポキシを使用して、蒸発した金の表面に9つのガラスカバースリップまで接着します。80°Cで4時間硬化させます。自己組み立てモノ層で修正する直前に、ガラスカバースリップをシリコンウェーハからブレードで取り外します。カバースリップの薄さのために、カバースリップを取り外すときは、ガラスのスライドを割ったり壊したりしないように注意してください。切り離したばかりの金色コーティングされたカバースリップを6-marcaptohexanol溶液に浸し、一晩で20〜25度で放置し、自己組み立てられたモノレイヤーを形成します。翌日、溶液から金でコーティングされたカバースリップを取り除き、水またはメタノールで短時間洗浄し、イソプロパノールで洗浄します。軽いガスの流れの下で金で塗られたカバースリップを乾かしなさい。テキストプロトコルで図解されているように分光電気化学セルに金でコーティングされたカバースリップを組み立てます。ゴム製のOリングで定義された領域の外側に平らなワイヤーで金に接触し、その上の電気化学セルをしっかりとねじ込みます。電解質緩衝液を2ミリリットル加え、セル内に参照電極と補助電極を入れます。自己組み立てモノレイヤーの品質を確認し、テキストプロトコルで説明されているようにブランクを実行します。電気化学細胞にプロポリアソームを1ミリリットルの最終脂質濃度あたり0.5ミリグラムで加え、ピペットとわずかに混ぜます。電極表面上のプロテオリポソームの吸収が終了するまで、室温で30〜60分待ちます。バッファー溶液を少なくとも10回変更してセルを洗浄しますが、電極表面を完全に乾燥させたままにしないでください。さて、開いたセル電位で電気化学的インピーダンス分光法を実行し、金電極上の自己組み立て単層が変わらないのを確認します。スキャンレート10および100ミリボルト/秒でサイクリックボルタンモグラムを実行し、電気化学的キノン還元の発症電位でシトクロムBO3によるカタラティックユビキノール酸化および酸素還元を観察する。以前のように金電極を変更しますが、ミリリットルプロテオリポソームあたり5マイクログラムを使用してください。単一酵素研究では、シトクロムBO3対脂質比を0.1~0.2%に低下させ、浸漬油を滴下し、次いで電気化学細胞を逆蛍光顕微鏡の60倍の油目的に置きます。FDLL蛍光に適したフィルタを使用して、電極表面に焦点を当てます。単一のリポソームは、顕微鏡目的の回折限界で明るいスポットとして現れるべきである。FDLL の蛍光のイメージを取ります。顕微鏡のHPTS蛍光フィルターセットの1つに切り替えて、HTPSの蛍光が明瞭に見え、背景から区別できることを確認します。光が当てられていない場合は、光強度を上げます。2つのHTPSフィルタセットを交互に行って、時を取る画像取得を行うように顕微鏡ソフトウェアをプログラムする。これを行うには、1 秒間の露出を設定し、メニュー アプリケーションに移動します。次に、ND取得を定義/実行し、2つのHTPSチャンネルを選択します。画像取得の遅延を最小に設定します。この実験では、0.3 秒の遅延と 5 分の合計持続時間を使用します。テキスト プロトコルで示されているように、ポテンショスタットの設定を調整して、画像取得中の可能性を変更します。今度は、両方の測定を同時に手動で開始することにより、同時に顕微鏡上でタイミング画像取得を実行し、ポテンショスタット上で電位配列を実行する。ここに示されているのは、3つの異なるカバレッジで電極に吸収されたリポソームの蛍光画像です。リポソームを含む染料は、明るいスポットとして画像に表示されます。画像の中央部分は、背景の花びらレベルを明らかにするために写真漂白されました。2つのHTPSチャンネルの画像は、この実験で使用される7.4のpHに対応する2つのチャンネル間の比率が超不可解である。より多くのリポソームは、HpTSをカプセル化していないリポソームの存在を示すFDLLチャネルで見える。HPTS と FDLL チャネルの違いは、より高いカバレッジでより顕著です。おそらく、高リポソームカバレッジでは、リポソームが表面上で破裂または融合する可能性が高いためです。ここで、2つのHTPSチャネル上のリポソームの花相の変化は、実験の300秒の間に対応する領域の3D表面プロットとして示される。還元電位は60秒から180秒の間に適用された。2つのHPTSチャンネル対時間のボリュームメトリック強度比の対応するプロットが示されています。ここに示されているのは、シトクロムBO3含有量が1.3%である場合の単一画像内のすべての小胞pH変化の中央値であり、0.1〜0.3ボルトの電位が適用されるとpHの増加がはっきりと見える。シトクロムBO3含有量が0.1%のはるかに低い値である場合、中央値の曲線は空のリポソームのものとほとんど区別できなくなります。残差はプロトンへのリポソームの透過性を増加させる可能性があるため、リポソームディスペンスから界面活性剤を完全に除去することが重要です。これらの方法は、よく使用される水溶性キノン類似体とは対照的に、天然の親油性キノン基質に関する特定の質問をすることを可能にする。さらに、単一酵素実験では、プロトンが自由に後方に流れる陽子チャネルとしてタンパク質が作用する未知のリーク状態を同定した。

single-liposome-measurements-for-study-proton-pumping-membrane

Research

JoVE Journal

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電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトンポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

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電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

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