Name: 内大網膵島移植を用いた h 大網マトリックス アイレット充填 (ホーミング) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学ぶ、hOMING法による内大網膵島移植の最適化手法。ラットを用いた細胞治療の生体内検証プロトコルで、水素ゲル担体と血管近傍への移植により膵島の血管新生と血糖コントロールを改善する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、アルザス地方、BioArtMAtrix 極アルザス バイオバレー-CQDM; によって賄われていた53/14/C1。著者は、この革新的な技術の開発を助けるため Hôpitaux Universitaires de ストラスブールからの広報ブリュアン付近ロディエのチームに感謝しています。

すべての動物実験の承認番号を使用、健康の国民の協会のガイドラインに従って行われた: AL/60/67/02/13。
1. 受信者の準備
<ol><li>
化学的に受信者のラットの糖尿病を誘発します。
	<ol>
<li>75 mg/kg 腹腔内をラット10ストレプトゾトシン (STZ、滅菌 0.1 M クエン酸バッファー、pH 4 で) を挿入します。 注:移植研究 6 週齢ルイス ・ ラット、体重 150 190 g 使用しました。</li>
		<li>最初の 4 日間、毎日血液グルコース測定による糖尿病の状態を確認します。長時間作用型インスリン 6 を注入 U/日皮下ラットが糖尿病合併症を防ぐために、減量、インスリン ペレット移植まで 2 g/L 以上血糖を示すとき。</li>
		<li>尾静脈血中グルコースの 2 つの措置は、ラットにコホートは、&gt; 2 日間連続の C ペプチド レベル 4-5 g/L は &lt; 200 pM。酵素免疫測定法 (ELISA) による glucometer と C peptidemia を使用して血糖を測定します。</li>
		<li>インプラントの皮の下でインスリン ペレット (1.2 を参照してください)。 注:慢性的なインスリン療法より良い血糖規制を可能にし (これは移植サイトで酸化ストレスを悪化させる) 糖尿病合併症を回避できます11。さらに、治療は糖尿病動物にみられる通常の減量) を除いた正常な成長曲線と一緒に糖尿病状態を節約できます。これは、移植を実施するために理想的ですの大きい大網脂肪パッドにつながります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
インスリン ペレットの注入
	<ol>
<li>ガス麻酔 (500 mL/分 O2におけるイソフルラン 3%) を使用してラットを麻酔し、腹臥位でラットを配置します。</li>
		<li>(足をつまんで) 反射の有無をチェックすることによって麻酔の状態を確認します。ポビドン ヨードを使用して首をきれいにし、かみそりの刃を使用して領域を剃る。ポビドン ヨードを再び適用する、3 分間放置します。</li>
		<li>場所 1.5 インスリン ペレット (3 単位 (U)/200 g のラット) ペレットを滅菌する 1:5 希釈したポビドン ヨード液に。16 G トロカールを使用して首の皮膚に穴を開ける、家具ガイドとスタイレットを使用してペレットを挿入します。ガイドやスタイレットを取得し、単一ポイントをステッチします。ステッチをきれいにポビドン ヨードを使用します。 注:手術後の痛みの管理は介入が単一の皮下 (SC) に匹敵するほど必要ありませんでした。</li>
		<li>ラットの麻酔から回復し、ラットが低血糖を避けるために食糧へのアクセスを持っているを確認をしましょう。</li>
		<li>注入後がグルコ メーターの減少を測定することによりペレットの効率を測定します。</li>
		<li>1 ヶ月間毎週の血糖レベルを監視することによって餌効率を確認してください。</li>
		<li>尾静脈血中 C ペプチド濃度の測定が 200 未満に維持されるとき、コホートにおけるラットを含む午後インスリン ペレット移植後 1 ヶ月。 注:C ペプチド レベルをチェックは移植前にベースラインで動物を評価して、糖尿病の状態を確認するために必須です。低 C ペプチドの再生常に経過観察中に発生します。最低の C peptidemia は最低の再生を表しています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ホーミング: 内大網マトリックス アイレット充填
<ol><li>
アイレット マトリックス混合物の準備。
	<ol>
<li>層流フードの粘性アイレット キャリアを準備します。1.5% の濃度で滅菌 PBS でアルギン酸粉を溶解します。0.22 μ m のフィルターを通して、通路で準備を滅菌します。受信者ごとの 400 μ L を準備します。 注:21 G 注射針での注入に適した粘度のゲルの任意の種類を使用できます。</li>
		<li>上記12として健全なルイス ・ ラット (200-250 g) から膵島を分離します。</li>
		<li>小島小島同等物 (IEQ) (IEQ は、150 μ m の直径を持つ膵島と同等とされるもの) の数をカウント13。</li>
		<li>層流フードの場合は、1.5 mL チューブの 7660 膵島と同等 (IEQ) の因数を準備します。</li>
		<li>牛胎児血清の無料 CMRL (コンノート医学研究所) 中の 500 μ L で小島因数を洗います。</li>
		<li>遠心分離 (500 x gと 4 ° C で 2 分) によって島をペレットします。上清を捨てます。</li>
		<li>小島をアルギン酸ヒドロゲル キャリアの 150 μ L を追加、上下にピペッティングして慎重に混ぜるし、氷のミックスを場所します。</li>
		<li>注射器に空のアルギン酸の 150 μ L をロードすることによって、非外科的 21 G 針とデッド ボリュームなし 1 mL 注射器を準備します。</li>
		<li>小島とアルギン酸 (150 μ L、総量 300 μ L) の混合物で注射器を満たしなさい。氷の上の注射器を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
手術の手順
	<ol>
<li>手術器具の低温殺菌を消毒 (2 分の Steranios)。</li>
		<li>イソフルラン麻酔を用いたラットを麻酔し、腹臥位でラットを配置します。</li>
		<li>かみそりの刃を使用して頸部を剃るし、ポビドン ヨードを使用して領域を消毒します。ヨウ素 3 分立ってみましょう。</li>
		<li>メスを使って切開、鉗子を用いた 1.5 インスリン ペレットを外します。1 つまたは 2 つの単一ステッチ ポイントを使用して皮膚を閉じます。麻酔からラットを削除しないでください。 注:1 ヶ月後、ペレットができます砕けやすいペレット; として折り返すことができるいくつかの線維組織正常解剖はさみを使用します。</li>
		<li>ラットを仰臥位で配置します。剃るし、腹膜領域 (ポビドン ヨード) の消毒します。ヨウ素 3 分立ってみましょう。</li>
		<li>メスを使用して胸骨のすぐ下 1.5 cm 開腹を作成します。切開周辺濡れた滅菌ガーゼを配置します。</li>
		<li>胃の横にあるローカライズされた脂肪のパッドは、大網を識別します。鉗子を使って慎重に大網をキャッチ、腹腔内からゆっくり引き抜きます、ガーゼの上に 。 注:大網の組織は脾臓から十二指腸までし、その中間時点で胃にアタッチします。インスリン療法を受けて糖尿病ラットの通常大網はガーゼに広がるとき約 2 cm ² です。</li>
		<li>37 ° C に予め温めておいた滅菌生理食塩水 2 mL を使用して大網組織をメタンハイド レートします。小さなカーブタイプ鉗子を使用して、組織を操作し、大網の層間針大網のエッジを浸透します。完全に針を挿入します。</li>
		<li>膵島準備の注射をゆっくりと開始し、慎重に後方 (行) としていくつかの場所で小島を注入する針を移動します。針を撤回する前に分散した小島の損失を防ぐために針を終了、ハイドロゲルが停止したことを確認します。</li>
		<li>大網の組織全体にわたって島を配布する別のエントリ ポイントを使用して注射器の内容全体を注入する必要に応じてこの操作を繰り返します。 注:ラットでは, 4 〜 5 注射が一般的に必要です。</li>
		<li>小島は、注射の最後に注射器でクラスター化されていないを確認します。 注:いくつかの小島がまだ表示されている場合、注射器から針を撤回、空ハイドロゲルの 100 μ L を直接注射器を埋めるし、針を再接続することが可能です。残りの島をフラッシュする注入の第 2 ラウンドを行うことができます。</li>
		<li>大網の組織と術中の壁に再び滅菌生理食塩水を使用します。鉗子を使用すると、腹腔内で大網に慎重に取り付けます。</li>
		<li>ラットを水分補給を腹腔内にあらかじめ加温滅菌生理食塩水 2 mL を注入します。</li>
		<li>連続糸の縫合糸を使用して筋肉壁を閉じます。1 つのステッチのポイント (ポイント) と皮膚の層を縫います。</li>
		<li>5 日間 1 日 1 回、鎮痛剤として皮下メロキシカム (1.5 mg/kg) を挿入します。</li>
		<li>麻酔から回復まで加熱パッドのケージにラットを配置します。すべての受信者のラットの手順を繰り返します。</li>
		<li>毎日移植後血糖値を測定します。血糖がある場合 &gt; 2 g/L、注入 6 U 長時間作用型インスリンの皮下 1 日 1 回。</li>
		<li>血糖と c peptidemia 監視以上の 1、2 カ月で移植機能を評価します。 注:巧妙な移植の場合、移植後 2-5 日以内血糖が安定するはずし、ラットがインスリンを取り出すことができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 大網移植植
注:この手順は、良い移植機能確認が許可されます。機能の移植の取得後、ラット糖尿病状態に戻ります。この手順を実行して、代謝のフォロー アップの 1 または 2 ヶ月後。
<ol><li>ガス麻酔ラットを麻酔し、仰臥位でそれを配置します。</li>
	<li>腹膜領域を剃るし、3 分のポビドン ヨードを使用してそれを殺菌します。</li>
	<li>メスを使用して胸骨のすぐ下 1.5 cm 開腹を作成します。切開周辺すべてウェット滅菌ガーゼを配置します。</li>
	<li>胃の横にある大網を識別します。鉗子を使用して、慎重に、ガーゼの上に 。</li>
	<li>はさみを使用して、大網を切除します。(脾臓) の横にある膵臓尾部に付着した部分から開始します。出血が発生した場合は、それを停止する乾燥滅菌ガーゼを使用します。</li>
	<li>胃に接続されている部分に沿って切除を続行し、大網を取得します。 注:この場所に胃大網動脈 (図 1) が誤ってを切る場合を出血多量を引き起こします。動脈切開が接木を取得するために避けられないが、出血はガーゼの鉗子を使用して管理することができます。偶発的なカットが発生した場合は、乾いたガーゼでしっかりと圧縮し、少なくとも 1 分の圧縮を維持します。出血を停止する必要があります。そうでない場合は、クリップを使用してまたは血管を焼灼する電気柳葉を使用します。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig1.jpg"> 図 1: 大網動脈分布。大網移植植、胃大網動脈から成る重要な領域は青で表されます。大網の組織のこの部分の切除時に注意が右胃大網動脈セクションに支払われる必要があります。圧縮、合字、または熱傷は、出血を制限する使用できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="7"><li>すべての出血が続く場合はチェック。そうでない場合は、予め温めておいた生理食塩水 2 mL を注入、ネズミを閉じる、前述として処理します。  Explanted 動物は、糖尿病の状態に戻ります。インスリン注射 (6 U/SC/日)、動物の福祉を確保するために必須になります。</li>
	<li>ペントバルビ タール (182.2 mg/kg) の過剰摂取を使用して植後 10 〜 12 日間ラットを安楽死させます。</li>
</ol>4. 組織学的解析: ヘマトキシリン ・ エオシン染色
<ol><li>4% パラホルムアルデヒド (PFA) を使用して取得した omenta を修正し、パラフィンに埋め込みます。</li>
	<li>厚さのセクション 4 μ m をカットし、移植の形態学的評価のヘマトキシリンとエオシン染色を適用します。</li>
</ol>5. 統計解析
<ol><li>統計解析ソフトウェアと反復測定分散分析 (ANOVA) をテューキー正直意義の違いテストと事後テストとして使用して統計的有意性を決定します。としてp値を表す: *p &lt; 0.05;p &lt; 0.01;p &lt; 0.001。</li>
</ol>

<ol><li>Bakhshandeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3B+strategies%2C+tissues%2C+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+genetic+engineering+reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials.</a> Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li>
<li>Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in regenerative medicine.</a> Adv Mater. , 3307-3329 (2009).</li>
<li>Rice, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+regenerative+microenvironment+with+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+healthcare+materials%22%5BJournal%5D)">Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials.</a> Advanced healthcare materials. 2, 57-71 (2013).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+hydrogels+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioactive hydrogels for bone regeneration.</a> Bioactive Materials. 3, 401-417 (2018).</li>
<li>Allbright, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+adipose-derived+stem+cells+in+poloxamer+hydrogel+improves+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Delivery of adipose-derived stem cells in poloxamer hydrogel improves peripheral nerve regeneration.</a> Muscle Nerve. , (2018).</li>
<li>Van Der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N. M., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Choice+of+Anatomical+Site+for+Islet+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">The Choice of Anatomical Site for Islet Transplantation.</a> Cell transplantation. 17, 1005-1014 (2008).</li>
<li>Zweifach, B. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+studies+of+microcirculatory+structure+and+function.+III.+Microvascular+hemodynamics+of+cat+mesentery+and+rabbit+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative studies of microcirculatory structure and function. III. Microvascular hemodynamics of cat mesentery and rabbit omentum.</a> Circ Res. 41, 380-390 (1977).</li>
<li>Bruant-Rodier, C., Dissaux, C., Baratte, A., Francois Fiquet, C., Bodin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+of+the+adolescent+girl%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Chir+Plast+Esthet%22%5BJournal%5D)">The breast of the adolescent girl.</a> Ann Chir Plast Esthet. 61, 629-639 (2016).</li>
<li>Schaschkow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-Hepatic+Islet+Transplantation%3A+Validation+of+the+h-Omental+Matrix+Islet+filliNG+%28hOMING%29+Technique+on+a+Rodent+Model+Using+an+Alginate+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Extra-Hepatic Islet Transplantation: Validation of the h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) Technique on a Rodent Model Using an Alginate Carrier.</a> Cell transplantation. 27, 1289-1293 (2018).</li>
<li>Schaschkow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+Type+of+Continuous+Insulin+Administration+on+Metabolism+in+a+Diabetic+Rat+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+diabetes+research%22%5BJournal%5D)">Impact of the Type of Continuous Insulin Administration on Metabolism in a Diabetic Rat Model.</a> Journal of diabetes research. 2016, 8310516(2016).</li>
<li>Schaschkow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+an+autologous+oxygenating+matrix+culture+system+on+rat+islet+transplantation+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Impact of an autologous oxygenating matrix culture system on rat islet transplantation outcome.</a> Biomaterials. 52, 180-188 (2015).</li>
<li>Kissler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methodologies+for+quantifying+isolated+human+islets%3A+an+Islet+Cell+Resources+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+transplantation%22%5BJournal%5D)">Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an Islet Cell Resources study.</a> Clinical transplantation. 24, 236-242 (2010).</li>
<li>Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+islet+transplantation%3A+the+impact+of+the+liver+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+international+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intraportal islet transplantation: the impact of the liver microenvironment.</a> Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 30, 227-238 (2017).</li>
<li>Leitao, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fat+accumulation+after+islet+transplantation+and+graft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Liver fat accumulation after islet transplantation and graft survival.</a> Cell transplantation. 23, 1221-1227 (2014).</li>
<li>Narang, A. S., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+biomaterial+approaches+for+improved+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Biological and biomaterial approaches for improved islet transplantation.</a> Pharmacological reviews. 58, 194-243 (2006).</li>
<li>Alvarado-Velez, M., Pai, S. B., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+carriers+for+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as carriers for stem cell transplantation.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 61, 1474-1481 (2014).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルには、いくつかの重要なステップを強調できます。最初に、それは壊れやすい、手術を実行して、組織を操作する人が脂肪質のティッシュで繊細な必要があります。破砕や大網の破損を回避する必要があります。大網、防御的な組織として、大食細胞および他の白血球に濃縮されています。これらの免疫細胞過剰操作によって実行される、移植に悪影響を及ぼす可能性があります。第二に、移植 (膵島ヒドロゲル混合物) の読み込みも重要です。手順を実行する人は、デッド ボリュームを避ける必要があり、噴射装置にハイドロゲル膵島の混合物のすべてを読み込む必要があります。この手順の直後に別の重要なポイントは、注射そのものです。注入は、ケアと繊細なゆっくりと実行する必要があります。注射器は、任意の残りの島を取得するために最初に読み込まれる空のハイドロゲルによるフラッシュしなければなりません。第三に、縫合を慎重に、そして 2 つの手順で行う必要があります。筋肉で大網を縫合しないように世話筋計画する必要があります最初に、縫合して皮膚は別々 に縫合する必要があります。大網移植植手続きとしては、特別な注意は、現時点では胃 (胃大網動脈) に近い動脈を切開するとき取られるべき。発生し、数日で動物の死に任意の持続的な出血のリードとして、動物を縫合する前にそれらを停止出血に注意を払うことが重要です。
トラブルシューティングが必要な媒体に関する運ぶためになる島;ヒドロゲルは注射がある限り、ハイドロゲルの選択は、実験者次第です。さまざまな材料の使い方が変数になる関数 (たとえば、補充の有無にかかわらず) を移植します。ここで説明する方法は、小島比 7660 IEQ/kg の不活性共同移植材料の効率を実証しています。
本法は、大網のサイズとヒドロゲルの物性によって制限があります。糖尿病性の齧歯動物モデルを使用するには、インスリン療法は十分な移植領域を提供する膵島移植前に必須です。糖尿病性の齧歯動物は、体重、STZ 誘発糖尿病による脂肪の多くを失います。本研究の動物の小さい重量を考慮してさらに小さい領域に移植は不可能です。
(移植ペレットを使用し、その後長時間作用型インスリンを使用して) 前に適切な血糖管理の保全は必須です。ここでは、我々 はいくつかの理由のための移植の日までインスリン ペレットを節約するために選んだ。まず、適切な血糖コントロールの維持がかなり糖尿病インスリン療法と受信者の継続ができ、膵島移植11有害することができます受信者の臓器によって誘発される酸化ストレスを軽減します。クリニック12の観察の準備。第二に、我々 はラットの麻酔手順の最大数を制限したかった。長時間作用型のインスリンを使用して代謝の経過観察中にインスリン療法の実施、に関して使用されるスキームは glucotoxicity (これは移植を破壊できる) ため、「本物の」血糖値を節約するために大規模な合併症を避けます。
グラフト効率を監視するには、血糖パラメーターではありません関連する最初の数日間のラットは、ペレットを用いたインスリン療法を受けている場合。だからこそ、移植する C-ペプチド レベル何回か前は必須チェックです。STZ 投与後動物を選択する、研究の始まりで、ちょうどラットまま糖尿病と再生が最小限であることを確保するため、移植の前にこれらの時間が含まれます。
ヒドロゲルの物性は、また重要です。液体ゲルが大網組織に漏れて、粘性の高いゲルは注射できません。ハイドロゲル粘度と injectability は、使用前にテストするがまた膵島の細胞生存率の in vitro 別評価による直接材料をテストするのには不可欠であります。ここでは、島は低酸素血症と高粘度のキャリアの使用に非常に敏感、酸素の拡散を及ぼします。
既存のメソッドここで説明する方法の重要性この内組織移植手法的には再現性の利点があります。それはまた、組織の非外科的、出血と血栓症のリスクを避けるためにその余分な血管の場所。また、膵島移植を検討するとき、インスタントの血液を介した炎症反応は回避14です。さらに、ホーミングは肝機能15面でのリスクが肝臓への移植とは異なり、非重要な臓器に膵島を移植できます。
最適なパフォーマンスを生産するには、ハイドロゲルがそれを運ぶ、細胞に適応します。成長因子や特定の蛋白質の使用は、移植細胞16,17に肯定的な効果を持つことができます。
最後に、小島は、アクティブな代謝環境が必要な場合に特に異なったセルタイプにハイドロゲルの生体内での検証のためこの手法を使用できます。また、この手技は複数のアプリケーションに適用されます、かもしれない、将来的に、それが簡単に行えます腹腔鏡を使用して、人間に急速に譲渡すること。

それは再生医療に基づく病気を治すことを目的として、細胞療法はホットな話題です。生物学的材料による細胞治療は、細胞の移植による多くの場合は、受信者に培養皿からセルを転送するためのキャリアを必要とするために特に近年、多く研究されています。生体材料足場は、いくつかのロール1を満たす可能性のある携帯電話事業者です。有能なキャリアは、機械的ストレスから細胞を保護し、成長の重要な要因、代謝廃棄物の排泄、栄養物質と酸素2の交換などの良好な生育条件を提供ください。
細胞療法に使用される生体材料の種類、ヒドロゲル多くの利点があります。生体適合性、生分解性、処理、および酸素の拡散3を容易にするために簡単です。さらに、現在の技術では、細胞の存続および成長因子や細胞外マトリックス蛋白質4補充などで接がを支援するヒドロゲルの使用ができます。
治療、幹細胞を含むハイドロゲル キャリアを注入できる例えば、骨の再生5と神経系疾患6。代謝活性の高い細胞の注入が必要です。アプローチの in vitro における検証が可能ですが、ツールや生体内での検証のテクニックは洗練されたままです。
細胞とゲル移植簡単に行えます皮下注入による生体適合性テストを実施します。ただし、移植細胞の代謝作用によって全身的要因を調節するためのものなとき、この皮下のローカライズが静脈還流7に関して本質的に最適。したがって、迅速に、安全に、かつ効率的にハイドロゲルの有益な効果を評価するための現在のツールはありません。ホルモンは、血糖値に応じてグラフト血流に解放されることを必要とする膵島移植の例に基づいて新しい体内細胞/ゲル注入法を開発しました。
最初のステップは、セルを持つハイドロゲルを受け入れることができる受容移植サイトを識別するためにだった。大網の大空間を提供しています, 移植は非常にプラスチック製や腹腔内の設定と組み合わせることの密な血管新生が8高い代謝活性を有する細胞の研究のための興味深い。次に、大網にセルとヒドロゲルへの転送を許可する手技を確立する必要があります。整形外科9で使用される lipofilling に触発され、(ホーミング) アプローチを充填 h 大網のマトリックスの膵島を開発しました。ハイドロゲルに埋め込まれた小島は、大網の組織内注入されます。テクニックも血管の多数はまた移植酸素を向上、大網の組織に細胞とゲル混合物の複数の証言を活用し、最大の生着を提供を目指します。
本研究では脂肪組織の血管に最も近い内部の大網シート間膵島移植へのシンプルかつ革新的な手法について述べる。これは腹腔鏡下完了でした、マイクロ侵襲外科の脂肪質のティッシュに、ゲルに含まれる島の注入で構成されます。この手法でテストする必要がありますすべてのハイドロゲルとセルの組み合わせによって、簡単に該当する、代謝機能を備えた環境で。

<table><tbody><tr><td>アルギン酸塩 (PRONOVA UP LMV)</td><td>novamatrix</td><td>4200206</td><td>ハイドロゲル担体</td></tr><tr><td>非外傷性針 (鈍器)</td><td>B.Braun</td><td>9180109</td><td></td></tr><tr><td>CMRL FBSなし</td><td>Gibco</td><td>11500576</td><td></td></tr><tr><td>C-peptide ELISAキット</td><td>Mercodia</td><td>10-1172-01</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801592E</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 4/0</td><td>Ethicon</td><td>F2414</td><td>外科用縫合</td></tr>糸 <tr><td>ヘマトキシリン</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>3801562E</td><td></td></tr><tr><td>インスリン ペレット</td><td>リンシン</td><td>INS-B14</td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>セントラベット</td><td>ISO007</td><td></td></tr><tr><td>ランタス (インスリン グラルギン)</td><td>サノフィ アドベンティス</td><td>ランタス ソロスター</td><td>長時間作用型インスリン</td></tr><tr><td>メタカム</td><td>ベーリンガー インゲルハイム</td><td>MET019</td><td>抗炎症薬</td></tr><tr><td>NaCl(生理食塩水用0.9%)</td> <td>シグマ</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>針 26G</td><td>テルモ</td><td>050101B</td><td></td></tr><tr><td>酸素</td><td>リンデ</td><td>2010152</td><td>イソフルラン用</td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>ベトキノール</td><td>ドレタール</td><td>安楽死用</td></tr><tr><td>ステラニオス 2%</td><td>アニオス11764046</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストレプトゾトシン</td><td>サンタクルス</td><td>SC-200719A</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ&ndash;Injekt-F</td><td>B.Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>トロカール&スタイレット(リンシン)</td><td>Linshin</td><td>G12-SS</td><td>ペレット挿入用</td></tr></tbody></table>

内大網膵島移植を用いた h 大網マトリックス アイレット充填 (ホーミング)

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

細胞療法に基づいた再生医療は、病気を治すための新しい希望を表します。現在の障害は、治療の効率の適切な体内検証を組み込みます。受信者の本体への転送での細胞はしばしば生体材料、特にゲルと組み合わせる必要があります。しかし、このような移植の有効性の検証には、適切な環境、右ハイドロゲルと右受信者のサイトが必要です。大網のようなサイトがあります。膵島移植の例に基づいて、移植膵島移植と生存率を改善するために、大網の層の間に、組織内の注入から成っているホーミング (マトリックス小島 h 大網充填) 技術を開発しました。これを実現する、小島は粘度の非外科的針を使用して注入を可能にするハイドロゲルに埋め込まれるあります。注射器は、ハイドロゲルと小島の組み合わせで読み込まれます。別のエントリ ポイントで大網組織内いくつかの注射で行なうし、アイレット/ヒドロゲル混合物の沈着が線に沿って作られました。デキストラン ビーズを用いたこの革新的なアプローチの可能性をテストしました。ビーズも、血管に近接、大網の組織で普及しました。移植の有効性をテストするために糖尿病ラット膵島を移植し、代謝のフォロー アップ 2 ヶ月以上を実行します。移植膵島は再血管周りや小島内部の高レートを展示、糖尿病を逆転させた。ホーミングの技術は、ゲルまたは細胞療法は、高い代謝活性と細胞の他のタイプに適用可能性があります。

ホーミング メソッドは、臓器血管内注入の回避と小島の閉じ込めを許可します。8-10 分の最大時間は麻酔科を含む全体の膵島移植手順に必要な古典的な肝移植に匹敵するタイムライン。
大網の組織内小島での配布を勉強するには、デキストラン ビーズはホーミング メソッド (図 2) を使用して移植されました。注入後 1 日はラットを犠牲と組織学的解析の大網組織が取得されました。ヘマトキシリン ・ エオシン染色 (図 2、右下) 組織全体でビーズの均一な分布を明らかにしました。非常に多くの場合、ビーズは血管の近くにあった、脂肪質のティッシュでよく植えられてでした。注入後すぐに組織中の小島をネストする組織再編の結果、ビーズの周りに炎症反応が発生します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig2.jpg"> 図 2: ホーミング技術とビーズ ディストリビューション大網組織を注入後一日の説明。ホーミング技術の (A) のイラスト。臓器露出 (左) 後、(青色のデキストラン ビーズより良い視覚化のためにここに置き換え) 小島ハイドロゲル ミックス慎重に非外科的針 (真ん中) を使用して組織に注入しました。組織に注入したビーズが目に見える (A, 右) です。(B) ヘマトキシリン ・ エオシン染色大網の仔ビーズ注射後 1 日目。ビーズは、一様分布を使って組織で発見されます。スケールバー = 100 mm ピッチにて<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ルイス ・ ラットを用いた同質遺伝子の研究を行った、この手法を検証する (n = 8)。体重 1 kg 当りラット ホーミングを使用して糖尿病ラット膵島移植 (7660 アイレット相当、IEQ) 血糖と C peptidemia 2 ヶ月間監視されました。血糖はインスリン (図 3 aで観測された血糖で最初のドロップを証明) としてペレットの注入によって制御されました。移植機能は約 2 g/L と C peptidemia の血糖によって反映された &gt; 500 分。移植前にラットが糖尿病 (がグルコ メーター &gt; 5 g/L と C peptidemia &lt; 200 pM)。移植およびインスリン ペレット検索後、わずか 3 日後に移植をホーミング観察する血糖維持と正規化し移植検索 (p &lt; 0.05 事前移植レベルと比較して) まで維持されていた。大網植後血糖が再びホーミングによって移植された島の機能を証明する前の移植レベルに上昇 (図 3 a)。C peptidemia パターンが続いて増加と研究のコース全体でこの増加したレベルでの保守、移植前に検出不可能なレベルに低いとは、まさに正反対 (p &lt; 0.05)、大網植後、事前移植レベル (図 3 b) に減少します。組織学による explanted 大網の解析では、血管 (図 3) への近さの結果として可能性が最も高い高度に再血管の小島を明らかにしました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig3.jpg"> 図 3: 群のホーミングとグラフト評価のフォロー アップを代謝 2 ヶ月。(A) 血糖測定と膵島のキャリアとしてアルギン酸を用いたホーミング後 C ペプチド (B) 評価 (テキサス州: 移植とインスリン ペレット検索;植: 大網の植)。移植は機能、インスリン ペレット取得後な場合の保守によってように、膵島移植後 C peptidemia の増加します。灰色の影付きの領域は、それぞれの時点で最小と最大記録された値を表します。(C) ヘマトキシリンとエオシン染色大網セクション ホーミング法を用いた膵島移植後。小島は、任意の周囲の線維化組織せず注入後 2 ヶ月組織に十分に統合されました。船は、矢印で示すように、周りや小島内部成長し、こうして膵島機能を完全に復元します。小島の形態もよく保存されたようです。スケール バー = 50 μ m。 (n = 8) (*p &lt; 0.05; * * p &lt; 0.01; * * * p &lt; 0.001 テューキー正直意義の違いテストと事後テストとして反復測定分散分析 (ANOVA) を使用して決定)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、ハイドロゲルを用いた細胞療法、膵島移植の例の生体内での検証のためのプロトコルを提案する.h 大網マトリックス アイレット (ホーミング) 注入充填により適切な代謝環境の生着を最大化するために、血管の近くに、大網の層間細胞ヒドロゲル混合物の注入ができます。

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the ...

この方法は、例えば、ホメリング手術技術によって小口移植を最適化することができるような、細胞治療分野の重要な質問に答えるのに役立ちますか?この手法の主な利点は、シンプルで高速で、調整可能であり、生体材料の検証も非常に迅速です。誤って配置された針は、小葉漏れをもたらす可能性があるとして、針の配置の視覚的なデモンストレーションは、大腸内の適切な移植片の注入を確保するために重要です。糖尿病を誘発するには、1キログラム当たり75ミリグラムのレンサプトゾトシンを1キログラムの腹腔内にそれぞれ、150〜190グラムのルイスレシピエントラットに注入し、注射後最初の4日間の毎日の血糖値測定によって糖尿病の状態を確認する。ラットが1リットル当たり2グラム以上の血糖を示すとき、糖尿病合併症と体重減少を防ぐために1日あたり6単位の長時間作用型インスリンを皮下注射する。200ピコモラル未満のCペプチドレベルで、2つの連続した日の1リットル当たり4〜5グラムを超える尾静脈血糖値の2つの尺度である場合、実験コホートにラットを含める。ペレット注入の場合、麻酔下糖尿病レシピエント動物のつまみつまみへの応答の欠如を確認し、ポビドネヨウ素で首をきれいにします。注入領域を剃り、追加のポビドーネで露出した皮膚をきれいにします。3分後、1~5個のポビソンヨウ素溶液に1つの1/2インスリンペレットを殺菌し、16ゲージのトロカールを使用して露出した首の皮膚を突き刺します。次に、ガイドとスタイレットを使用してペレットを挿入し、開口部を単一の点で縫合します。より多くのポビトンヨウ素でステッチをきれいにし、ラットが低血糖を避けるために監視と食品とケージで回復することができます。ペレットの効率を測定するために、インスリンペレット注入後1ヶ月で200ピコモラー下で尾静脈血球Cペプチドレベルの尺度が維持される場合の実験コホート中のラットを含む、移植後1ヶ月間、1週間の血糖値減少を測定する。オトインマトリクス内の小島充填の場合、正常なドナーラットから分離された島の数を小島当量で数え、個々の1.5ミリリットルチューブで1キログラム当たりの1,660個の島を調製する。牛胎児血清なしで500マイクロリットルのCMRL培地で各アリコートを洗浄し、氷の上にチューブを置く前に慎重に混合して、チューブあたり150マイクロリットルの新鮮なアルギン酸ヒドロゲルキャリアの小島ペレットを再懸濁します。次に、1ミリリットルの注射器に、死量のない150マイクロリットルの空のアルギン酸塩を備えた外傷性21ゲージの針を搭載し、続いて150マイクロリットルのアルギン酸塩と島をロードする。スポイジを氷の上に置き、ちょうど実証したように、最初のレシピエント動物の首を準備します。メスを使用して古い創傷の切開を行い、鉗子を使用してペレットを取り除きます。1 つまたは 2 つの単一のステッチ ポイントでステッチを閉じ、ラットを supine の位置に配置します。腹膜領域を殺菌し、剃ります。メスを使用して胸骨のすぐ下に1/2センチメートルの腹腔の下を作成します。切開の周りに湿式殺菌ガーゼを置き、胃の隣にある観葉性脂肪パッドを特定します。鉗子を使用して腹腔から脂肪パッドを静かに引き出し、ガーゼに広げます。2ミリリットルの予め温めた37°Cの無菌生理食塩水で軟化し、片手に小さな湾曲した鉗子で組織を保持し、もう一方の針で耳の葉層の間の耳の端を貫通する。注射を開始する前に、針を挿入するときは、それが軟質組織の薄い層に囲まれていることを確認してください。注射針を完全に挿入し、注射された島を組織全体に広げることができるように針を引っ込めながらゆっくりと島の準備を注入し始める。注射中に、針を組織の端まで引き込み、針がほとんど出ているときに注射を止める。次に、5 秒間待ってから、次の場所で新しい射出を開始します。そして、実証されているように別の3〜4つのアリコートを注入する。すべてのヒドロゲルが分配されたら、注射された小島の損失を避けるために針を慎重に引き出し、注射の終わりに注射器に小島が集まっていないかどうかを確認する。すべての島が送達されたら、耳膜と腹腔の壁を水和してから、耳膜組織を腹腔に慎重に戻します。事前に温めた滅菌生理食塩水を腹腔に2ミリリットル注入して、ラットを水分補給する。その後、連続した糸縫合で筋肉の壁を閉じ、単一のステッチポイントで皮層をステッチします。代謝フォローアップの1〜2ヶ月後、示されているように各レシピエントの外科的切開を開き、鉗子を使用して慎重に切開部の隣にレイアウトされた生理液浸しのガーゼにオメンタを広げる。膵尾に付着した領域から始めて、はさみを使用して観葉組織を切除し、各動物を閉じる前に2ミリリットルの予め温めた生理食塩水を注入します。パラフィンに埋め込む前に、取得したオメンタを4%パラホルムアルデヒドで固定します。次に、組織の厚さ4マイクロメートルの部分をミクロトーム上で取得し、移植の形態学的評価のためにヘマトキシリンとエオシン染色を適用する。実証されたhOMING法を用いて移植されたデキストランビーズは、血管の近くで頻繁に観察され、脂肪組織内に十分に移植された。この代表的な同等性研究では、最初に1つの1/2インスリンペレットの移植によって制御され、次に1リットル当たり約2グラムの血糖血症とレシピエント動物の500ピコマラーを超えるC-ペプチドミアによって示されるように植え込まれた小島によって制御された。さらに、植えられたオメンタの組織学的分析は、血管に近い結果として最も可能性の高い高度に再血管化された小島を明らかにした。その開発後、この技術は、細胞治療分野の研究者が前臨床モデルにおける生体工学的細胞微小環境を探求する道を開いた。

intra-omental-islet-transplantation-using-h-omental-matrix-islet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

分離された膵島の移植は1型糖尿病の治療薬であることが提案されている。ここでは、マウスの膵臓から膵島を分離し、腎臓の被膜下のスペースにそれらを移植する方法を説明します。...

マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

このビデオでは、ヒト膵島をマウスの眼の前房に移植し、in...

膵島移植:In vivoイメージングのためのマウス眼の前房に膵島を移植する方法

このプロトコルは、マウス島の単離および脱細胞化された骨格上への播種を実証する。足場支持膵島を、ストレプトゾトシン（STZ）誘発糖尿病マウスの精巣上体脂肪パッドに移植した。島は移植部位で生存し、高血糖状態を逆転させた。...

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

大網移植マウスの島のための方法を紹介します。膵島は、ハイドロゲルと混合され、混合物は糖尿病マウスの大網のポーチに配置されます。血糖値を監視し、免疫組織化学的解析を行っています。...

マウスで大網に膵島移植法

マウス モデルにおける膵島の門脈内移植

このプロトコルでは、マウスの小口分離および、皮下白色脂肪組織への移植の方法が記載されている。単離された同系マウス島は、基質膜ヒドロゲルを用いてマウスレシピエントに移植される。レシピエントの血糖値をモニターし、そして、血小移植片のヒストロジー分析を行う。...

マウス島の口内皮下白色脂肪組織(ISWAT)移植モデル

このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。...

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

この脂肪で覆われた膵島移植法は、腹腔内に生着した膵島の検出に適しています。特に、それは生体結合剤の使用または縫合を必要としない。...

精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植

ここでは、マウスにおける門脈内膵島移植(臨床的には関連性はあるが技術的に困難な外科的処置)を成功裏に実施するための洗練された外科的処置を提示する。...

マウスの肝内膵島移植中の注入後門脈静脈出血の最小化

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶ、hOMING法による内大網膵島移植の最適化手法。ラットを用いた細胞治療の生体内検証プロトコルで、水素ゲル担体と血管近傍への移植により膵島の血管新生と血糖コントロールを改善する方法です。

内大網膵島移植を用いた h 大網マトリックスアイレット充填 (ホーミング)

さらに動画を探す

内大網膵島移植を用いた h 大網マトリックス アイレット充填 (ホーミング)

さらに動画を探す

内大網膵島移植を用いた h 大網マトリックスアイレット充填 (ホーミング)