内大網膵島移植を用いた h 大網マトリックス アイレット充填 (ホーミング)

ここでは、ハイドロゲルを用いた細胞療法、膵島移植の例の生体内での検証のためのプロトコルを提案する.h 大網マトリックス アイレット (ホーミング) 注入充填により適切な代謝環境の生着を最大化するために、血管の近くに、大網の層間細胞ヒドロゲル混合物の注入ができます。

この方法は、例えば、ホメリング手術技術によって小口移植を最適化することができるような、細胞治療分野の重要な質問に答えるのに役立ちますか?この手法の主な利点は、シンプルで高速で、調整可能であり、生体材料の検証も非常に迅速です。誤って配置された針は、小葉漏れをもたらす可能性があるとして、針の配置の視覚的なデモンストレーションは、大腸内の適切な移植片の注入を確保するために重要です。

糖尿病を誘発するには、1キログラム当たり75ミリグラムのレンサプトゾトシンを1キログラムの腹腔内にそれぞれ、150〜190グラムのルイスレシピエントラットに注入し、注射後最初の4日間の毎日の血糖値測定によって糖尿病の状態を確認する。ラットが1リットル当たり2グラム以上の血糖を示すとき、糖尿病合併症と体重減少を防ぐために1日あたり6単位の長時間作用型インスリンを皮下注射する。200ピコモラル未満のCペプチドレベルで、2つの連続した日の1リットル当たり4〜5グラムを超える尾静脈血糖値の2つの尺度である場合、実験コホートにラットを含める。

ペレット注入の場合、麻酔下糖尿病レシピエント動物のつまみつまみへの応答の欠如を確認し、ポビドネヨウ素で首をきれいにします。注入領域を剃り、追加のポビドーネで露出した皮膚をきれいにします。3分後、1~5個のポビソンヨウ素溶液に1つの1/2インスリンペレットを殺菌し、16ゲージのトロカールを使用して露出した首の皮膚を突き刺します。

次に、ガイドとスタイレットを使用してペレットを挿入し、開口部を単一の点で縫合します。より多くのポビトンヨウ素でステッチをきれいにし、ラットが低血糖を避けるために監視と食品とケージで回復することができます。ペレットの効率を測定するために、インスリンペレット注入後1ヶ月で200ピコモラー下で尾静脈血球Cペプチドレベルの尺度が維持される場合の実験コホート中のラットを含む、移植後1ヶ月間、1週間の血糖値減少を測定する。

オトインマトリクス内の小島充填の場合、正常なドナーラットから分離された島の数を小島当量で数え、個々の1.5ミリリットルチューブで1キログラム当たりの1,660個の島を調製する。牛胎児血清なしで500マイクロリットルのCMRL培地で各アリコートを洗浄し、氷の上にチューブを置く前に慎重に混合して、チューブあたり150マイクロリットルの新鮮なアルギン酸ヒドロゲルキャリアの小島ペレットを再懸濁します。次に、1ミリリットルの注射器に、死量のない150マイクロリットルの空のアルギン酸塩を備えた外傷性21ゲージの針を搭載し、続いて150マイクロリットルのアルギン酸塩と島をロードする。

スポイジを氷の上に置き、ちょうど実証したように、最初のレシピエント動物の首を準備します。メスを使用して古い創傷の切開を行い、鉗子を使用してペレットを取り除きます。1 つまたは 2 つの単一のステッチ ポイントでステッチを閉じ、ラットを supine の位置に配置します。

腹膜領域を殺菌し、剃ります。メスを使用して胸骨のすぐ下に1/2センチメートルの腹腔の下を作成します。切開の周りに湿式殺菌ガーゼを置き、胃の隣にある観葉性脂肪パッドを特定します。

鉗子を使用して腹腔から脂肪パッドを静かに引き出し、ガーゼに広げます。2ミリリットルの予め温めた37°Cの無菌生理食塩水で軟化し、片手に小さな湾曲した鉗子で組織を保持し、もう一方の針で耳の葉層の間の耳の端を貫通する。注射を開始する前に、針を挿入するときは、それが軟質組織の薄い層に囲まれていることを確認してください。

注射針を完全に挿入し、注射された島を組織全体に広げることができるように針を引っ込めながらゆっくりと島の準備を注入し始める。注射中に、針を組織の端まで引き込み、針がほとんど出ているときに注射を止める。次に、5 秒間待ってから、次の場所で新しい射出を開始します。

そして、実証されているように別の3〜4つのアリコートを注入する。すべてのヒドロゲルが分配されたら、注射された小島の損失を避けるために針を慎重に引き出し、注射の終わりに注射器に小島が集まっていないかどうかを確認する。すべての島が送達されたら、耳膜と腹腔の壁を水和してから、耳膜組織を腹腔に慎重に戻します。

事前に温めた滅菌生理食塩水を腹腔に2ミリリットル注入して、ラットを水分補給する。その後、連続した糸縫合で筋肉の壁を閉じ、単一のステッチポイントで皮層をステッチします。代謝フォローアップの1〜2ヶ月後、示されているように各レシピエントの外科的切開を開き、鉗子を使用して慎重に切開部の隣にレイアウトされた生理液浸しのガーゼにオメンタを広げる。

膵尾に付着した領域から始めて、はさみを使用して観葉組織を切除し、各動物を閉じる前に2ミリリットルの予め温めた生理食塩水を注入します。パラフィンに埋め込む前に、取得したオメンタを4%パラホルムアルデヒドで固定します。次に、組織の厚さ4マイクロメートルの部分をミクロトーム上で取得し、移植の形態学的評価のためにヘマトキシリンとエオシン染色を適用する。

実証されたhOMING法を用いて移植されたデキストランビーズは、血管の近くで頻繁に観察され、脂肪組織内に十分に移植された。この代表的な同等性研究では、最初に1つの1/2インスリンペレットの移植によって制御され、次に1リットル当たり約2グラムの血糖血症とレシピエント動物の500ピコマラーを超えるC-ペプチドミアによって示されるように植え込まれた小島によって制御された。さらに、植えられたオメンタの組織学的分析は、血管に近い結果として最も可能性の高い高度に再血管化された小島を明らかにした。

その開発後、この技術は、細胞治療分野の研究者が前臨床モデルにおける生体工学的細胞微小環境を探求する道を開いた。