Name: 新しいポータブル体外露出カセット エアロゾル サンプリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学ぶPIVECシステムを用いたポータブルなエアロゾル細胞暴露法。気液界面で培養した肺細胞に実環境のエアロゾルを直接暴露し、酸化ストレスや細胞毒性を評価する革新的な大気質モニタリング技術です。

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著者は、ボリス ・ Solomonov、ラピッドプロトタイピング デバイスのヘルプについてバージニア州連邦革新マシン ショップに感謝したいと思います。著者も Lewinski グループのクリスティアン ・ ロメロ-フエンテス、博士 Vitaliy Avrutin、博士ディミートリ ・ Pestov、バージニア州連邦ナノ コア評価施設彼らの助けの粒子特性評価とを感謝したいと思います。この作品は、バージニア ・ コモンウェルス大学工学部博士 Lewinski に供給したスタートアップ資金によって支えられました。

とき個人保護具 (例えば白衣、手袋、ゴーグル) を着用しなければならないオペレーター 1、2、3、5、および 6 の手順を実行します。
1 材料の準備
<ol><li>
システム アセンブリと露出は再現性を確保するための材料を準備します。
	<ol>
<li>新しい使用または 70% エタノール洗浄 ¼"内径導電性チューブおよび 1/4" 外径用コネクタ システム アセンブリを確認します。</li>
		<li>よく制御された環境で、温度と湿度、実験する前に、少なくとも 24 時間に関してフィルター、PIVEC コンポーネント、ピンセット、および微粒子粉末を含むストア テスト材料。 注: 温度は部屋の温度、およそ 20 ° C、相対湿度 35% 未満の近いはず。これは、実験の再現性を達成するために非常に重要です。</li>
		<li>部品をきれいにし計測するための光学粒子 sizer (OPS) スキャン モビリティ粒径 (SMP) など、メーカーの推奨事項に従ってシステムのウォーム アップは、イソプロパノールを使用してパーティクル カウンターを準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 乾燥エアロゾルの生成
注: オペレーターは、ヒューム フードでエアロゾル生成を実行します。
<ol><li>
乾燥エアロゾルを生成するシステムを構築します。 注: 気体・液体の粒子の懸濁液はモデル化されたアプリケーションと細胞文化の適切なはずです。次のメソッドは、液体ベースのエアゾールを使用して実行できます。乾燥エアロゾル システムの設計は、異形らからです。37ドライ散布システムの概略図は、図 1に表示されます。<ol>
<li>4"1/8 スレッドのサイズのパイプの両端にボールバルブを接続、これは粒子のホッパーとなります。1 つのバルブに 2」1/8 サイズのパイプを接続します。</li>
		<li>成膜効率を決定する際に粒子サイズごとに質量濃度が一定に保たれたこの研究で銅ナノ粒子の重量を量る。約 40 nm 銅ナノ粒子の 7.5 mg、7 mg の 100 nm 銅ナノ粒子、および露出あたり 800 nm 銅ナノ粒子の 13 mg を使用します。オープン エンドを通じて粒子ホッパーに銅ナノ粒子を配置します。 注: 質量に応じて投与濃度、銅ナノ粒子の重量を量った量が提供されます。</li>
		<li>場所 3"½" 外径 (OD) チューブ 2"パイプとその流れの方向は、ボール バルブを HEPA フィルター短いチューブ内の場所の周りの部分。</li>
		<li>スレッドを使用するその他のボール弁に真空ポンプを接続します。プッシュ-ロック接続に 5/16"外径チューブを配置することによって、空気タンクに真空発生器を接続します。¼"外径チューブを使用して、真空発生器のコンセントにチューブを配置することによって実験の設定に真空発生器のコンセントを接続します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
乾燥エアロゾルを生成する乾燥エアロゾル システムの使用
	<ol>
<li>メインのバルブを回して空気タンクを開き、システムに空気の流れを許可します。空気タンクの流量制御バルブを開き、システムのフローが真空ポンプで目的の設定と同じように設定します。</li>
		<li>HEPA フィルターに最も近いボール弁を開き、真空発生器に最も近いボール弁を開きます。約 3 これらを開けて空気の流れに引っ張られる粒子を許可するように s。</li>
		<li>真空発生器、HEPA フィルターに最も近いボール弁を閉じますに最も近いボール バルブを閉じます。必要に応じて、テスト期間のための流れにタンクから空気を許可します。</li>
		<li>流れが停止する空気タンクでメインとレギュレータ バルブを閉じます。クリーン ボール弁と 70% エタノールを用いた真空発生器。オートクレーブ滅菌用の金属パイプ。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 堆積効率測定装置 PIVEC を使用して
注: オペレーターは、ヒューム フードでエアロゾルのエクスポー ジャーを実行します。
<ol><li>手順 2.2 事前重量を量られたフィルターで生成した銅ナノ粒子エアロゾルを集めることによって成膜を測定します。フィルターで収集した質量を用いて堆積の用量と投与量、重量を量られた銅粒子の量を使用して成膜効率を決定する測定を使用します。<ol>
<li>1.1.2 事前暴露測定する前に、少なくとも 24 時間の低湿度条件下で 1.00 μ m 孔ガラス繊維フィルターを維持します。3 回未使用のフィルターの重さし、フィルターのウェイトを記録します。場所細胞培養で未使用のフィルターを挿入します。</li>
		<li>適切なセル フィルターと細胞培養の挿入をサポートする PIVEC の挿入アダプターを文化 (6 井戸または 24 井戸) を選択します。場所細胞培養は、アダプター部分のベースが上部よりも広いように所定の位置に設定、PIVEC のベース上にアダプター ピースを挿入します。</li>
		<li>アダプター部分内で読み込まれたフィルター細胞培養を配置する使用ピンセットを挿入します。トップ部分のベースが上部よりも広い場所にセトリング アダプター ピースの上にトップの部分を配置します。ダクトテープの単一の層と PIVEC をラップします。</li>
		<li>所定の位置に押して 37 mm カセット作品に PIVEC の上部と下部に接続します。カセットの入口と出口に ¼"アダプターを配置します。</li>
		<li>ワイヤーが基地で PIVEC のまわりで抵抗ヒーターをラップします。固定するテープです。</li>
		<li>断熱用アルミ箔の 〜 8 ラウンドで PIVEC をラップします。テープで固定します。</li>
		<li>接続 2"1/2" PIVEC の上にアダプターに外径のフレキシブル チューブの長い作品。多孔質管を滅菌水と PIVEC の上にチューブ内の場所から削除します。</li>
		<li>クランプ リングの立場で、安全に PIVEC を置きます。真空ポンプ、粒子カウンター、およびエアロゾルのセットアップとセットアップを完了します。 注: パーティクル カウンター別の実行で PIVEC 前後、PIVEC に配置している場合にのみ、数に基づく堆積量を決定できます。</li>
		<li>0.5 LPM で 10 分間の露光時間を使用したこの研究ではステップ プロトコルと曝露時間と流れ率 2.2 を使用してフィルターを公開します。セットアップから PIVEC を削除します。細胞文化挿入を取り出して測定する前に、少なくとも 24 時間の低湿度条件下にフィルター ホルダーで公開されているフィルターを配置します。</li>
		<li>70% エタノールできれいに PIVEC。次の実験の前に少なくとも 30 分間の紫外線で殺菌します。</li>
		<li>3 回公開されるフィルターの重さし、フィルターのウェイトを記録します。ストレージのラベル フィルター ホルダーに公開されているフィルターを配置します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 堆積量と溶着率の計算
注: 沈着の知識はエアロゾル管理と細胞応答の解釈のために重要です。
<ol><li>
質量ベースの測定からを計算します。
	<ol>
<li>曝露前の平均重量と曝露後の平均体重の違いとしてフィルターに堆積の質量を計算します。この値は、堆積量の質量を用いた実験です。</li>
		<li>使用管理の質量、m は管理者と質量を用いた預託線量計算質量を用いた成膜効率 ηm実験のために mdep、4.1.1 以降で決定します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58916/58916eq1.jpg">
</li>
		<li>4.1.1 と沈着を決定する少なくとも 3 実験の 4.1.2 項及び粒 PIVEC の成膜効率平均値。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
数ベースの測定からを計算します。
	<ol>
<li>後、PIVEC と、PIVEC の前に粒子濃度を決定するパーティクル カウンターによる測定カウンターで実行されたことを確認します。パーティクル カウンターの時間の経過とともに粒子濃度を統合し、合計を決定する粒子径以上統合測定粒子。</li>
		<li>投与粒子と粒子測定のポスト PIVEC の違いとして堆積粒子数を計算します。この値は、実験の数に基づく堆積線量です。</li>
		<li>N管理、数値ベース管理使用粒子堆積線量 ndep、体積流量、V と、時間 t、ηn実験の数に基づく堆積効率を計算します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58916/58916eq2.jpg">
</li>
		<li>4.2.2 と 4.2.3 沈着を決定する少なくとも 3 の実験、粒子サイズの PIVEC の成膜効率平均値です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. エアロゾル微小
注: セルのリーダーの気液界面培養は空らに呼ばれます。38演算子は、バイオ セーフティ キャビネット内 (手順 5.1.2-5.1.4) を読み込み携帯文化挿入を実行する必要があります。演算子は、ヒューム フードでエアロゾルのエクスポー ジャーを実行します。
<ol><li>
気液界面培養細胞
	<ol>
<li>A549 細胞培養用フラスコからトリプシン-EDTA、T75 フラスコまたは T25 フラスコ 1 mL 3 mL を追加することによって持ち上げ、37 ° C で 5 分間インキュベートT25 フラスコにフラスコ、細胞懸濁液をリンス フラスコの壁回復した細胞の数を最大化する 7 mL の完全培 T75 フラスコまたは完全なメディアの 4 mL を追加します。細胞懸濁液を滅菌 15 mL の円錐管、3 分間 800 × gで遠心分離セルに転送します。</li>
		<li>培養上清中の含んでいるトリプシン-EDTA を削除し、完全なメディアの 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液の 10 μ L を削除し、検定を追加します。濃度と細胞の総数を決定する診断を使用してセルをカウントします。</li>
		<li>完全なメディアの 0.5 mL を 24 well プレートの各ウェルに配置します。井戸の未使用細胞培養インサートを配置します。種細胞培養を近 1 × 105セル/cm2日あたり倍増に近いペースで成長するセル型のセル密度で根尖側に挿入します。種子、24 内のセルも挿入 A549、35,000 の細胞を細胞培養に追加することで 1 × 105セル/cm2の密度でシード セルを挿入します。 注: より遅い成長率と細胞は、細胞密度で播種できます。</li>
		<li>(24 well プレート最終巻は 0.25 mL) の最終的なボリュームに到達する細胞文化挿入の根尖側に完全なメディアを追加します。</li>
		<li>交換メディアごとに 1-2 日間の湛水条件で 7 日間培養。7 日後基底メディアのみを交換アリ状態で少なくとも 1 日頂のメディアと文化を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PIVEC を組み立てる
	<ol>
<li>露出する前に、少なくとも 24 時間の気液界面に平衡します。</li>
		<li>フィルターに細胞培養の挿入をサポートする PIVEC の適切なセル文化挿入アダプターを選択します。場所細胞培養 PIVEC ベース、アダプター部分のベースが上部よりも広いように所定の位置に設定の上にアダプターを挿入します。PIVEC のベースのほかに細胞の培養基の 4 mL を追加します。</li>
		<li>5.2.3 の手順は、アダプター部分内で細胞培養を配置する使用ピンセットを挿入します。トップ部分のベースが上部よりも広い場所にセトリング アダプター ピースの上にトップ部分を配置します。慎重に、ダクトテープの単一の層と PIVEC をラップします。</li>
		<li>所定の位置に押して、PIVEC の上部と下部に 37 mm カセットの部分を接続します。カセットの入口と出口に ¼"アダプターを配置します。</li>
		<li>ワイヤーが基地で PIVEC のまわりで抵抗ヒーターをラップします。固定するテープです。</li>
		<li>断熱用アルミ箔の 〜 8 ラウンドで PIVEC をラップします。テープで固定します。</li>
		<li>1/2"外径フレキシブル チューブの短い部分を PIVEC の上にアダプターに接続します。多孔質管を滅菌水と PIVEC の上にチューブ内の場所から削除します。</li>
		<li>クランプ リングの立場で、安全に PIVEC を置きます。真空ポンプとエアロゾルのセットアップとセットアップを完了します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アリ、PIVEC を使用して細胞を公開します。
	<ol>
<li>吸入する粒子の質量を計算するのにステップ 2 で決定した成膜効率を使用します。適切な質量をはかるし、ヒューム フード内のステップ 2 の後の設定エアゾール システムに追加。</li>
		<li>この研究では生物学的エンドポイントの 2.2 のステップに従うことによって細胞の公開、セルが 3.5 mg 銅ナノ粒子の約 0.5 LPM の流量にさらされた、暴露時間に行われた 10 分コントロール研究の加湿空気を使用して決定単独での空気の影響。セットアップから PIVEC を削除します。細胞文化挿入を取り出し、滅菌のウェル プレートに、CO2インキュベーター (37 ° C、5% CO2、90 %RH) に戻る。</li>
		<li>PIVEC からメディアを吸い出しなさい。追加実験を実行している場合、リン酸 PIVEC のリンス下部バッファー ソリューション、5.1 および 5.2 手順を繰り返します。</li>
		<li>したら 70% エタノールできれいに PIVEC。次の実験の前に少なくとも 30 分間の紫外線で殺菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
生物学的定量法 注: 本研究での試金が DCFH DA アッセイによる酸化ストレス発生と乳酸脱水素酵素 (LDH) のリリースによって細胞毒性。<ol>
<li>1 mM DCFH DA ソリューション 50 mL のメタノールで DCFH-DA の 24.4 mg を溶解します。このソリューションは、最大 4 ヶ月間-20 ° C で保存できます。9.9 ml に 10 μ M の 10 mL HBSS 1 mM DCFH DA ソリューションの 0.1 mL を混合することによって 1 mM DCFH DA ソリューションを希釈 DCFH の DA</li>
		<li>文化挿入約 1 ml の PBS の文化メディアと洗浄セルのセルを削除します。挿入したらを取り付け、各ウェルに 10 μ M DCFH ダ溶液 0.5 mL を追加します。染料の光を防ぐため、1 h の 37 ° C の定温器に戻るアルミ箔でプレートをカバーします。</li>
		<li>インキュベーターからセルを削除し、井戸から DCFH DA 作業ソリューションを吸引します。井戸に 0.5 mL HBSS を追加し、細胞培養インサートを置き換えます。</li>
		<li>ウェル プレートを読み込むプレート リーダーと測定基準蛍光励起/蛍光波長 485/530 の nm。露出のための PIVEC に、プレート リーダーと負荷の挿入からプレートを取り外します。</li>
		<li>希望の暴露期間のセルを公開します。PIVEC からカバーを取り外します、ウェル プレートに戻ります。ウェル プレートとホワイト 96 well プレートの場所から基底液 50 μ L を削除します。DCF 485/530 の励起/蛍光波長の蛍光を測定 nm 30 分毎 2 時間暴露後。</li>
		<li>LDH 分析ソリューション、混合次メーカー プロトコルの 20-30 分を追加 50 μ L の部屋の温度を平衡させ、10 分も停止液を追加 25 μ L 反応ウェル プレートと基底液に基底液ができます。ら製品 560/590 の励起/蛍光波長の蛍光を読み取る nm。</li>
		<li>追加基底液を削除、手順 5.4.6 4 h で 24 時間暴露後.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 統計的な方法
<ol><li>生物試験データの解析<ol>
<li>ベースライン測定値を基準にして扱われた細胞の蛍光強度の増加として活性酸素産生を報告します。未処理のセルと相対的に扱われた細胞の蛍光強度の増加と LDH 活性を報告します。</li>
		<li>単一要因 ANOVA のデータ セット間の統計的な差異を決定するを実行します。必要に応じて、値 0.05 の意義の学生の t テストを実行します。少なくとも 3 つの露出測定の平均 ± 標準偏差としてデータを報告します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者の所属は、送付状に表示されます。著者はヴァージニア連邦大学、リッチモンド、バージニア州で、作業が完了したによって財政上支えられる著者は、書くと本稿の内容に責任を持ってください。著者は、競合する利益がないことを宣言します。

フィルター カセット呼吸ゾーンにおけるエアロゾルの収集のシンプルで安価な方法を提供します。ただし、フィルターから抽出されたエアロゾル試料全体のエアロゾル (すなわち気体、揮発性物質、及び粒子) を表す、その結果の関連の生物学的影響評価を制限します。37 mm フィルター カセットの初期設計を使用すると、移植性を維持し、吸入からの粒子の生体内沈着を模倣する、PIVEC です。PIVEC は現在アリ暴露システム、ほぼ含まれている温度・湿度コントロールとティッシュ ボックスのサイズより大幅に小さい。サイズは、エアロゾルへの細胞応答のデータをまた提供している間個人的なカスケード インパクターに似ています。PIVEC には、他の現在の露光装置と比較すると 1 つのサンプルのためのスペースが含まれますが、小さいサイズは、サンプル サイズを大きくし、監視対象となる空間分布したがって、複数のシステムを同時に使用するを許可します。
プロトコルのいくつかの重要な手順があります。成膜効率を決定するには、手順 1 で説明したようフィルターを正しく条件が重要です。さらに、正しく露出および質...

培養技術を使用して個人のサンプリングは、職場におけるエアロゾルの生物学的影響に関する包括的な情報を提供できます。1空気中の汚染物質への暴露は、ガスが導入される、細胞懸濁液に、断続的な露出や直接、ロッカーなどのデバイスを使用して湛水条件下で、収集された大気サンプル自体は、化学物質への曝露気液界面 (アリ) で露出。2これらのテクニックの多くは細胞懸濁液やエアロゾルの潜在的な変化のための毒性学的研究に影響を与えることができますそれぞれの露出の前にサンプルのコレクションで栽培されます。3これらの変更を避けるためには、研究室がもたらされることいくつかの in vitroを使用してフィールド4,5,6,7、文献で使用されているアリ文化露光装置 8,9,10、11,12,13しかし、いくつか市販されています。8,9,12これらのシステムは、かさばる、特に温度とサンプル エアロゾルの流量と細胞の環境の湿度を調整する機器を含みます。PIVEC を用いたエアロゾルのエクスポー ジャーまたは実行できます伝統的な実験室の設定の外呼吸ゾーン内吸入条件を真似しながら。
エアロゾル沈着体外の定量は、吸入による健康への影響の調査が重要です。呼吸ゾーン口と鼻、14から 30 cm 以内のエリアはナノ粒子への暴露を理解し、肺での生体影響にリンクするために重要です。2多くの場合、細胞に沈着として定義されます堆積効率粒子上に堆積され、管理システム6,15または同じ金額の単位質量の粒子によって分けられる細胞によってとら。4,16現在の呼吸域におけるエアロゾルの測定方法、フィルターに基づいて、特定のサンプリング期間中の粒子をキャプチャおよびフィルターを使用してさらにテストを実施します。17個人的に監視少ないサンプルのトレードオフに付属している小さなシステムが必要です。
エアロゾルへの曝露の健康影響を判断する方法は多数あります。アリ モデルでエアロゾルの本当の露出のシナリオのように空気を通って細胞に直接投与することは、まだ費用効率が高いと体内のより少ない時間がかかるが、目など空気液体障壁を真似しながら研究皮膚と肺。アリで成長して肺細胞体内の肺上皮、特定の粘液と界面活性剤の生産を含むのような生理学的な特性を作り出す18,19偏光バリア層を生成する能力があります。気管支や肺胞の細胞ライン、繊毛の鼓動、19タイトジャンクショ19,20とセルの分極。18は、毒性試験で測定される細胞の応答に影響を与えることができますこれらのように変更します。21また、アリの in vitroモデルの結果は細胞よりも多くの敏感なサスペンション モデル22を介して公開され、モデル体内急性吸入毒性に.23,24したがって、呼吸ゾーン内で測定を実行することができるアリ露出システムは自然な次のステップです。
エアロゾル放出源に直接細胞を公開すると、すべてのガス、半揮発性化合物や混合物に関与する粒子の効果の調査が行われます。フィルターで収集された混合物は、ガスや揮発性の化合物はキャプチャされず、全体の混合物を調査することはできません。さらに、粉末または液体の懸濁液の粒子の再構成は、集計または液体懸濁液に、解散などの粒子・流体系の相互作用につながります。25,26エアロゾル粒子を液体に追加すると、そこが集積、25,27形成タンパク質コロナ、28や沈着に影響を与えることができる液体の化合物との相互作用の可能性が高いと生物学的反応に影響を与えます。29,30
アリでの露出は、3 主なエアロゾル プロファイルがあり、クラウド整定時間、パラレル フロー、および垂直フローに基づいています。雲のセトリング、空気液体インターフェイス セル露出 (アリス) でを使用、4はバッチ システム粒子が重力とエアロゾルは 1 つのユニットとして扱われます、沈降拡散を介して入金します。平行流、静電エアロゾル体外露出システム (庇)5および多文化露出商工会議所 (MEC) II、によって使用される6流速分布をブラウン運動の追加により成膜が可能です。垂直フロー、microsprayer、7ナノ エアロゾル室体外毒性 (NACIVT)、11商業アリ システム8,9,10,12、によって使用される追加の宿便成膜領域内の粒子。これらの露出システムの多くは、大きくてかさばる、エアロゾル中古エアコン、流れ、ポンプまたは細胞の培養のための部屋を熱するため余分なシステムを必要とします。この大型システムの移植性が低下します。放出源に直接サンプリングではなくこれらのシステムはしばしば解析用に生成されたラボ環境またはモデルのエアロゾルを連れてサンプルを持っています。放出エアロゾルの複雑さは、フィールドから実験室への変換で失われる可能性が。PIVEC は約 460 cm2の表面積を持つ、現在のシステムよりも小さく、移植性の高いデバイスを可能にするシステムに組み込むわずか 60 グラム、熱と湿度制御の重量を量るします。減少のサイズと重量はシステムの着用や露出、ダイレクト サンプリングの許可の元に撮影を許可します。
現在の露光装置の大きさも濃度の空間勾配を調査するためのサンプリングを実行する能力を減少します。この解像度は、キー多くの潜在的な環境と自動車排気粒子状物質や職場活動などの労働災害の毒性学的効果を決定するエアロゾル化が発生します。すぐに後排出粒子濃度の空間的差異になります。これは時間とともに増加粒子が大気中に分散し、これらの効果を変更することができます周囲条件は、温度、圧力、風、太陽などに基づく。年齢し、同様一度放出31,32を酸化して、粒子と分散率を受けます; 地形峡谷、トンネル、分散効果は減速、低濃度を見つけることができますで発見される高濃度分散の大きい区域があります。33分散率のこれらの変更は人間の健康に重大な影響を持つことができます、都市対農村部の設定に住んでいる喘息の大人の数を比較するとき見ることができます。34多く露出システムは、複数のサンプルを一度に提供、複数のシステムが空間分解能を実行するための大型装置の豊富な必要です。
フィールドに演習をさせて、センサーとして全体のセルを使用して、分析の時間を減らすことが。既知の生物学的メカニズムとエンドポイントを次エアロゾル組成とサイズの決定で助けることができます。遅いクリアランス メソッド、粘液線毛クリアランス、貪食能、転流などのため、約生成する酸化ストレス、炎症および細胞死も週3日間は、これらの粒子は細胞と対話頻繁。これらの生物学的エンドポイントは、心血管疾患または慢性閉塞性肺疾患のための不利な結果経路の開始点にすることができます。また、Wiemennらは、短期的体内吸入毒性の文献値と比較する生体外の試金の配列を実行しました。35生体内の反応は、乳酸脱水素酵素リリース、グルタチオン還元と水素過酸化物形成とリリースから潜在的な炎症と酸化ストレスによる細胞毒性をテストから 4 つの肯定的な結果の 2 つの予測されました。腫瘍壊死因子アルファ遺伝子。10 ナノ金属酸化物テストからテスト 6 アクティブ (酸化チタン、酸化亜鉛、4 つの異なるセリウム)生体内で確認エクスポー ジャーの培養を用いたします。 
職業環境におけるエアロゾルの効果を研究するためには、私たちの研究室は、フィールドにおけるエクスポー ジャーについて PIVEC を開発しました。さらに、監視し 37 mm フィルター カセット36のような吸入暴露を調べる個人サンプリングのため、PIVEC を着用することができます。 または指定された領域内の空間分解能を達成するために複数のシステムを使用できます。このプロトコルでは、特性と、PIVEC の使用を説明します。暴露後生物学的効果は, 細胞毒性の試金を観察します。

<table><tbody><tr><td>スキャニング移動度粒子サイザー(SMPS)</td><td>TSI, Inc.</td><td>3910</td><td>NanoSMPS</td></tr><tr><td>光学式パーティクルサイザー(OPS)</td><td>TSI, Inc.</td><td>3330</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼管、4 "長い</td><td>McMaster-Carr</td><td>4830K116</td><td>標準壁304 / 304L、両端にねじ込み、1/8パイプサイズ</td></tr><tr><td>真鍮ボールバルブ、レバーハンドル付き</td><td>McMaster-Carr</td><td>4112T12</td>コンパクト<td>高圧定格、1/8 NPTメス</td></tr><tr><td>鋼管、2"長い</td><td>McMaster-Carr</td><td>7753K121</td><td>標準壁、一端にねじ込み、1/8パイプサイズ</td></tr><tr><td>HEPAフィルターGE</td><td>ヘルスケア</td><td>09-744-12</td><td>HEPAキャップ使い捨て空気ろ過カプセル</td></tr><tr><td>真空発生器</td><td>PISCO USA</td><td>VCH10-018C</td><td></td></tr><tr><td>PIVEC</td><td>VCU</td><td></td><td>設計のために著者に連絡してください</td></tr><tr><td>抵抗ヒーター1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>/4 "有刺鉄線コネクタ</td><td>Zefon International、Inc.</td><td></td><td></td>459743</tr><tr><td>多孔質チューブ</td><td>サイエンティフィック・コモディティーズ社</td><td>BB2062-1814A</td><td>親水性 10 um 細孔</td></tr><tr><td>バッテリーパワーバンク</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インサート</td><td>フィッシャーブランド</td><td>353095</td><td>24 ウェルプレートインサート</td></tr><tr><td>フィルター鉗子</td><td>フィッシャーブランド</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>13-711-27</td><td></td></tr><tr><td>グラスファイバーフィルター</td><td>SKC</td><td>225-7</td><td>バインダーフリータイプAEフィルター 37 MM 1.00 um 細孔</td></tr><tr><td>ウルトラマイクロバランス</td><td>A&D</td><td>BM-22</td><td>環境チャンバーに収納</td></tr><tr><td>37 mm フィルターカセット</td><td>SKC</td><td>225-3250</td><td>フィルターカセットブランク、37 mm、クリアスチレン</td></tr><tr><td>可変流量真空ポンプ</td><td>SKC</td><td>220-5000TC</td><td>AirChek TOUCH、5 〜 5000 mL/分</td></tr><tr><td>銅粒子</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1090</td><td>40 nm</td></tr><tr><td>銅粒子</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1088</td><td>100 nm</td></tr><tr><td>銅粒子</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1117M</td><td>800 nm</td></tr></tbody></table>

新しいポータブル体外露出カセット エアロゾル サンプリング

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

このプロトコル システムが導入されて新しい体外露出、その特性や性能など着用していることができます。大きいとかさばる、フィールドやソースでは排出量の呼吸ゾーン内で操作する輸送を困難に気液界面 (ALI)体外露出システムが多い。を通してこれらのシステムの小型化、研究室は、処理時間を迅速化し、細胞を連絡する前にエアロゾルは変わりませんより適切な露出方法を提供する、フィールドに同伴可能です。ポータブル体外露出カセット (PIVEC)の in vitro毒性試験が伝統的な実験室の設定の外のテストを許可する 37 mm フィルター カセットに適応。重量に基づく堆積効率を決定するため銅ナノ粒子の 3 つのサイズを使って、PIVEC は特徴付けられたと粒子数濃度解析。細胞生存率を維持しながら粒子を入金するシステムの能力を決定する露出した肺細胞の初期細胞毒性実験を行った。利用可能な垂直フローの in vitro露光装置と比較するとき、PIVEC は類似または増加堆積効率を提供します。サンプル スループットの低下にもかかわらず小さなサイズは現在体外アリ露光装置にいくつかの利点を与えます。個人を監視するために着用することが挙げられます、排出量のソースとセットアップ オプションに研究室から移動空間分解能低いユーザーを維持しながら複数のシステム コストします。PIVEC は、フィールドに空気インターフェイスの in vitroモデルに呼吸ゾーン内のエアロゾルを集めることができるシステムです。

労働の in vitro毒性にはエアゾール露出を実行しながら細胞を維持が含まれます。PIVEC システムは、図 2を含めて温度と湿度制御と着用の PIVEC に表示されます。電池式抵抗加熱装置を使用して温度を維持し、加湿を使用してエアロゾル増加多孔質、接液部のチューブを介して自然な加湿。研究室内部設定制御エーロゾル、PIVEC は図 1に示すように露出の設定にできます。システムの細胞応答を関連付けることができます、セルの上に堆積した投与量の検討が可能です。
成膜効率は宿便、沈降、および拡散蒸着力が含まれているので、システムに追加する粒子の大きさに依存しています。さらに、堆積は流量、露光時間、露出系の特性に依存しています。この情報により、堆積を予測できます。PIVEC の堆積効率は、2 つの方法、重量分析法、粒子の数の...

ポータブル携帯電話エアロゾルのエクスポー ジャーを実行し細胞応答の測定プロトコルを紹介します。生体内の生理学を模倣した気液界面成長細胞を用いる。銅ナノ粒子エアロゾルに対する細胞の反応は、乳酸脱水素酵素リリースとして細胞毒性および活性酸素種の生成を介して酸化ストレスとして観察されました。

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

PIVECは、細胞培養物を現実世界のエアロゾルに直接曝露することができるので、このプロトコルは重要である。システムは人が呼吸する同じ空気をサンプルするように警告することができ、新しいタイプの大気質モニタリングを可能にする。この技術の主な利点は、入院源や呼吸ゾーン内など、ベンチトップシステムにアクセスできない場所で培養肺細胞にエアロゾルを捕獲しやすいことです。この手順のデモンストレーションは、私の研究室を卒業した最近の卒業生であるリン・セカンド博士と、私の研究室の学部生であるナサニエル・ワイガルです。この実験では、試験材料と制御環境を試験前に24時間保存しました。乾燥分散システムを組み立てるには、ボールバルブを4インチ長い1/8サイズのネジパイプの一端に接続します。これは、粒子ホッパーとして機能します。粒子ホッパーの開いた端を通して、所望の量の銅ナノ粒子を入れる。次に、パーティクルホッパーを別のボールバルブで閉じます。2インチの長さ、1/8サイズのパイプをバルブに接続します。2 インチパイプの周りに長さ 3 インチ、1/2 インチの外径チューブを配置します。HEPAフィルターを短いチューブの内側に挿入し、流れ方向がボールバルブを通っていることを確認します。ねじを使用して、他のボールバルブに真空発生器を接続します。次に、真空発生器を空気タンクに接続します。真空発生器の出口に1/4インチの外径チューブを置き、実験用セットアップに接続します。空気タンクのメインバルブとレギュレータバルブを回して、目的の流れを設定します。HEPAフィルターに最も近いボールバルブを開き、真空発生器に最も近いボールバルブを開きます。それらを閉じる前に、特性評価や露出中にそれらを開いたままにしてください。まず、真空発生器に最も近いボールバルブ、次にHEPAフィルタに最も近いボールバルブ。空気タンクのメインバルブとレギュレータバルブを閉じて、流れを止めます。クリーンアップするには、ボールバルブと真空発生器を洗浄するために70%エタノールを使用してください。滅菌のためにオートクレーブに金属パイプを入れてください。空気液界面で細胞を培養した後、細胞が24時間平衡化することを可能にする。組み立てるには、PIVECベースを上に向けて取り、細胞培養インサートアダプタを上部に接続します。マイクロピペットを用いてPIVECの基底のウェルに4ミリリットルの細胞培養培地を加える。ピンセットを使用して、アダプター内に細胞培養挿入物を配置します。PIVECトップピースの狭い部分を上に向けた後、アダプタに接続します。慎重に、ダクトテープの単一の層でPIVECを包みます。PIVECの上部と下部に37ミリメートルのカセット片を接続するために押します。カセットの入口と出口に1/4インチの有刺鉄線アダプターを入れる。PIVECの周りに抵抗ヒーターを、ベースのワイヤーで包みます。テープを保護します。絶縁のためのアルミホイルの8ラウンドでPIVECを包み、テープで固定します。PIVECの上部にあるアダプターに1/2インチの外径チューブを接続します。滅菌水から多孔質チューブを取り除き、PIVECの上にチューブ内に配置します。ヒュームフードにシステムを移し、リングスタンドにPIVECを固定し、固定します。エアロゾル発電機の出口にある直径1/4インチのチューブを多孔管に接続して、PIVECをエアロゾルシステムに接続します。Y コネクタで HEPA フィルタと真空ポンプに接続されている直径 1/4 インチのチューブに PIVEC の出口を接続します。バルブをオンにし、ポンプの流量を毎分0.5リットルに設定します。バルブを閉じてポンプを遮断する前に、10分間細胞を銅ナノ粒子にさらします。エアロゾルシステムからPIVECを取り外します。ピンセットを使用して細胞培養インサートを取り出し、滅菌ウェルプレートに入れて、所望の生物学的アッセイを開始します。提案された露光時間ポイントは、インキュベーターに挿入物を戻す。スポイトを使用してPIVECから吸引媒体。70%エタノールを使用してPIVECを洗浄し、次の実験の前に少なくとも30分間紫外線で殺菌してください。PIVECは、銅ナノ粒子の3つのサイズを使用して、堆積効率を決定することを特徴付けました。24ウェル設計では全体的に増量沈着が観察され、その後6つの井戸設計が観察されます。40ナノメートルと800ナノメートルの銅粒子に比べて100ナノメートルでわずかに減少します。銅ナノ粒子エアロゾルの粒子数濃度は、フィルタベースの走査移動度粒子サイザ、ならびに光学粒子サイザー測定によって決定した。露光後分析は、37ミリメートルフィルターと細胞培養挿入物との間の用量関係を決定することによって迅速に行うことができる。この比較は、p値が0.05未満の800ナノメートル銅粒子に対する強い相関を示している。文献全体にわたる体外露光系における垂直流量と比較して、試験された粒子サイズの範囲にわたるPIVECの堆積効率は、報告された値と比較して、または増加する。覚えておくべきことは、このプロトコルは実験室での設定でのPIVECの使用を実証しているが、それは暴露部位でエアロゾルへの細胞応答を測定するように設計されていたということです。オンサイトテストを実施する場合、試験エアロゾルの堆積効率を特徴付ける必要があります。堆積効率は、細胞が露出する粒子の堆積線量を決定する。追加の生物学的アッセイは、暴露によるより多くの細胞応答エンドポイントを調査するために行うことができる。PIVECは金属バインダーの噴射、および融合フィラメントの製造のような3D印刷プロセスの間に発生するエアロゾルによる細胞応答を査定するために使用されている。ナノ粒子の使用は、特にエアロゾルの形態では危険であり、あらゆる暴露はヒュームフードで行われるべきである。細胞の仕事は生物安全キャビネットで行われるべきである。

a-new-portable-in-vitro-exposure-cassette-for-aerosol-sampling

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環境

Source: Schaeffer, J. W., Chandler, et al. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the detection of viruses from bioaerosols using an anion exchange resin. A liquid impinger containing the resin is used to capture viruses from the air. The resin is collected and treated with a virus lysis buffer containing carrier RNA. The lysate is transferred to a microcentrifuge tube for viral RNA isolation, followed by qRT-PCR to amplify...

Anion Exchange Resin–Based Detection of Viruses from Bioaerosols

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我々は、空気-液体界面(ALI)で培養されたヒト肺細胞を暴露することにより、急性肺細胞傷害性に関する空気中の粒子のスクリーニングおよびモニタリングのための堅牢で移動可能で予測可能なインビトロ曝露システムを提示する。...

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毒性試験のための空気中の粒子への現実的な反復吸入暴露のための気管支上皮モデル

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学ぶPIVECシステムを用いたポータブルなエアロゾル細胞暴露法。気液界面で培養した肺細胞に実環境のエアロゾルを直接暴露し、酸化ストレスや細胞毒性を評価する革新的な大気質モニタリング技術です。

新しいポータブル体外露出カセットエアロゾルサンプリング

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