Name: 蛍光ペプチド ザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぶ蛍光ペプチドザイモグラフィーによるプロテアーゼ活性検出法。モジュール型設計で多様なプロテアーゼを検出し、バイオマテリアル研究や創薬への応用に貢献します。

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オハイオ州大学大学工学、医用生体工学科、包括的がんセンター - アーサー g. ジェームス キャンサー ホスピタルとリチャード ・ j ・ ソロブ研究所によって提供される資金。

1. 解決のゲル層の作製
<ol><li>10% ポリアクリルアミド ゲル溶液の表 1に従って解決を準備します。彼らの付加重合反応を開始すると、ゲルを注ぐ直前テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) とアンモニウムの過硫酸塩 (APS) を追加します。</li>
	<li>10% の解決のゲル溶液で空の 1.5 mm ミニ ゲル カセット (5 mL) の半分の方法を満たします。</li>
	<li>レベルのゲルを生成し、気泡を防ぐためポリアクリルアミドゲルの上部にイソプロパノール (〜 500 μ L) の薄層を追加します。残ったポリアクリルアミド ソリューションを使用すると、重合反応の進行状況を追跡します。チューブにポリアクリルアミドが完全に固化反応は、完全な (~ 40 分) です。</li>
</ol>2. アジドフェニル PEG3 マレイミド リンカー分子の作製
<ol><li>一方、最初の解決のゲル層を重合すると、-20 ° C のストレージからアジドフェニル PEG3 マレイミド キットを取得と部屋の温度に到達するコンポーネント。各キットには 2 つのコンポーネントがあります。1 バイアルには、マレイミド NHS エステル、灰色の固体にオフホワイトが含まれています。バイアル 2 アジドフェニル PEG3 アミン、若干黄色の油が含まれています。 注: 著者使用してお勧め 25 mg アジドフェニル PEG3 マレイミド キット (1-2 時間) の短い期間のみ格納できます-20 ° C でそれが低下し始めた前に準備されている後。25 mg は 10 ペプチド ゲルを生成するのに十分です。準備の 3 週間以内のジェルを使用します。</li>
	<li>ジメチルスルホキシド (DMSO) と 30 の渦の量を推奨メーカーのバイアル 2 のコンポーネントを溶かす液体をように s はよく混合されています。</li>
	<li>攪拌棒を含む清潔で乾燥した 100 mL の丸底フラスコに 1 バイアルの内容を転送します。 注: はアセトンでフラスコをすすいで水分の反作用と干渉することを防ぐために使用する前に完全に乾燥します。</li>
	<li>すぐにフラスコの口の中に注射器で穿刺できるダイヤフラムのゴム中隔ストッパーを挿入します。水分がフラスコ内に入るを防ぐためにすぐに動作します。</li>
	<li>挿入 2 18 ゲージは横隔膜に針を注射器、不活性ガスのタンク (例えばアルゴン ガス) に 1 つを接続します。3 分ミックスのフラスコを埋めるため不活性ガスのバイアル 1 と不活性ガス下で 2 望ましくない反応生成物を防ぐためにコンポーネントを許可します。 注意: 2 番目の注射針により、不活性ガスがフラスコの流れに、フラスコ内に含まれる大気、通気孔を提供することです。口針を含めることを忘れないでください!</li>
	<li>不活性ガスを止めるし、針からデタッチします。バイアル 2 の完全な内容をフラスコに注入する注射器を使用して。</li>
	<li>針と注射器を削除し、攪拌しながら室温で 30 分間混合するコンポーネント。</li>
	<li>ゴム中隔ストッパーを削除し、内容をきれいな 5 mL 遠心管に転送します。室温で 1 時間以内、アジドフェニル PEG3 マレイミド ソリューションを使用する必要があります。</li>
</ol>3. ゲル層を解決するペプチドの作製
<ol><li>最初の解決のゲル層が重合したイソプロパノール層を注ぎなさい。ゲルのトップをゲルの上に脱イオン水のピペット 1 mL でリンスし、水を注ぐ。</li>
	<li>-80 ° C のストレージからチオール官能基化蛍光ペプチドを取得でき室温で自然解凍。 注: 前述11,12チオール修飾ペプチドを用意できます。市販ペプチドも使用できますが、マレイミド チオールを有効にターミナルのシステイン残基の付加反応のクリックを必要とします。10 mM のストック濃度ペプチドを溶解し、凍結融解の繰り返しを制限するための小さい (30 uL) 因数で-80 ° C で保存します。</li>
	<li>解決するアジドフェニル PEG3 マレイミド リンカー分子との表 1に従って蛍光ペプチドを含むゲル溶液 10% を準備します。彼らの付加重合反応を開始すると、ゲルを注ぐ直前 TEMED と AP を追加します。</li>
	<li>ゲル溶液を解決するペプチドでゲル カセット (3 mL) の残りの部分の半分を埋めます。 注: 多層解決ゲル アプローチのペプチドでリンカー各ゲルに必要な量が減ります。ペプチド分解ゲル層のサイズは、必要に応じて、分子量の大きい範囲に合わせて調整できます。</li>
	<li>イソプロパノール (〜 500 μ L) の薄層のレベルのゲルを生成し、気泡を防ぐためポリアクリルアミド ゲルの上にピペットします。残ったポリアクリルアミド ソリューションを使用すると、重合反応の進行状況を追跡します。チューブにポリアクリルアミドが完全に固化反応は、完全な (~ 40 分) です。 注: 蛍光ペプチドは光に敏感です。開発、洗濯の電気泳動のゲルの準備の間に退色を防ぐためにアルミ箔で覆われているゲルを維持します。</li>
	<li>イソプロパノール層を離れて注ぎ、ステップ 3.1 のように脱イオン水でゲルを解決するペプチドの上部をすすいでください。</li>
	<li>場合は、すぐにゲルを使用して手順 4 に進みます、それ以外の場合、ゲルが乾くを防ぐためにプラスチック製のボックスで 4 ° C、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 100 mL で準備ができてゲルを浸します。退色を防止するアルミ箔でボックスをラップします。ジェルは、使用する前に 3 週間の PBS に格納できます。</li>
</ol>4. スタッキングのゲルの調製
<ol><li>表 1に従って 5% スタッキング ゲル溶液を準備します。彼らの付加重合反応を開始すると、ゲルを注ぐ直前 TEMED と AP を追加します。</li>
	<li>スタッキングのゲル溶液でゲル カセット (~ 2 mL) の残りの空の部分を塗りつぶします。</li>
	<li>すぐにスタッキングのゲルの層、井戸の下で閉じ込められた気泡が残っていないかどうかを確かめるに 1.5 mm のゲル櫛を挿入します。残ったポリアクリルアミド ソリューションを使用すると、重合反応の進行状況を追跡します。チューブにポリアクリルアミドが完全に固化反応は、完全な (~ 10 分) です。</li>
	<li>ゲル カセットの背面から櫛とテープを慎重に取り外します。</li>
</ol>5. 電気泳動用試料の準備
<ol><li>非還元条件2の下で前述の他の場所で MMP 等組織ホモジネートのセル lysates エアコン携帯メディアを準備します。サンプルを加熱しないでください。</li>
	<li>たとえば、とおりエアコン携帯メディアを準備します。<ol>
<li>10% ウシ胎児血清 (FBS) 培地で 6 ウェル プレートのプレート 40,000 セル/cm2セル。24 時間インキュベート加湿チャンバー (37 ° C 5% CO2 ) 細胞と 70-80% の合流点に達することができます。 注: セルが 24 時間後希望の confluency に達しない場合付加的な 24 時間の 10 %fbs 文化メディアに育つためにそれらを許可します。</li>
		<li>PBS で 2 回細胞を洗浄し、無血清培地 2 mL を加えます。追加 24 時間加湿チャンバー (5% CO2 37 ° c) のセルを孵化させなさい。</li>
		<li>血清ピペットを使用して、各ウェルからエアコンのメディアを収集します。任意の細胞の残骸を削除する 3 分の 1200 rpm でメディアを遠心します。上清をとり、15 mL、10 kDa の分子量カットオフ遠心ろ過ユニットを使っても集中。4,000 x g スイング バケツ ローターで 15 分間または固定角ロータで 15 分間 5,000 × g フィルター ユニットを遠心します。 注: この手順はオプションですが、ペプチド ザイモグラフィー ゲル内の蛋白質分解バンドの強度を高めることができます。</li>
		<li>新鮮な 1.5 mL 遠心管に集中して濾液を転送します。-80 ° c まで 3 つの凍結融解の因数とストアのサンプル。</li>
	</ol>
</li>
	<li>標準蛋白質定量アッセイを用いたタンパク質含量を定量化 (例えばBCA は、ブラッドフォードの試金、等)。</li>
</ol>6 生物の電気泳動のペプチド ザイモグラフィー ゲルのサンプルします。
<ol><li>従来のザイモグラフィー サンプル バッファーのサンプルを溶解 (62.5 mM トリス-HCl、pH 6.8, 4 %sds、グリセリン 25% 0.01% ブロモフェノール ブルー)。細胞・組織のサンプルもあたり総蛋白質の ~ 30 μ g をお勧めしますと MMP の標準のための蛋白質の 50-100 ng。</li>
	<li>1 の 400 mL を追加 x ゲル装置にトリス-グリシンの SDS を実行するバッファー。最大 35 μ L/ウェル サンプルをロードします。1.5 時間または分子量の基準を示す関心のプロテアーゼが (目に見えるオレンジ色のある) ゲル層を解決するペプチド内にあるまで 4 ° C で 120 V でサンプルを実行します。 注: ほとんどの MMPs とその亜種 35 100 kDa の範囲内で落ちる。分子量の基準を示す、これらの重みがゲル層を解決するペプチド、電気泳動を停止できます。同じ原理は、知られている分子量プロテアーゼの他のクラスに適用できます。分子量の大きい範囲にわたって複数のプロテアーゼを検出するに興味がある場合、解決のゲル層のサイズを小さくし、ペプチド分解ゲル層のサイズを増やします。</li>
	<li>次の電気泳動、プラスチック カセットからゲルを削除し、2.5% トリトン X-100、1 μ M ZnCl2、50 mM で 5 mM CaCl2を含む renaturing バッファーの穏やかな撹拌下で室温で 10 分ずつ 3 回ジェルを洗うトリス-HCl、pH 7.5。</li>
	<li>転送ゲル 1% を含む開発緩衝液に 1 μ M ZnCl2トリトン X-100 と 5 mM CaCl2 50 ミリメートル pH 7.5 15 分置換新鮮な開発とトリス塩酸バッファー溶液と 24 時間のために穏やかな攪拌下の 37 ° C でゲルを孵化させなさい、ゲルがソリューションで完全に沈水生であることを確かめます。</li>
</ol>7. イメージング ペプチド ザイモグラフィーをゲルします。
<ol><li>24 時間後、蛍光画像ゲル ゲルのスキャナー/撮像素子の励起と放射の適切なフィルターを使用しています。たとえば、代表的な結果に示すようにペプチド ゲルのフルオレセインを用いた共役し、488 の励起フィルターを使用してイメージを作成した nm と 521 の排出フィルター nm。適切なフィルターを使用してあなたの fluorophore のプロテアーゼ活性の検出を最大化します。 注: 画像は、エチジウム ブロマイドで染色 DNA ゲルのイメージングのために頻繁に使用される UV transilluminator 装備ゲル固体撮像素子でも撮影することができます。UV transilluminator を使用してゲルの画像 (365 nm) 設定と 590 の排出フィルター nm。</li>
	<li>13を他の場所で説明されているように ImageJ を用いたバンド強度のデンシトメトリーの評価を実施します。</li>
</ol>

<ol><li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li>
<li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Gelatinases+%28MMP-2+and+MMP-9%29+by+Gelatin+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).</li>
<li>Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+zymography+as+a+sensitive+and+specific+technique+for+the+determination+of+subpicogram+levels+of+interstitial+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase.</a> Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).</li>
<li>Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+collagen+zymography+approach+for+evaluating+the+collagenases+MMP-1%2C+MMP-8%2C+and+MMP-13%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13.</a> BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).</li>
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<li>van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).</li>
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<li>Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proteolytic+activity+by+covalent+tethering+of+fluorogenic+substrates+in+zymogram+gels%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels.</a> BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).</li>
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<li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li>
<li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li>
<li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

におけるザイモグラムの現在の技術は、ネイティブ基板の蛋白の検出のためのポリアクリルアミドのゲルへの取り込みに依存します。これらの技術は広く使用いただいて中は、プロテアーゼを検出できる数でまだ限られました。ここでは、プロトコルは、どの蛍光灯、プロテアーゼ分解性ペプチドのポリアクリルアミド ゲルの解決に組み込まれている記述されていた。使用して結合共有結合アジドフェニル PEG3 マレイミド リンカー分子により分離・検出幅広いプロテアーゼのネイティブ基板現在達成可能であるよりも。高度可変蛍光ペプチド性研究者興味の彼らのプロテアーゼを対象とする基板を設計する能力を与えます。さまざまなペプチド ライブラリーを用いたプロテアーゼの識別された多数のペプチド基質とカスタム ペプチド製造商業のソースの数が高まっています。それは適切な蛍光消光を持ち、標準的なバッファーに溶け合うことは新しい蛍光ペプチドを開発することは困難することができます。したがって、ペプチド配列からの商業適応 C 末端のシステインを含むように使用可能な蛍光プロテアーゼの基質はしばしば新しい蛍光センサーの開発に成功した戦略。
このプロ...

ゲル ザイモグラフィーは、体液や細胞培養媒体1,2,3などの生体サンプル中のプロテアーゼ活性を測定する使用生物学的手法です。サンプルは分解性基板が埋め込まれたポリアクリルアミドのゲルを通した電気泳動とその分子量によって区切られます。ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、エラスチン、マトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp)-1、-2、-3、-7、-8、-9、-11、カテプシン1,2のさまざまなの活動を測定するために使用されている一般的な分解性基板が含まれます,4,5,6,7,8. 電気泳動後、酵素 renatured、ゲル内の蛋白質を低下させて。伝統的なゲル ザイモグラフィーでゲルはブルーなどのタンパク質染料で染色、暗い青色の背景にすなわち、白いバンド (タンパク質の分解)、信号の損失としてプロテアーゼ活性を検出します。
ここでは、分解性基質、短い、共有組み込まれて電気泳動法 (図 1) 蛍光ペプチド ゲル ザイモグラフィー法が代替のプロトコルについて述べる。合成ペプチドの分解性基質としての置換伝統的なゲル ザイモグラフィー ネイティブ蛋白質9と比較してプロテアーゼの広い範囲の検出が有効に。蛍光ペプチドの共有結合連鎖ペプチド拡散とゲル電気泳動前メソッド9,10で観察中に移行を防止します。さらに、蛍光基板を使用する追加染色および染色解除手順なしプロテアーゼ活性の直接検出できます。このメソッドの全体的な目標は、共有のザイモグラムおよびゲルの蛍光ペプチド定款による生体試料中のプロテアーゼ活性の検出です。

<table><tbody><tr><td>1.5 mm エンプティゲルカセット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm、10 ウェル エンプティゲルカセット コームズ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS Solution</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x Zymography Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>40% (w/v) アクリルアミド/Bis (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル組織培養プレート</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 遠心フィルターユニット (10 kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンマ</td>ニウム <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Azido-PEG3-Maleimide キット</td><td>クリックケミストリーツール</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ BCA プロテイン アッセイ キット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N' N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 皮下注射針</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>丸底フラスコ (100 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr><tr><td>セプタムラバーストッパー</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>滅菌スリップチップシリンジ (1 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochlroide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Molecular Imager</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>208086</tr></tbody></table>

蛍光ペプチド ザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

このメソッドの目的は、複雑な生物学的サンプルのタンパク質分解活性を測定することです。サンプルは、分解性基板が埋め込まれた解決のゲルを通した電気泳動を用いた分子量で区切られます。このメソッドは、伝統的なゲル ザイモグラフィーと異なり、焼入れ蛍光ペプチド、ゼラチン、カゼインなどの完全な長さの蛋白質ではなく解決のゲルに組み込まれて共有ができます。蛍光ペプチド追加染色手順なしのプロテアーゼ活性の直接検出を使用します。生体試料中の酵素はクリーブ蛍光性の増加の結果、焼入れ蛍光ペプチドです。ゲルの蛍光信号が標準的な蛍光スキャナーで画像化し、デンシトメトリーを用いて定量化します。分解性基質ペプチドの使用におけるザイモグラムを用いて検出可能なプロテアーゼを大きく広げます。

ここで説明した方法を使用して、2 つの蛍光プロテアーゼ分解性ペプチドは、ポリアクリルアミドゲルに組み込まれている: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (テキストと数値で QGIW と略す) と GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2C (テキストと数値で LACW と略す)。↓ は、胸の谷間のサイトを示します。QGIW は、コラーゲンの細胞のコラゲナーゼ14を検出するために設計されたシーケンスを派生しました。LACW は、MMP 14 と MMP 1115の検出用に最適化されているシーケンスです。Dabcyl (クェンチャー) とフルオレセイン (fluorophore) N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) - エステル - を使用してペプチッドが付きますアミン化学11<strong cl...

ここでは、代わりにネイティブ蛋白質分解性基質として蛍光ペプチドを使用する変更におけるザイモグラムの技術のための詳しいプロトコルを提案する.蛍光ペプチド手技で生体試料の電気泳動におけるザイモグラムの前の技術よりも幅広いプロテアーゼの検出が有効にします。

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

現在のザイモグラフィー技術は、限られた数のプロテアーゼを検出します。蛍光ペプチドのザイモグラフィは、分解性基質として蛍光ペプチドを使用し、より広範なプロテアーゼの測定を可能にする。この方法の主な利点は、モジュール設計です。蛍光ペプチドの配列は、どのプロテアーゼが検出されるかを決定し、蛍光ペプチドは、異なる配列のペプチドと容易に交換することができ、他のプロテアーゼを検出する能力である。この技術は、薬物送達や組織工学の用途に使用されるような工学的生体材料における分解性クロスリンカーとしてのペプチドの使用の設計を知らせるのに役立ちます。このペプチドをこの技術に組み込むことで、生体材料分解の原因となる組織分泌プロテアーゼを同定することができる。この手法のデモンストレーションは、他の zymography 技術と比べてユニークな多層アプローチを視覚化するために重要です。この技術を実証する、アメヤ・デシュムク、私の研究室の大学院生。まず、テキストプロトコルの表1に概説されているように、10%ポリアクリルアミド分解ゲル溶液を調製する。ゲルを流す直前に、TEMED と APS を加えます。次いで、溶解ゲル溶液で1.5ミリメートルミニゲルカセットを半分に充填し、空にします。ポリアクリルアミドゲルの上部にイソプロパノールの薄い層を加えて、レベルのゲルを生成し、気泡を防ぎます。残ったポリアクリルアミド溶液を使用して、重合反応の進行を追跡します。チューブ中のポリアクリルアミドが完全に固まった場合、反応は完了する。最初の解決ゲル層が重合している間、Azido-PEG3-マレイミドキットを摂氏20度で貯蔵して、成分が室温に達することを可能にする。次に、DMSOのメーカー推奨容量にバイアル2の成分を溶解する。そして、液体が十分に混合されていることを確認するために30秒間渦。バイアル1の内容物を、攪拌バーを含む清潔で乾燥した100ミリルローターラウンドボトムフラスコに移します。すぐにフラスコの口に注射器で穿刺することができる横隔膜とゴム中隔栓を挿入します。次に、2本の18ゲージ注射針をダイヤフラムに挿入します。注射針の1本を不活性ガスタンクに接続し、ガスが丸底フラスコを3分間満たします。次に、不活性ガスを遮断し、針から取り外します。注射器を使用して、フラスコにバイアル2の完全な内容物を注入する。針と注射器の両方を取り除きます。攪拌しながら、室温で30分間混合させておきます。この後、ゴム中隔栓を取り外し、内容物を清潔な5ミリリットル遠心管に移します。最初の溶解ゲル層が重合したらイソプロパノール層を流し出す。ゲルの上に1ミリリットルの脱イオン水をピレットし、水を注いでゲルをすすきます。チオール機能化蛍光ペプチドを摂氏80度で貯蔵から取り出す。室温で解凍してください。テキストプロトコルの表1に概説されているように、Azido-PEG3-マレイミドリンカー分子と蛍光ペプチドを含む10%リゾルバゲル溶液を調製する。ゲルを注ぐ直前に、TMEDおよびAPSを加える。次に、ゲルカセットの残りの部分の半分をペプチド解決ゲル溶液で満たします。ポリアクリルアミドゲルの上部にイソプロパノールの薄い層を加えて、レベルのゲルを生成し、気泡を防ぎます。残ったポリアクリルアミド溶液を使用して、重合反応の進行を追跡します。反応が完了したら、イソプロパノール層を流し落とします。ゲルの上に1ミリリットルの脱イオン水をピレットし、水を注いでゲルをすすきます。ゲルをすぐに使用しない場合は、摂氏4度で1x PBSの100ミリリットルで満たされたプラスチック製の箱に浸して保管してください。ボックスをアルミホイルで包み、光の漂白を防ぎます。まず、テキストプロトコルの表1に示すように、5%スタックゲル溶液を調製します。ゲルを注ぐ直前に、TMEDおよびAPSを加える。ゲルカセットの残りの空部をスタッキングゲル溶液で満たします。1.5ミリメートルのゲルコームを積み重ねゲル層に素早く挿入し、泡が井戸の下に閉じ込められたままであることを確認します。残ったポリアクリルアミド溶液を使用して、重合反応の進行を追跡します。反応が完了したら、ジェルカセットの背面からくしとテープをそっと取り出します。まず、従来のザイモグラフィーサンプルバッファーにサンプルを溶解する。400ミリリットルos 1XトリスグリセンスSDSランニングバッファをゲル装置に加えます。1ウェルあたり最大35マイクロリットルのサンプルをロードします。1時間半、または分子量基準がペプチド溶解ゲル層内に含まれるプロテアーゼであることを示すまで、摂氏4度で120ボルトでサンプルを実行します。この後、プラスチックカセットからゲルを取り除きます。穏やかな攪拌の下で室温で再成間バッファーでゲルを3回洗浄します。各洗浄で、10分間持続します。ゲルを現像バッファー溶液に 15 分間転送します。その後、新鮮な現像バッファーに溶液を交換し、24時間穏やかな攪拌の下で摂氏37度でインキュベートします。この後、適切な励起フィルターと発光フィルターを備えた蛍光ゲルスキャナーイメージャーを使用して、ゲルをイメージします。本研究では、蛍光プロテアーゼ分解性ペプチドをポリアクリルアミドゲルに組み込む。QGIWは細胞性コラーゲンの検出を目的としたコラーゲン1種の誘導配列で、LACWはMMP-14およびMMP-11の検出に最適化された配列です。蛍光イメージングは、LACWペプチドゲル内の多数のバンドを明らかにします, QGIWゲルでは単一のバンドのみが見られますが.ゼラチンのザイモグラフィーと比較すると、LACWゲルはより多くのタンパク質分解バンドを検出することができ、これはネイティブ基質を使用する従来の方法よりも生物学的サンプル内に存在するより広い範囲のプロテアーゼを検出するペプチドのzymographyの能力を示す。次いで、ペプチドザイモグラフィ細胞は、広いスペクトルMMP阻害剤であるGM6001、または一般的なカテプシン阻害剤であるE64のいずれかを含む開発バッファーにインキュベートされる。GM6001によるLACWペプチドゲルの処理は、バンドの強度を低下させる。E64による治療は識別可能な効果を持っていませんが。GM6001によるQGIQペプチドゲルの処理は、以前に見られたバンドの完全なアブレーションをもたらします。E64は効果がありませんが。ゼラチンザイモグラフィは、精製された活性化MMP-9を用いて行われ、ペプチドザイモグラフィの感度を現在の金本規格と比較する。LACWゲルはMMP-9の最小濃度を検出することができる。プロテアーゼは、再性質と活性化するために特定の条件を必要とします。バッファー溶液を慎重に準備して、組成とPHが正しいことを確認します。この方法は、同一性を検証し、測定されたプロテアーゼのさらなる分析を行う既存の技術によって補完することができる。これには、ウェスタンブロッティング、リアルタイム PCR、質量分析が含まれます。ポリアクリルアミドを取り扱う際は注意してください。非重合溶液は強力な神経毒と考えられ、適切な個人保護具は、それを取り扱うときに常に着用する必要があります.

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蛍光ペプチドザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

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