自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

このプロトコルは、マイクロバイオリアクターから得られた限定サンプルの分析に取り組み、製品の重要な品質属性に関する重要な情報を抽出します。これらの技術のもう一つの利点は、彼らが製造された製品の品質パラメータを決定する主要な属性を決定するために分析の最小時間を使用することです。デモンストレーションの手順は、私の研究室の研究員であるデビッド・パワーズ、タリア・フェイソン、フィリップ・アンガートです。

精製システムに取り付けられたソフトウェアを開き、15ミリリットルの円錐チューブを入れ、精製された抗体溶出物を収集し、50ミリリットル円錐形チューブを配置し、高塩洗浄中のフロースルーを集めて画分コレクターに入れます。次に、0.22マイクロメートルの細孔を濾過した細胞培養液を、キャップノズル付きの空の12ミリリットルシリンジに加えます。キャップを取り外した後、注射器ノズルを精製システムの手動注入口に挿入します。

シリンジをねじって所定の位置で締め、サンプルの全容が注入され、付属の10ミリリットルの大体積サンプルループに見えるまでプランジャーを押し下げます。保存した方法を選択し、計測器ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら[実行]をクリックします。抗体の全てが排除されたら、1つのモルトリスベースで精製したタンパク質を5.5程度のpHまで直ちに中和する。

遠心分離によって精製された抗体を濃縮するには、100キロダルトンフィルターを濾液回収管に入れる。フィルターを500マイクロリットルの二重蒸留水で洗い、次に遠心分離機で洗浄します。フィルター洗浄を2回繰り返します。

2回目の洗浄後、濾液を捨てて、すすいでフィルターを新しい遠心管に移します。次に、遠心分離のために各フィルターに500マイクロリットルのサンプルを加えます。スピンの終了時に、フィルターを新しい回収管に反転し、最終的な遠心分離を伴う濃縮サンプルを得る。

N-グリカン標識および単離の場合、各濃縮抗体サンプルの7.5マイクロリットルを希釈します。15.3マイクロリットルの液体クロマトグラフィー質量分析またはLCMSグレードの水をキットから1ミリリットルのチューブで使用し、酵素に優しく質量分析に優しい界面活性剤を摂氏90度で5%溶液6マイクロリットルで抗体を変性させます。変性の終わりに、サンプルを室温まで3分間冷却してから、1.2マイクロリットルのペプチドN-グリコシダーゼFを加えて50°Cで5分間インキュベーションします。

試料を室温まで3分間冷却した後、無水ジメチルホルムアミドに溶解した12マイクロリットルの蛍光タグ付け試薬を室温で5分間標識します。インキュベーションの最後に、標識したN-グリカン混合物を358マイクロリットルのアセトニトリルで希釈し、親水性相互作用クロマトグラフィープレートをシムと廃棄物トレイを備えた真空マニホールドに入れます。200マイクロリットルの水で井戸を条件に、真空を10~15キロパスカルに調整し、液体が親水性相互作用クロマトグラフィー樹脂を通過するのに15〜30秒かかることを確認します。

各ウェルに各ラベル付きグリカン混合物の400マイクロリットルをロードする前に、15〜30秒間85〜30秒間85〜30秒間の200マイクロリットルのウェルを平衡化し、各新しい液体が添加された後に真空を適用します。すべてのサンプルを添加したら、洗浄1%の1%のギ酸および90%のアセトニトリルの600マイクロリットルで樹脂を2回洗い、600マイクロリットルの回収管で廃皿を取り替え。その後、30マイクロリットルの分光測定溶出バッファーを30マイクロリットルで標識したN-グリカンを解き明かし、アセトニトリルサンプリング溶離液中のジメチルホルムアミド310マイクロリットルでプール希釈液を希釈する。

蛍光検出器と飛行質量分析計の4倍の時間に結合された超高性能液体クロマトグラフィーシステム上の標識されたN-グリカン溶出サンプルを分析するには、移動相に50ミリモルアンモニウムフォーマットおよび100%LCMSグレードアセトニトリルを使用します。初期流量を 1 分あたり 0.4 ミリリットルに設定し、LC 勾配は溶出フェーズ中に増加するアンモニウムフォーマットを提供します。蛍光検出器を設定して、265ナノメートルの励起と425ナノメートルの放出を2ヘルツのサンプリングレートで測定します。

100 ~ 2,000 ダルトンの質量範囲、スキャン時間 0.25 秒、連続データ取得を行う MS1 陽性イオン感度モードへの飛行時間を 4 倍に設定します。次に、サンプルを摂氏 10 度に設定した自動サンプラーにロードし、ロードされたメソッドを実行します。電荷変異体分析の準備のためにサンプルを脱塩するには、0.5ミリリットル脱塩カラムの底栓を取り除き、上部ストッパーを緩め、1.7ミリリットル遠心管に脱塩カラムを入れます。

新しいカラムを新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、1ミリリットル当たり3.5ミリグラムの80マイクロリットルをカラムの上部に追加します。列を元の方向に揃え、柱を遠心分離します。その後、脱塩カラムを捨て、濃縮サンプルを十分に混合します。

96ウェルプレートの単一のウェルに25マイクロリットルの超純水で1ミリリットル当たり2ミリグラムのサンプルを希釈し、5マイクロリットルのラベリングバッファーと5マイクロリットルのラベリング試薬をウェルに加えます。光から保護された室温で10分間のインキュベーションの後、試薬グレードの水60マイクロリットルをサンプルと混合し、遠心分離のためのプレートシールでプレートを覆います。チャージバリアントチップを準備するには、貯蔵溶液を取り外し、井戸1、3、4、7、8、10を水で洗います。

水をpH 7.2のランニングバッファに交換し、750マイクロリットルのランニングバッファをバッファチューブに加えます。インストルメントのユーザーインターフェイスでプレートをアンロードし、96ウェルプレートからシールを取り外します。プレートとバッファーチューブをGX2サンプルトレイの示された場所に挿入し、Load Plate を押します。

チップチャンバーにチップを入れ、蓋をチップチャンバーに閉じ、プロンプトが表示されたらHTタンパク質電荷変種アッセイを選択し、[実行]をクリックします。高速タンパク質液体クロマトグラフィーによる自動マイクロスケールバイオリアクターからの収穫された細胞培養サンプルの精製は、実証されるように、様々な下流の分析方法による精製タンパク質の重要な品質属性の特性を可能にする。マススペクトロメトリーで処理された中国のハムスター卵巣製造モノクローナル抗体からのN-グリカンデータは、これらの代表的なクロマトグラムと同様に見えるはずです。

サイズ排除クロマトグラフィー多角光散乱は、抗体の凝集プロファイルおよび分子量を評価するために使用することができる。少量のサンプルと凝集の重要性は、この技術を自動化されたマイクロバイオリアクターシステムにとって非常に貴重な補完分析ツールにするための重要な品質属性です。マイクロキャピラリーゾーン電気泳動の結果は、電気泳動であり、モノクローナル抗体の電荷変異体プロファイルを示すために使用することができ、操作pHに高感度である、調査されているタンパク質のユニークなシグネチャ。

アミノ酸の消費を監視して、枯渇が抗体の重要な品質属性の変化を引き起こすかどうかを判断することもできます。分析工程は適切に精製されたタンパク質でしか行えることができないため、製造された製品の適切かつ効率的な精製を確実にすることが重要です。製品はまた、ペプチドマッピングおよび安定性試験を受けることができる。

しかし、タンパク質が1つの特性評価方法に使用されると、通常は別のタンパク質には使用できません。これらの技術により、少量の高スループットバイオプロセシングスクリーニングプラットフォームから製造された製品を分析し、バイオプロセシングパラメータが製品品質に及ぼす影響を理解することができます。これらの技術のいくつかは、濃縮過塩素酸、ギ酸、N-ジメチルホルムアミドを使用し、そのすべてが危険であり、適切な保護具を着用しながら慎重に取り扱う必要があります。