Name: 自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶ自動化微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞由来モノクローナル抗体の精製と分析法。限られたサンプル量で重要品質属性を評価し、治療用抗体開発に貢献します。

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著者たちは、スコット・ルーテが提供した分析的支援に感謝したいと思います。この作業に対する部分的な内部資金とサポートは、CDER クリティカル パス プログラム (CA #1-13) によって提供されます。このプロジェクトは、オークリッジ科学教育研究所が運営する米国食品医薬品局(米国食品医薬品局)のインターンシップ/研究参加プログラムへの任命により、一部を支援しています。米国エネルギー省とFDAとの間の機関間協定。

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この出版物は著者の見解を反映しており、FDAの見解や方針を表すものとして解釈されるべきではありません。

HCCFには、高価な計装を詰まらせ、破壊できる破片や大きな粒子が含まれているため、さらに下流処理を行う前に培養を明確化する必要があります。遠心分離は、一般に、細胞および他の不溶性粒子をタンパク質から分離し、その後ろろ過を行う最初のアプローチである。この濾過されたHCCFは、次に精製のために高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を施す。製品を得るために自動化された微生物反応器からのHCCFの精製は、下流処理における重要なステップです。ここで、タンパク質Aカラムを用いたベンチトップFPLCシステムを用いて、HCCFからモノクローナル抗体を得る。上流プロセスの分析は、細胞の挙動に関する有用な洞察を提供し、バイオプロセス設計を導き、一貫性のある信頼性の高い品質の製品を得るのに役立ちます。アナリティクスでは、重要品質属性 (CQA) をアップストリームおよびダウンストリームプロセスにリンクすることもできます。モノクローナル抗体の特性化に一般的に使用される4つのアッセイを紹介します。これらの技術は、堅牢で信頼性が高く、部分的に精製されたさまざまな上流のソースからのプロセスおよび製品分析に容易に展開でき、DNA と HCP の残留レベルが依然として含まれている可能性があります。
分析用のサンプルをクリーンアップする場合、バイオリアクターに存在する変動性を維持しながら、分析に十分にクリーンなサンプルを作成する間に重要なバランスを取る必要があります。製品に影響を与える2つの最も一般的な汚染物質はDNAとHCPで、260/280 nmで比吸光度を測定し、SDS-PAGEまたはμCE-SDSを介して確認することができます。ここで提示されるアッセイは、DNA含有量の低レベルに敏感ではありません。製品の純度は、μCE-SDSによって決定される>95%の純度です。
マイクロキャピラリー電気泳動システムによる電荷バリアント解析は、比較的実装が容易なチップおよび試薬で、電荷バリアントを識別するためのハイスループット方式を提供します。標識試薬の技術の性質と化学は、賦形剤および他の一次アミンに対して敏感であるため、ほとんどのサンプルマトリックスに対して脱塩工程を必要とする。経験から、低レベルのDNAは標識反応からフリー染料と共に移動し、結果の質に影響を与えない。塩基性、主期、および酸性ピーク定量の変動性は一般的に<1%であるが、DNAおよび他の汚染物質のレベルが高いほど、アッセイの変動性が増加する可能性がある。タンパク質標識と一致し、ボトルから取り出し、色素と混合した後のDMFの迅速な使用を確保することが非常に重要です。リジンおよび/またはヒスチジンの標準は、ラベリングコントロールとして推奨されます。時間が経つにつれて、サンプルの品質に応じて、チップはマイクロ流体チャネル上のコーティングを汚れたり失ったりし、より大きなノイズ、ゴーストピークの存在、およびサンプル間のバリエーションの大きな変化につながります。この発生を識別するために、ブランクとシステム適合性基準(すなわちNISTmAb)を定期的にサンプルと同時に分析した。チップの問題が発生した場合は、チップをストレージソリューションで洗浄するか、交換することができます。
治療用糖タンパク質のグリカン分析に用いられる方法は、主に液体クロマトグラフィー(LC)および/または質量分析(MS)を含み、第3の選択肢としてレクチンマイクロアレイ分析が第3の選択肢として人気を集めている。このホワイト ペーパーで説明する方法では、LC と MS の両方を使用しますが、これは利点と欠点があります。質量分析法は、蛍光検出出力またはレクチンマイクロアレイを用いたLCベースの方法では不可能である分析されたグリカンの質量検証の利点を有する。この方法は、LCおよび蛍光検出を使用して、保持時間比較を使用してグリカンIDをデキストランラダー標準に割り当てます。蛍光モニタリングは、オリゴ糖のイオン化効率が悪いため、MSだけでは低い豊富な種を定量することができない場合があり、その検出の容易さのために、感度と定量を増加させることができます。MS からの大量情報はグリカン ID の確認に使用されますが、処理ソフトウェアは一次割り当て基準として大量情報を使用しません。したがって、再現性のクロマトグラフィーおよび容易に解決可能なピークがなければ、この方法はグリカンの割り当てに関して苦しむことができる。幸いなことに、質量情報は、再現可能なグリカンの割り当てを妨げる保持時間のシフトなど、クロマトグラフィーがサブパーである状況でもグリカンの割り当てを助けることができます。この方法を MS なしで使用する場合、質量情報を使用して滞留時間のドリフトを修正できないため、クロマトグラフィーは最高レベルである必要があります。
ここで説明するアミノ酸分析方法は、粗細胞培養培地における未活性化アミノ酸の迅速な定量にLC-MSを利用する。代替アミノ酸分析方法は、UV検出26を可能にするためにアミノ酸誘導化剤を必要とする。LC-MS法は、LC-UV法に対して重要な利点を提供します:それは質量特性の欠如によって制限されるLC-UV法とは対照的に、保持時間とイオン質量の両方に基づいて識別することができます。さらに、LC-MS法は、LC-UV法が時間のかかる誘導性反応を必要とし、サンプル変動27を付与する可能性があるため、時間および再現性の利点を提供する。しかし、LC-MS法における粗細胞培養培地の注入は、イオンスキマーファウリングによるMS信号に有害な影響を及ぼす可能性があります。キャリブレーションラダーは、システム適合性チェックとして頻繁に注入され、サンプル順序はデータの偏りを防ぐためにランダム化されます。
微生物ビオリアクターを用いた抗体産生のための細胞培養プロセスについては、前述9.本研究では、限られたサンプル量から得られたデータを最大化するモノクローナル抗体特性特性法の詳細なプロトコルが明確に定義されている。収穫された細胞培養液の限られた量は、取得した製品情報を制限することができ、製品品質データを得るために適切な分析手順の選択が不可欠である。分析は、上流のプロセス パラメータを製品品質の変化にリンクすることが重要です。ここでは、マイクロバイオリアクターを使用する際にmAbsを特徴付けるガイドラインが提供されています。

タンパク質治療薬は、組織移植合併症、自己免疫疾患、および癌1を含む様々な病状の増大を治療するために使用されている。2004年以来、米国食品医薬品局(USFDA)は、薬物評価研究センター(CDER)によって規制されているすべての承認の生物学的ライセンス申請(BLA)の増加率を文書化し、BLAは25%以上を占めています。2014年と2015年2.
この拡大する市場を考えると、バイオ医薬品メーカーは、一貫した品質でより多くの製品を迅速に提供することに挑戦しています。製品の収量を増やす取り組みは、CHO細胞工学と生産ラインスクリーニングに焦点を当てていますが、最も重要な改善は、メディア/フィード戦略の最適化と細胞培養環境制御1の進歩によるものです。3,4,製造プロセス中に5。
mAbsは生物学的システムで産生されるので、タンパク質の変動が生じやすい。抗体組成物は、グリコシル化などの翻訳後に変更したり、分解または酵素反応によって影響を受けたりすることができます。これらの構造的変化は、危険な免疫反応を引き起こすか、抗体結合を変化させる可能性があり、これは意図された治療機能5を減少または排除することができる。したがって、モノクローナル抗体の臨界品質属性(CQA)-N-グリカンプロファイル、電荷変異分布、および単量体形態の抗体の割合は、品質設計(QbD)アプローチの一部として定期的に監視および制御されます。製造プロセス1,6.規制された生産環境では、治療タンパク質は承認された市販薬として認可される受け入れ基準を満たす必要があります7.本明細書に提示される方法は、典型的には抗体7、8の品質特性特性処理の一部であり、任意のタンパク質科学者はその使用法に精通しているであろう。
先行研究9では、上流バイオプロセッシングにおける細胞培養条件の高スループットスクリーニングのための微生物反応器の適用および操作が記載されている。からからからからからからからこのからからからからそのからからからからからからそのからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからからから様々なグリカン種の存在は、飼料戦略、pH、および温度12などのバイオプロセスパラメータにリンクされている。製品品質に対する様々なメディア条件の影響は、単量体形態で得られたIgGのパーセンテージによって示され、サイズ排除クロマトグラフィー-多角光散乱(SEC-MALS)13,14でも評価される。,15.請求バリアントプロファイルは、製品の機能に影響を与える可能性のある多数の変更16を表します。微小キャピラリーゾーン電気泳動(mCZE)は、電荷変異分析に用いられる従来のカチオン交換(CEX)クロマトグラフィーおよびキャピラリーアイソ電集光(cIEF)法に比べてかなり速い分析時間を提供する技術です17 、18.使用済みバイオリアクター培地は、抗体の同定属性19、20、21、22の変化に関連するタンパク質産生中のアミノ酸消費量を追跡するために分析された。,23.
タンパク質分析により、プロセス入力とCQの変化の関係に基づいて重要なプロセスパラメータ(CPP)を特定できます。バイオプロセス開発では、CPPの特定と測定は、プロセス制御を基本的に実証し、高度に規制された製造環境で不可欠な製品が変更されていないことを保証します。本論文では,製品CQAに最も関連するタンパク質の生化学的特性の一部を測定する分析技術(N-グリカンプロファイル、電荷変異体、およびサイズ均質性)を提示する.

<table><tbody><tr><td>CHO DG44 細胞株</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>Akta Avant 25</td><td>General Electric Life Sciences</td><td>28930842</td><td></td></tr><tr><td>Pro Sep vA ウルトラクロマトグラフィー樹脂</td><td>ミリポア シグマ</td><td>115115830</td><td>精製 固定相</td></tr><tr><td>Omnifit 10cm カラム</td><td>Diba Fluid Intelligence</td><td>006EZ-06-10-AA</td><td>固定相用ハウジング</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>スーパーループ10mL</td><td>GEヘルスケア</td><td>18-1113-81</td><td></td></tr><tr><td>&micro;夜明けの多角度光散乱検出器</td><td>ワイアット</td><td>WUDAWN-01</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & マイクロ;m Millex GV フィルターユニット PVDF メンブレン</td><td>メルク ミリポア</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>10X リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 mL シリンジ</td><td>Covidien</td><td>8881512878</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Binary Pump</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity DAD&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Sampler</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Thermostat</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Thermostatted カラムコンパートメント</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>150 uL ガラスインサート ポリマー脚付き&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2088</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tube</td><td>コーニング社</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Bio-Rad</td><td>127737</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695072</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>BPA996-4</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC BSM</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>18601504612</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC サンプルマネージャー</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>186015000</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC FLR 検出器</td><td>Waters Corporation</td><td>176015029</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 100 kDa 遠心フィルター</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸標準試料、1 nmol/&micro;L&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5061-3330</td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸サプリメント</td><td>Agilent Technologies</td><td>5062-2478</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸アンモニウム溶液 - 糖鎖分析</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>186007081</td><td></td></tr><tr><td>Blue Screw Caps with Septa</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>CD OptiCHO AGT Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1122205</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>エッペンドルフ</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>電荷バリアントチップ</td><td>パーキンエルマー</td><td>760435</td><td></td></tr><tr><td>電荷バリアント試薬キット</td><td>パーキンエルマー</td><td>CLS760670</td><td></td></tr><tr><td>クロマトグラフィー水(MSグレード)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>20673</td><td></td></tr><tr><td>抽出プレート マニホールドOasis 96 ウェルプレート用</td><td>Waters Corporation</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample</td><td>Waters Corporation</td><td>176003712</td><td></td></tr><tr><td>GXII Buffer Tubes</td><td>E&K Scientific</td><td>697075- NC</td><td></td></tr><tr><td>GXII 検出ウィンドウ クリーニング クロス</td><td>VWR</td><td>21912-046</td><td></td></tr><tr><td>GXII HT タッチ</td><td>パーキン エルマー</td><td>CLS138160</td><td></td></tr><tr><td>GXII ラダー チューブ</td><td>Genemate</td><td>C-3258-1</td><td></td></tr><tr><td>GXII リントフリー スワブ</td><td>ITW Texwipe</td><td>TX758B</td><td></td></tr><tr><td>塩酸フィ</td><td>ッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>インタクト mAb 質量チェック スタンダードウォーター</td><td>ズ コーポレーション</td><td>186006552</td><td></td></tr><tr><td>Intrada アミノ酸カラム 150 x 2 mm</td><td>Imtakt</td><td>WAA25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One 微量 UV-Vis 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>840274100</td><td></td></tr><tr><td>Optilab UT-rEX 微分屈折率検出器</td><td>Wyatt</td><td>WTREX-11</td><td></td></tr><tr><td>過塩素酸</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>Chemistry 311421</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels</td><td>Labcon</td><td>1034-960-008</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン 96 ウェル マイクロプレート、F-bottom、チムニースタイル、Black</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder</td><td>Waters Corporation</td><td>186007982</td><td></td></tr><tr><td>スクリュートップ クリアバイアル 2mL</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>383112</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel UP-SW3000 内径4.6mm×30cm L</td><td>東ソーバイオサイエンス</td><td>003449</td><td></td></tr><tr><td>UNIFI科学情報システム</td><td>ウォーターズ</td><td>667005138</td><td></td></tr><tr><td>バキュームマニホールドシム</td>ズ<td>ウォーターズコーポレーション</td><td></td><td></td>186007986</tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-ToF</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>186005597</td><td></td></tr><tr><td>Zeba スピン脱塩カラム、0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

モノクローナル抗体(mAbs)は、今日製造された最も人気があり、よく特徴付けられた生物学的製品の一つです。最も一般的に中国ハムスター卵巣(CHO)細胞を使用して製造され、培養およびプロセス条件は、抗体力中を最大化し、標的品質プロファイルを達成するために最適化されなければならない。通常、この最適化では、自動化されたマイクロスケールバイオリアクター(15 mL)を使用して、複数のプロセス条件を並列にスクリーニングします。最適化基準には、培養性能とモノクローナル抗体(mAb)製品の重要な品質属性(CQA)が含まれており、その有効性と安全性に影響を与える可能性があります。培養性能指標には細胞増殖と栄養消費量が含まれ、CQAにはmAbのN-グリコシル化および凝集プロファイル、電荷変異体、および分子量が含まれます。この詳細なプロトコルでは、自動化されたマイクロバイオリアクターシステムによって生成されたHCCFサンプルを精製し、その後分析し、貴重なパフォーマンスメトリックと出力を得る方法について説明します。まず、自動タンパク質高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)法を用いて、採取した細胞培養サンプルからmAbを精製する。濃縮されると、グリカンプロファイルは、特定のプラットフォームを使用して質量分析によって分析されます(材料の表を参照)。抗体分子量および凝集プロファイルは、サイズ排除クロマトグラフィー-複数角度光散乱(SEC-MALS)を使用して決定され、電荷変異体はマイクロチップキャピラリーゾーン電気泳動(mCZE)を用いて分析される。バイオリアクタープロセス中に捕捉された培養性能メトリック(すなわち、培養生存率、細胞数、グルタミン、グルウズ糖、乳酸塩、アンモニアを含む一般的な代謝産物)に加えて、使用済み培養物は、以下の栄養素を特定するために分析される。供給戦略と全体的なプロセス設計を改善します。そこで、使用済み媒体の液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)によるアミノ酸の絶対定量のための詳細なプロトコルも記載されている。このプロトコルで使用される方法は、多数の小容量サンプルに対応するハイスループット プラットフォームを利用します。

自動マイクロスケールバイオリアクターから採取された細胞培養液は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を用いて精製され、図1に見られるように精製されたタンパク質の臨界品質属性(CQA)は、様々な特徴を持つ。下流の分析方法。これは、自動化されたマイクロバイオリアクターシステムの主な利点です。CQAの違いは、幅広い条件で迅速に評価することができます。質量分析によって処理されるCHO産生mAbsからのNグリカンデータは、図2に示すクロマトグラムのように見えるはずです。この図は、1つのサンプルからのマンノース5ピーク(M5)がかなり低いことを示す2つのクロマトグラム間の比較を示しています。ピークの代わりにノイズの多いベースラインのみが観察される場合は、クロマトグラフィーの設定に障害があるか、手順が正常に行きませんか。コントロールを使用すると、トラブルシューティングを簡略化できます。まず、デキストランラダーからFLRピークを評価します。これらのピークは、クロマトグラフィーシステムが正しく動作していることを示しています。次に、実験的に得られたピークと、処理された無傷のmAb規格から得られたピークを比較する。標準からのピークが表示され、サンプルピークが特定されていない場合、mAbサンプルは正しく処理されませんでした。これは、N-グリカン標識および精製を妨害するバッファー内のSDSまたはヌクレオフィルの存在に起因する可能性がある。
SEC-MALSは、さらに2つのCQA(凝集プロファイルおよび抗体の分子量)を評価するために使用することができる。代表的なSEC-MALSクロマトグラムは、図3に示されているものに匹敵します。分子質量分布と絶対分子量は、消滅係数が1.37mL*(mg*cm)-1、dn/dcが0.185 mL/gの必要なソフトウェアを用いて決定した。ソフトウェアのベースラインのピーク呼び出しと設定は手動で実行されますが、結果はユーザーによって若干異なる場合があります。図3のモノマーIgG1の絶対分子量は1.504 x 105 Da ±0.38%(青)、高次複合体は7.799 x 105 Da±3.0%(赤)です。集体の多分散性は、ピーク1の赤いモル質量分布によって示されるモノマーのそれよりもはるかに大きい(図3)。CQAとしてのサンプルの少量と集約の重要性は、この技術を自動化されたマイクロバイオリアクターシステムに対する非常に貴重な補完分析ツールにします。
mCZEの結果は、モノクローナル抗体の電荷変異プロファイルを示す図4のようなエレクトロフェログラムである。プロフィールは調査される蛋白質のための独特な署名であり、作動pHに非常に敏感である。また、電荷バリアントプロファイルの左側にフリー染料ピークが表示されます。動作pHを確立する場合、オペレータは解像度と信号のバランスをとるいくつかの裁量があります。さらに、オペレータは~30sで移行するフリー染料ピークからの良好な分離を確保する必要があります。サンプルは、このピークを除去するためにラベル付け後に脱塩することができますが、これは信号の大幅な損失につながります。作動pHが確立されると、サンプルプロフィールを比較することができる。一般的に一貫していますが、標識効率の変化や賦形剤の違いは、サンプルの移行と電荷バリアントプロファイルのわずかな違いが生じ、エレクトロフェログラムを直接比較するのが難しくなりかいます。代わりに、比較方法は、通常、基本、主、および酸性種のパーセンテージに基づいています。この場合、mCZEを用いて1〜2%と小さい相対差を同定することができる。
アミノ酸の消費量を監視して、枯渇が CQA の変化を引き起こしているかどうかを判断できます。質量分析計からのクロマトグラム読み出しは、粗バイオリアクター培地サンプル中のアミノ酸の絶対定量のための較正曲線の正常な作成を評価するために使用することができる。図5は、このプロセス中の代表的な結果として、2つの合計イオンクロマトグラム(TIC)と1つの抽出されたイオンクロマトグラム(XIC)を示す。図5Aでは、図5のTICは、水ブランクのみが注入されたとして、バッファシステムからのバックグラウンド信号を示す。図 5Bは、水ブランクと比較すると、個々のアミノ酸種に対応する小さなピーク(7.96分のリジンなど)が観察できるアミノ酸標準の代表的なTICを示す。ピークを統合し、ピーク面積(したがって濃度)の定量を容易にするために、XICは定義された「クロマトグラム質量ウィンドウ」からの信号のみが表示される場所で使用される。器械の感受性およびクロマトグラフィーの分離の質によって、最適な質量窓はユーザーによって決定されなければならない。この例(図5C)では、10ppmの質量ウィンドウを持つリジンのXIC(m/z = 147.1144)が示され、アミノ酸標準のリジンが8.03分でカラムから溶出します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg"> 図 1.高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)技術を用いた精製スキームの代表的なクロマトグラム。体積(mL)に対応する精製方法相は、X軸に沿って標識される。280nm(mAU y軸、実線)での紫外線吸光度は、精製サイクル全体を通して監視される。非特異的結合不純物は、高塩洗浄中に導電性(mS/cm Y軸、破線)を増加させることにより変位する。が表示されます)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg"> 図 2.質量検証されたタグ付きグリカンから得られる代表的な蛍光クロマトグラム。X 軸は保持時間 (分) で、Y 軸は信号強度です。14.94分のピークはマンノース5(M5)グリカンを表し、M5信号強度の間に大きな差がオーバーレイされる2つのサンプル間で観察することができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg"> 図 3.IgG1モノクローナル抗体の分子量分布1x PBS(pH7.4)におけるサイズ排除クロマトグラフィーにより分離された無傷のIgG1モノクローナル抗体のクロマトグラム。吸光度は280nm(黒、左軸)で監視され、光散乱および屈折指数検出器は、各ピーク(赤と青、右軸)の絶対分子量を計算するために使用されました。高分子量種は「HMW」と標識されたピークで示される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg"> 図 4.IgG1モノクローナル抗体の電荷変異プロファイル。この電気フェログラムはmCZEプラットフォーム上で生成される。フリー染料ピークは~30sで移行し、IgG1から十分に分離されています。定量化のために、ピークは計測器データ解析ソフトウェアを使用して、基本、主、酸性種に分割されました。赤い線は、統合されたピーク領域の概要を説明します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg"> 図 5.粗バイオリアクター培地の質量分析ベースのアミノ酸分析のためのイオンクロマトグラムの代表的な結果。X軸は時間(分)、Y軸は信号強度(A)水ブランクは負のコントロールとして機能し、液体クロマトグラフィー勾配(B)225pmol/μLアミノ酸の過程で観察される背景信号を明らかにするこの全イオンクロマトグラムで観察される個々のピークは、クロマトグラフィー的に解決される標準ミックスの異なるアミノ酸を表す(C)mの代表的な抽出されたイオンクロマトグラムを表す、正の対照としてここで使用される。/z 147.1144、リジンです。Bの7.96分のピークは、リジンのCの8.03ピークに相当する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

自動微生物反応器の収穫された細胞培養液(HCCF)からのモノクローナル抗体の精製およびその後の分析のための詳細なプロトコルが記載されている。分析を使用して重要な品質属性(CQA)を決定し、限られたサンプル量を最大化して重要な情報を抽出することも紹介します。

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

このプロトコルは、マイクロバイオリアクターから得られた限定サンプルの分析に取り組み、製品の重要な品質属性に関する重要な情報を抽出します。これらの技術のもう一つの利点は、彼らが製造された製品の品質パラメータを決定する主要な属性を決定するために分析の最小時間を使用することです。デモンストレーションの手順は、私の研究室の研究員であるデビッド・パワーズ、タリア・フェイソン、フィリップ・アンガートです。精製システムに取り付けられたソフトウェアを開き、15ミリリットルの円錐チューブを入れ、精製された抗体溶出物を収集し、50ミリリットル円錐形チューブを配置し、高塩洗浄中のフロースルーを集めて画分コレクターに入れます。次に、0.22マイクロメートルの細孔を濾過した細胞培養液を、キャップノズル付きの空の12ミリリットルシリンジに加えます。キャップを取り外した後、注射器ノズルを精製システムの手動注入口に挿入します。シリンジをねじって所定の位置で締め、サンプルの全容が注入され、付属の10ミリリットルの大体積サンプルループに見えるまでプランジャーを押し下げます。保存した方法を選択し、計測器ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら[実行]をクリックします。抗体の全てが排除されたら、1つのモルトリスベースで精製したタンパク質を5.5程度のpHまで直ちに中和する。遠心分離によって精製された抗体を濃縮するには、100キロダルトンフィルターを濾液回収管に入れる。フィルターを500マイクロリットルの二重蒸留水で洗い、次に遠心分離機で洗浄します。フィルター洗浄を2回繰り返します。2回目の洗浄後、濾液を捨てて、すすいでフィルターを新しい遠心管に移します。次に、遠心分離のために各フィルターに500マイクロリットルのサンプルを加えます。スピンの終了時に、フィルターを新しい回収管に反転し、最終的な遠心分離を伴う濃縮サンプルを得る。N-グリカン標識および単離の場合、各濃縮抗体サンプルの7.5マイクロリットルを希釈します。15.3マイクロリットルの液体クロマトグラフィー質量分析またはLCMSグレードの水をキットから1ミリリットルのチューブで使用し、酵素に優しく質量分析に優しい界面活性剤を摂氏90度で5%溶液6マイクロリットルで抗体を変性させます。変性の終わりに、サンプルを室温まで3分間冷却してから、1.2マイクロリットルのペプチドN-グリコシダーゼFを加えて50°Cで5分間インキュベーションします。試料を室温まで3分間冷却した後、無水ジメチルホルムアミドに溶解した12マイクロリットルの蛍光タグ付け試薬を室温で5分間標識します。インキュベーションの最後に、標識したN-グリカン混合物を358マイクロリットルのアセトニトリルで希釈し、親水性相互作用クロマトグラフィープレートをシムと廃棄物トレイを備えた真空マニホールドに入れます。200マイクロリットルの水で井戸を条件に、真空を10~15キロパスカルに調整し、液体が親水性相互作用クロマトグラフィー樹脂を通過するのに15〜30秒かかることを確認します。各ウェルに各ラベル付きグリカン混合物の400マイクロリットルをロードする前に、15〜30秒間85〜30秒間85〜30秒間の200マイクロリットルのウェルを平衡化し、各新しい液体が添加された後に真空を適用します。すべてのサンプルを添加したら、洗浄1%の1%のギ酸および90%のアセトニトリルの600マイクロリットルで樹脂を2回洗い、600マイクロリットルの回収管で廃皿を取り替え。その後、30マイクロリットルの分光測定溶出バッファーを30マイクロリットルで標識したN-グリカンを解き明かし、アセトニトリルサンプリング溶離液中のジメチルホルムアミド310マイクロリットルでプール希釈液を希釈する。蛍光検出器と飛行質量分析計の4倍の時間に結合された超高性能液体クロマトグラフィーシステム上の標識されたN-グリカン溶出サンプルを分析するには、移動相に50ミリモルアンモニウムフォーマットおよび100%LCMSグレードアセトニトリルを使用します。初期流量を 1 分あたり 0.4 ミリリットルに設定し、LC 勾配は溶出フェーズ中に増加するアンモニウムフォーマットを提供します。蛍光検出器を設定して、265ナノメートルの励起と425ナノメートルの放出を2ヘルツのサンプリングレートで測定します。100 ~ 2,000 ダルトンの質量範囲、スキャン時間 0.25 秒、連続データ取得を行う MS1 陽性イオン感度モードへの飛行時間を 4 倍に設定します。次に、サンプルを摂氏 10 度に設定した自動サンプラーにロードし、ロードされたメソッドを実行します。電荷変異体分析の準備のためにサンプルを脱塩するには、0.5ミリリットル脱塩カラムの底栓を取り除き、上部ストッパーを緩め、1.7ミリリットル遠心管に脱塩カラムを入れます。新しいカラムを新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、1ミリリットル当たり3.5ミリグラムの80マイクロリットルをカラムの上部に追加します。列を元の方向に揃え、柱を遠心分離します。その後、脱塩カラムを捨て、濃縮サンプルを十分に混合します。96ウェルプレートの単一のウェルに25マイクロリットルの超純水で1ミリリットル当たり2ミリグラムのサンプルを希釈し、5マイクロリットルのラベリングバッファーと5マイクロリットルのラベリング試薬をウェルに加えます。光から保護された室温で10分間のインキュベーションの後、試薬グレードの水60マイクロリットルをサンプルと混合し、遠心分離のためのプレートシールでプレートを覆います。チャージバリアントチップを準備するには、貯蔵溶液を取り外し、井戸1、3、4、7、8、10を水で洗います。水をpH 7.2のランニングバッファに交換し、750マイクロリットルのランニングバッファをバッファチューブに加えます。インストルメントのユーザーインターフェイスでプレートをアンロードし、96ウェルプレートからシールを取り外します。プレートとバッファーチューブをGX2サンプルトレイの示された場所に挿入し、Load Plate を押します。チップチャンバーにチップを入れ、蓋をチップチャンバーに閉じ、プロンプトが表示されたらHTタンパク質電荷変種アッセイを選択し、[実行]をクリックします。高速タンパク質液体クロマトグラフィーによる自動マイクロスケールバイオリアクターからの収穫された細胞培養サンプルの精製は、実証されるように、様々な下流の分析方法による精製タンパク質の重要な品質属性の特性を可能にする。マススペクトロメトリーで処理された中国のハムスター卵巣製造モノクローナル抗体からのN-グリカンデータは、これらの代表的なクロマトグラムと同様に見えるはずです。サイズ排除クロマトグラフィー多角光散乱は、抗体の凝集プロファイルおよび分子量を評価するために使用することができる。少量のサンプルと凝集の重要性は、この技術を自動化されたマイクロバイオリアクターシステムにとって非常に貴重な補完分析ツールにするための重要な品質属性です。マイクロキャピラリーゾーン電気泳動の結果は、電気泳動であり、モノクローナル抗体の電荷変異体プロファイルを示すために使用することができ、操作pHに高感度である、調査されているタンパク質のユニークなシグネチャ。アミノ酸の消費を監視して、枯渇が抗体の重要な品質属性の変化を引き起こすかどうかを判断することもできます。分析工程は適切に精製されたタンパク質でしか行えることができないため、製造された製品の適切かつ効率的な精製を確実にすることが重要です。製品はまた、ペプチドマッピングおよび安定性試験を受けることができる。しかし、タンパク質が1つの特性評価方法に使用されると、通常は別のタンパク質には使用できません。これらの技術により、少量の高スループットバイオプロセシングスクリーニングプラットフォームから製造された製品を分析し、バイオプロセシングパラメータが製品品質に及ぼす影響を理解することができます。これらの技術のいくつかは、濃縮過塩素酸、ギ酸、N-ジメチルホルムアミドを使用し、そのすべてが危険であり、適切な保護具を着用しながら慎重に取り扱う必要があります。

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