Name: タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ放射性パルス追跡法による生体細胞でのタンパク質の折り畳み、輸送、および劣化の動態解析。35Sメチオニンとシステインを用いたこの手法は、翻訳後修飾を含むタンパク質生合成の時間的変化を定量的に評価できる。

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著者過去 Braakman ラボのすべてのメンバーに感謝し実りある議論のため、現在、この記事で紹介する手法の開発に役立ちます。このプロジェクトは、欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) N ° 235649 の下で欧州研究評議会とオランダ組織の科学的研究 (NWO) エコー プログラム N ° 711.012.008 の下の両方から資金を受けています。

すべての放射性試薬およびプロシージャは、ユトレヒト大学放射線のローカル規則および規制に従った処理されました。
1. パルス追跡
<ol><li>
付着性のセルのためのパルス追跡 注: ここで指定されたボリュームは、60 mm 細胞培養皿に基づいています。35 mm または 100 mm の皿、1/2 または 2 をそれぞれのボリュームを掛けます。このプロトコルは、0、15、30、60、120、240 分の時間 10 分とチェイスのパルス時間を使用します。これらは、(以下説明) 検討している特定の蛋白質によって変えることができます。<ol>
<li>されるので、6 60 mm 細胞培養皿で付着性のセル (例えば、HEK 293、hela 細胞の町) の種子パルス追跡の日にサブコンフルエント (80%-90%)。時点および/または条件ごとに少なくとも 1 つの料理を使用します。</li>
		<li>必要な場合は transfect 製造元の指示によると市販のトランスフェクション試薬を用いる細胞または、ウイルス8セル 1 前日パルス追跡実験式の適切な構築を変換します。</li>
		<li>2 mL の洗浄バッファー (ハンクの平衡塩溶液 [HBSS]) で皿を洗う、飢餓媒体 (通常培養液など最低限必要な媒体 [MEM] メチオニンとシステインなしメチオニンとシステインおよびウシ胎児血清 [FB] に欠けている 2 mL を追加10 mM HEPES、pH 7.4)、し、15 分間 5% CO2と 37 ° C 加湿インキュベーターに料理を配置します。</li>
		<li>彼らは水と接触がフロートしないようにラック prewarmed 37 ° C の水浴中に皿を転送します。タイマーを起動します。</li>
		<li>40 s、飢餓培地を吸引、パルス解 (飢餓メディア + 55 µCi/35 mm ディッシュ ラベル、1.1.1 のステップの前の注を参照) の 600 μ L をピペットにそっとお皿の中央に追加まさに 1 分繰り返しこの手順 t の 1 分間隔で彼の残りの料理。テスト中に時間を節約する最長のチェイス サンプルを開始します。 注意: 放射性物質を処理する場合、偶発的な露出および/または汚染を防ぐために適切な予防措置及びローカル ルールに従うことが重要です。</li>
		<li>11 分正確に、0 分追跡サンプルを除いて、すべての次の料理の皿に直接追跡中の 2 mL を追加、それを吸引し、再度、チェイス培地 2 mL を追加します。料理の残り 1 分間隔でこの手順を繰り返します。すべての料理を 37 ° C の定温器に転送します。</li>
		<li>16 分丁度で追跡中の 2 mL を追加 (通常培 + 10 mM HEPES 【 ペーハー 7.4、5 mM システインとメチオニン 5 mM) の分類; 停止するパルス媒体上 0 分サンプル皿に直接すぐに吸引、冷却アルミ プレートに皿を転送し、2 mL の冷たい停止バッファー (HBSS + 20 mM Nエチルマレイミド [NEM]) を追加します。 注: これは 0 分追跡サンプルです。このサンプルでは 1.1.9 をステップに進みます。</li>
		<li>各追跡の時間 (例えば、15 分追跡 24 分) 前に各チェイス皿を水風呂 2 分に転送、正確な追跡に (例えば、15 分間追跡の 26 分)、吸引チェイス メディアや pr に続いて場合微量遠心チューブに転送タンパク質分泌) と冷却アルミ プレートに皿を転送します。2 mL の冷たい停止バッファーを追加します。</li>
		<li>≥5 分; 停止バッファー内の氷の上のすべての料理を孵化させなさい停止液を吸引し、冷たい停止液を 2 mL で洗います。洗濯物を吸引させ、換散バッファーの 600 μ L で料理を分離 (リン酸緩衝生理食塩水 [PBS] + nondenaturing 洗剤 [材料表を見る] プロテアーゼ阻害剤 + 20 mM NEM)。料理が定量的分離がように細胞スクレーパーを使用します。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブ ・遠心分離機 15,000-20,000 × gで 10 分間の核をペレットへの 4 ° C にライセートを転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
浮遊細胞の場合パルス追跡 注: 効率的なラベル付けするには、セルが 3 × 106 5 × 106セル/ml の濃度で短パルス ・ チェイス ボリュームは 4 パルス量 x をする必要があります。次の例では、我々 は 10 分の 1 mL の容積の 5 x 10 の6セルをパルス、屈する 5 を追いかける時間時点あたり 1 x 10 の6セルを含む 1 mL の (0、15、30、60、および 120 分) を指します。すべてのソリューションは、セクション 1.1 と同じです。<ol>
<li>時間あたり少なくとも 1 x 10 の6セル ポイントおよび/または条件の実験の時に細胞の十分な数がある、(例えば、3T3 Jurkat) 以前に公開されたプロトコル9によると懸濁液細胞を培養します。</li>
		<li>必要な場合 transfect 市販トランスフェクション試薬製造元の指示に従って細胞またはウイルス8セル 1 前日パルス追跡実験式の適切な構築を変換します。</li>
		<li>室温で 250 x gで 5 分間 50 mL のチューブで条件ごと 5 x 10 の6セルをペレット、洗って飢餓メディアの 5 mL の 1x それらをもう一度、ペレットし、飢餓のメディアの 1 つの mL でそれらを再懸濁します。</li>
		<li>37 ° C の水浴にセルを転送し、10-25 分攪拌チューブ下部に沈降から細胞を防ぐためにすべての 10 〜 15 分のためにそれらをインキュベートします。</li>
		<li>タイマーを開始します。1 分丁度でセルを含むチューブに直接原液ラベルの 275 µCi (55 µCi/106セル × 1) を追加し、混合旋回します。 注意: 放射性物質を処理する場合、偶発的な露出および/または汚染を防ぐために適切な予防措置及びローカル ルールに従うことが重要です。</li>
		<li>11 分丁度でチェイス メディアの 4 つの mL を追加することによって表示を停止します。サンプルをミックスし、すぐに冷たい停止液を 9 mL を含有した氷の 15 の mL の管に 1 mL を転送します。 注: これは 0 分追跡サンプルです。</li>
		<li>連続時間ポイントごとにこの手順を繰り返します。すべての時間ポイントが収集されると、ペレット 4 ° C で 250 x gで 5 分間細胞培地を吸引 (またはタンパク質の分泌に続く場合新しい 15 mL チューブに転送)。洗浄停止液を 5 mL のセルと 4 ° C で 250 x gで 5 分間細胞のペレット</li>
		<li>停止液を吸引、完全に冷えた換散バッファーの 300 μ L で細胞を溶解、完全な換散を確保するため氷の上 20 分間インキュベートします。1.5 mL 遠心チューブ、ペレット、核への 4 ° C で 15,000-20,000 × gで 10 分間遠心するライセートを転送します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 免疫沈降
<ol><li>抗体を結合 (議論を参照) および免疫沈降ビーズ (例えば、蛋白質 A セファローズ) の 50 μ L (10% サスペンション [v] の換散バッファー + 0.25% ウシ血清アルブミン [BSA]) 遠心機でチューブし、シェーカーで 30 分程度、4 ° C でそれらを孵化させなさい。</li>
	<li>常温 12,000 × gで 1 分のビーズをペレットし、上清を吸引します。抗体ビーズ混合物に溶解液 200 μ L を追加し、免疫沈降法が必要な場合, 1 h または頭以上のシェーカーの 4 ° C で > 1 h。</li>
	<li>常温 12,000 × gで 1 分のビーズをペレットします。上清を吸引し、免疫沈降洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。5 分間室温でシェーカーにサンプルを配置します。</li>
	<li>2.3 の手順で説明するように、ビーズをペレットし、洗浄を繰り返し 1 x。上清を吸引し、TE バッファー pH 6.8 (10 mM トリス-HCl、1 mM EDTA) の 20 μ L のビードを再停止しなさい。渦サンプル。</li>
	<li>2x サンプルバッファー還元剤なしの 20 μ L を追加渦、再び 95 ° C、および渦で 5 分間加熱します。 注: 場合にのみ還元サンプルを準備して、2 μ L 500 mM DTT の追加してくださいこの時点で。手順 2.7 に進みます。</li>
	<li>2.3 の手順で説明するように、ビーズをペレットします。500 mM DTT の 1 μ L を含む新鮮な遠心管にケト清 19 μ L を転送、遠心分離機のサンプル、および渦再び 95 ° C で 5 分間加熱すること前に。</li>
	<li>12,000 × g; で 1 分のサンプル スピンダウンします。これは、低下したサンプルです。室温まで冷却し、1 M NEM の 1.1 μ L を減少とケトのサンプルに追加します。渦とスピン ダウン サンプルします。</li>
</ol>3. SDS のページ
<ol><li>まず、割合を決定する適切な SDS-PAGE 解決ゲル蛋白質のための関心の。たとえば、HIV 1 gp120、とき deglycosylated、〜 60 kDa で実行され、7.5% ゲルの分析です。</li>
	<li>製造元の指示に従って TEMED せず解決のゲルの混合物を準備 (375 mM トリス-HCl [pH 8.8,] 0.1% SDS w/v % アクリルアミド x と 0.05% 過硫酸アンモニウム [AP] [w/v]) の真空下でドガと > 15 分。ゲル混合物を脱泡しながら徹底的に 70% のエタノールおよび組織の糸くずのゲルのガラス プレートをきれいにし鋳造装置にそれらを置きます。</li>
	<li>(最終濃度は 0.005% [v]) で解決のゲル混合物に TEMED を追加、混和、およびスタッキングのゲル ~1.5 cm スペースを残してガラス板間のピペットします。慎重に脱イオン H2O またはイソプロパノールでゲルをオーバーレイし、重合しておきます。</li>
	<li>解決のゲル重合は、一度準備スタッキングのゲル混合物 (4% アクリルアミド、125 mM トリス-HCl [pH 6.8] 0.1 %sds [w/v] と 0.025 %aps [w/v])。</li>
	<li>脱イオン H2O 解決のゲルの上をフラッシュし、その後、すべての水を削除します。 注: 最後の滴を削除するのにフィルターを使用します。</li>
	<li>TEMED をスタッキングのゲルの混合物 (0.005% [v]) に追加、徹底的に、ミックスしスタッキングのゲルと解決のゲルをオーバーレイし、15 も櫛を挿入します。スタッキングのゲルの重合が実行中の商工会議所にそれを転送し、バッファーを実行すると上下両院を埋める (25 mM トリス-HCl、グリシン 192 mM [pH 8.3] と 0.1 %sds [w/v])。</li>
	<li>15 レーン minigel の車線ごとにサンプルの 10 μ L をロードします。最初のサンプルとゲルで最後のレーンを読み込まないし、バンドの笑顔を防ぐためにすべての空レーンで非還元サンプル バッファーをロードします。ゲルをランで定数 25 mA/ゲル、ゲルの下に色素フロントまで。</li>
	<li>ゲルをガラス板から削除、タンパク質染色液とゲルを染色 (10% 酢酸と H2O + 0.25% 華麗な 30% メタノール ブルー R250 [w/v]) 撹拌と 5 分のため、脱染め色 (染色液で 30 分間すすぐと鮮やかなブルー R250 せずソリューション)。</li>
	<li>ゲル プラスチックのフェイス ダウンをラップし、それらの上に 0.4 mm の濾紙を入れを配置します。ゲル サンドイッチ クロマトグラフィー紙側を上に置くゲル乾燥機。製造元の指示に従って、ゲル 80 ° C で 2 時間乾燥します。</li>
	<li>カセットに乾燥ゲルを転送し、オートラジオグラフィー フィルムまたは蛍光体スクリーンをかぶせます。オートラジオグラフィー フィルムを使用している場合は、暗い部屋でこの手順を実行する必要があります。</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
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<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
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<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

パルス追跡方法はそのままなセルのフォールディングの科学者の理解を深めるために不可欠されています。できるだけ一般的な方法を提供しようとしている我々 は、折りたたみ、トランスポート、および蛋白質の細胞内中に発生するさまざまなプロセスを研究するバリエーションはほぼ無限の可能性がありますこのアプローチ。
料理の付着性細胞を用いたパルス追跡を実行すると、同じ別料理として、可能な限り各時点および/または実験の条件でそれぞれの料理を治療するために欠かせません。短いパルスとチェイスの時間の特に (< 5 分)、(デジタル タイマー) とパルスとチェイスの倍以上の厳格な制御を維持するために不可欠です。懸濁細胞にパルス追跡は、すべてのサンプルは、単管から取得されます、この変動を減らすために助けることができます。ある細胞のタイプは、培養皿に他よりより少しをよく付着、セルが洗い流されておらず様々 な媒体変更時に確保するため注意が必要があります。懸濁液のこれらのセルを使用するか、または培養皿に細胞を付着するポリ L リジンやゼラチンなどで皿をコーティングすることにより、これを克服することができます。料理の間...

比較的単純なタンパク質の折り畳み多くの折り畳み式の異なる酵素、分子シャペロンと共有結合の変更1が含まれます。膨大な数に関与するさまざまなコンポーネントでは、このこれらのプロセスの in vitroの完全な再構築は実質的に不可能です。したがって、生細胞の生体内でフォールディングの研究に非常に望ましいです。放射性パルス追跡技術は、合成、折りたたみ、トランスポート、および彼らの自然環境におけるタンパク質の分解を勉強するための強力なツールを証明します。
新陳代謝35S] メチオニン ・ システインと短パルス中に蛋白質の分類、放射性ラベルのない状態でチェイスに続いて、新生タンパク質の細胞より広い環境の人口の特定の追跡ができます。ターゲット蛋白質分離を介して免疫沈降をすることができ、経由でSDS のページまたはその他の手法を分析します。多くのタンパク質の SDS ページのゲルの表示変更がセルを介して彼らの旅はマークされます。たとえば、ゴルジ体小胞体 (ER) から糖タンパク質の輸送はしばしば N リンク糖鎖の変更または o-結合糖鎖2,3の追加を伴います。これらの変更は、SDS ページの移動変化によって見ることができる明白な分子量の大きい増加を引き起こします。信号ペプチド胸の谷間などの pro-ペプチドの SDS ページのゲルの4に簡単に続くことができる分子の質量変化により除去の蛋白質分解開裂によって成熟を付けることもできます。放射能はシクロヘキシミド追うなど同等の技術でかなりのメリット新規タンパク質合成ができない長い治療細胞に有毒であるから古い、定常状態のタンパク質の大部分を排除しないと、分析、いくつかのタンパク質の半減期日があります。パンピングの両方の下で蛋白質の比較、ジスルフィド結合形成、多く分泌蛋白質4,5,6,の折り畳み過程における重要なステップの解析条件を減らすことができます7。
ここで放射性パルス追跡方法を使用してタンパク質の折り畳みとそのまま細胞内輸送の分析の一般的な方法を説明します。としてメソッドを提供している間で、プロトコル、可能な限り詳細な適応能力のほぼ無限の可能性を持って、各リーダーの特定蛋白質を研究する最適化できるようになります。
2 つの代替パルス追跡プロトコル、付着性のセル (ここで提示されたプロトコルの手順 1.1) のいずれかと懸濁細胞 (ここで提示されたプロトコルの手順 1.2) の 1 つを提供しています。ここでは、媒体式レベルで表現される蛋白質を可視化するための十分な条件が記載されて。リーダーが使用して不十分に表現された蛋白質または複数の immunoprecipitations などの閉口条件場合皿のサイズを増やすか、携帯番号を適切に必要です。
懸濁液パルス追跡の各時点で追跡サンプルがセルの単管から取得されます。洗浄の手順後、パルスは省略されます。代わりに、さらに35S の設立は、ラベル付けされていないメチオニンとシステインの高い過剰希釈によって防がれます。
示されたプロトコルは細胞の蛋白質折りたたみのプロセスに従うこと放射性35S ラベル システインとメチオニンを使用します。放射性試薬の操作は、オペレーターと放射性放射環境の任意の露出を最小限にし、指定のラボで実行する適切な保護措置を使用して実行する必要があります。パルス追跡として標識法は比較的非効率的短パルス時 (< 15 分)、新生タンパク質に組み込まれている開始放射能量の 1% 未満。免疫沈降を介してターゲットのタンパク質の濃縮、SDS ページのサンプルには放射能の開始量の 0.05% 未満が含まれています。
35S メチオニンとシステインの分類の組合せが安定、揮発性の放射性化合物をもたらすいくつかの分解が発生します。研究者と装置を保護するためにいくつかの注意が取られなければ必要があります。研究者は局所放射線安全規則に従う必要があります常に、マスク、白衣、手袋 (ダブル) ほかを看護炭を着ることがあります。35S メチオニンとシステインのストックのバイアルは、発煙のフードまたはローカル吸引ポイントの下で常に開いてください。知られている実験室汚染スポットは、シェーカー、インキュベーター、水浴ピペット遠心分離機です。活性炭フィルター、肯定的なシール マイクロ遠心チューブ用 (材料の表を参照してください)、水風呂、炭濾紙パルス追跡皿に接着で水族館炭スポンジ ピペット チップを使用して、これらの地域の汚染が減少します。吸引システムとインキュベーターや貯蔵容器に炭の粒を含んでいる皿の配置で炭のガード。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL safeseal 微量遠心チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ</td><td>A6283</td><td>氷酢酸</td></tr><tr><td>BAS 保存蛍光体スクリーン 20x25 cm</td><td>GE ライフサイエンス</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノール ブルー</td><td>シグマ</td><td>B8026</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>Carestream Biomax MR フィルム</td><td>コダック</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td>各種</td><td>N/A</td><td>特定の細胞株用の正常細胞培養培地を使用</td></tr><tr><td>細胞培養培地、メチオニン/システインなし</td><td>各種</td><td>N/A</td><td>通常の培地と同じ培地組成(DMEM/MEM/RPMI、メチオニンおよびシステインを欠くもの)</td></tr><tr><td>チャコール濾紙</td><td>Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>チャコール濾過ピペットチップ</td><td>分子バイオ製品</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>チャコール 真空ガード</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie ブリリアント ブルー R250</td><td>シグマ</td><td>112,553</td><td>電気泳動用</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>分子生物学グレード、500 mM ストックを作成し、-20&nbsp;</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>シグマ</td><td>10197777001</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S タンパク質ラベリングミックス</td><td>パーキンエルマー</td><td>NEG772014MC</td><td>ラベルの他のサイズのバッチは、用途に応じて利用可能です</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>E1644</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>ゲル乾燥装置</td><td>さまざまな</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>グレード 3 クロマトグラフィー論文</td><td>GE Life Sciences</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes デリケート タスク ワイプ</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma</td><td>MX0490&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>メチオニン</td><td>シグマ</td><td>M5308</td><td>分子生物学グレード、250 mMストックを作成し、-20で保存</td></tr><tr><td>ミニゲル鋳造/ランニング機器</td><td>さまざまな</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>シ<td>グマ</td><td>S7653</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>N-エチルマレイミド</td><td>シグマ</td><td>E3876</td>分子<td>生物学グレード、100%エタノールで1Mストックを作成し、-20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ</td>で保存<td>P5368</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>Protein-A セファロース ファストフロー ビーズ</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td> <td>Sigma</td><td>L3771</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>Trizma ベース (Tris)</td> <td>Sigma</td><td>T6066</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>Typhoon IP生体分子撮像装置</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Unwire試験管ラック20 mm、ウォーターバス</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td>用</tr></tbody></table>

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

放射性パルス追跡ラベル構造の成熟、彼らの機能細胞の場所、生きているセルのターゲット蛋白質の分解輸送を研究するための強力なツールです。Radiolabeling 時間 (パルス) を使用して (< 30 分) チェイス回が厳重とフォールディングに従う総蛋白プールの小さい一部分だけをラベルすることが可能です。パンピング/削減 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) と (コンホメーション特異) 抗体で免疫沈降と組み合わせると、プロセスを折りたたみは非常に詳細に調べることができます。このシステムは、分析の可溶性タンパク質、単一および複数パスの膜貫通タンパク質、大きく N と O 糖タンパク質などの性質の巨大な変化とタンパク質とタンパク質豊富なジスルフィドと折りたたみに使用されています接合。パルス追跡方法は、co、翻訳後修飾、重合と重合、基本的に誕生から死への蛋白質の分析が可能などの追加機能の範囲に速度論の根拠です。タンパク質の折り畳みのパルス追跡研究は増加の時間分解能と生理学的情報を提供することによって体外タンパク質研究のため他の生化学的および生物物理学的方法で補完されます。本稿に記載されている方法は哺乳動物または昆虫細胞システムで表現できるあらゆる蛋白質ほとんどのフォールディング研究に簡単に合わせられます。

折りたたみと付着性パルス追跡から HIV 1 gp120 の分泌は、図 2に示すです。Gp120 の酸化的フォールディング パンピング ゲル (セル NR の図) を示しています。パルス入力後すぐに 5 分 (0 分チェイス) gp120 のラベリング ゲルでより高いびまん性バンドとして表示され、チェイスが進むにつれてバンドはゲルによってダウン移行, さらたみ中間体 (IT) それをタイトなバンド (NT) の蓄積まで拡散ネイティブ折り返し gp120 を表します。これには、ジスルフィド結合の形成につれて完全還元蛋白質より速く移行するタンパク質のコンパクトさが発生します。(図のセル R) 削減のゲルのすべての形態の二硫化物結束は常時チェイスに移動は影響しませんように、削減されています。これはその他の変更の分析することができます。Rc に Ru から時間をかけてシフトを表します gp120 の翻訳後の信号ペプチドの開裂: 信号のペプチッドは、追跡中ににつれて、多くのタンパク質ネイティブの倍を達成し、シグナルペプチド...

ここで折りたたみ、トランスポート、および生きているセルで続かれるべき蛋白質の分解の速度論的解析を可能にする一般的なパルス追跡法のためのプロトコルについて述べる。

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

35 S標識メチオニンとシステインを使用した放射性パルスチェイスは、依然として生細胞における時間とともにタンパク質生合成を調査する唯一の生化学的方法です。タンパク質の生合成は、翻訳、折りたたみ、組み立て、人身売買と劣化の両方をカバーしています。放射性パルス追跡と、ジスルフィド結合形成およびアセチル化などの共翻訳後タンパク質修飾の分析と組み合わせることで、タンパク質の信仰を時間とともに調査するための敏感で定量的なアッセイが得られます。この手順では、良い焦点と実験的な処理が必要です。バッファー、放射性ワークスペース、明確なスケジュールなど、良い準備が不可欠です。このビデオは放射性脈拍追跡プロトコルの肩の上に明確な説明を提供する。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のpHd候補であるHui Ying Yeohです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、トランスフェクト細胞および培養細胞をシードします。パルスチェイスの前に、顕微鏡を通して細胞を検査してください。次に、2ミリリットルの洗浄バッファーで皿を洗います。そして、細胞に飢餓培地の2ミリリットルと15分間5%の二酸化炭素と摂氏37度で加湿インキュベーターに料理を置きます。パルスチェイスのセットアップが整っていることを確認してください。水浴場のラックに皿を移し、摂氏37度に事前に温めます。食器が水と接触していることを確認しますが、浮かび上がらないようにしてください。次に、タイマーを開始します。40秒で、飢餓培地を吸引する。マイクロピペットを使用して、600マイクロリットルのパルス溶液を引き出します。ちょうど1分で、皿の中央にパルス溶液を静かに加えます。飢餓培地を取り除き、残りのディッシュのパルス溶液を1分間隔で追加するこのプロセスを繰り返します。ちょうど11分とすべての次の料理のために、パルスチェイススキームによると、ゼロ分チェイスサンプルを除いて、皿に直接チェイスメディアの2ミリリットルを追加します。チェイスメディアを吸引し、新鮮なチェイスメディアの2ミリリットルに置き換えます。残りの皿すべてに対してこのプロセスを 1 分間隔で繰り返します。タイマーが正確に16分を読むとき、パルスメディアの上にゼロ分チェイスディッシュにチェイスメディアの2つのミリターを直接追加して、ラベリングを停止します。すぐに培地を吸引する。冷却されたアルミニウム板に皿を移し、氷の冷たい停止バッファーの2つのミリターを追加します。他のすべての料理を摂氏37度のインキュベーターに移します。各チェイスディッシュをインキュベーターから各チェイス時間の終了の2分前にウォーターバスに戻します。各皿の正確なチェイスタイムで、チェイスメディアを吸引し、冷却されたアルミニウム板に皿を移します。氷冷停止バッファーの 2 ミリリットルを追加します。.すべての皿を氷の上に置き、細胞をライスする時間があるまで緩衝液を停止します。その後、停止溶液を吸引し、すべての皿を洗います。氷冷停止溶液の2ミリリットルと同時に3つ。停止溶液を完全に吸引し、一度に2つの皿に600マイクロリットルの溶解バッファーを加えます。セルスクレーパーを使用して、皿の表面を十分に削り取りますが、そっとlysateを混ぜます。各皿から新鮮な1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにリセートを移します。遠心分離機は、15,000〜20,000Gで4°Cで10分間、核をペレットする。サスペンション細胞のパルスチェイス用に1つの50ミリリットルチューブ内のタイムポイントあたり500万個の細胞を収集する。テキストの説明に従って、飢餓処理を実行します。水浴で15分間の飢餓手順の後、タイマーを開始します。ちょうど1分で、細胞を含むチューブに直接希釈されていないラベルの275マイクロキュリーを追加し、混合するために渦巻きます。ちょうど11分で、ラベリングを停止するためにチェイスメディアの4ミリリットルを追加します。そしてすぐに9ミリリットルの氷冷停止溶液を含む氷上の15ミリリットルのチューブに1ミリリットルを移して、ラベリングを止めます。連続するチェイスタイムポイントごとに9ミリリットルの停止溶液を含む氷上のチューブに1ミリリットルのチェイスを移すこのプロセスを繰り返します。免疫沈降後、最後の洗浄を完全に吸引する。20マイクロリットルのTEバッファーと渦でビーズを再懸濁します。20マイクロリットルの2つのXサンプルバッファーを還元剤なしで追加します。サンプルを渦を出し、摂氏95度で5分間加熱します。再びサンプルを渦。室温で12,000倍Gで1分間遠心分離機を用いた。500ミリモルDDTの1マイクロリットルを含む新鮮なマイクロ遠心チューブに、非減塩上清の19マイクロリットルを移します。必要に応じて、すべての液体が底部になるようにサンプルを素早く遠心分離します。そして、摂氏95度で5分間加熱します。減らされたサンプルを冷やし、次に渦を冷まします。遠心分離機は、1分間室温で12,000倍Gで減少したサンプルと非還元サンプルの両方を1分間、1.1マイクロリットルの1モルNEMをすべてのサンプルに加えます。本研究では、放射性パルスチェイスアプローチを用いて、タンパク質のフォールディングを分析し、無傷の細胞内で輸送する。付着パルスチェイスからのHIV 1 GP120の折りたたみと分泌をここに示す。非還元ゲルは、GP120の酸化フォールディングを示す。パルス標識の直後に、ゲルの中で拡散バンドとして表示されます。追跡が進むにつれて、バンドはGP120でネイティブに折り畳まれたことを表すタイトなバンドに蓄積するまで、さらに拡散フォールディング中間体を通してゲルを下に移動します。これは、二硫化物結合の形成がタンパク質のコンパクト性を高め、完全に減少したタンパク質よりも速く移行する原因となると起こります。還元ゲルでは、ジスルフィド結合とすべての分子が還元され、モビイルティに影響を与えない。したがって、移動性の違いは、分子質量の変化の結果に過ぎません。減少したシグナルペプチドの切断形態から還元シグナルペプチド切断形態への経時シフトは、GP120のトランスレーショナルシグナルペプチド切断を表す。より多くのタンパク質がネイティブフォールドを達成し、そのシグナルペプチドを失うように、チェイス中に増加するシグナルペプチドの損失のために移動度が増加します。非還元および還元ゲルの両方で、GP120の分泌により、信号は約1時間以降に減少し始めます。メディアを分析することで監視できます。この方法は、オルガノイド細胞モデルを含む任意の細胞株に適用可能である。しかし、成功は、目的のタンパク質の発現レベルに大きく依存します。この手順を開始する前に、料理に印を付け、実験を通してこの順序を維持してください。飢餓培地を追加する前に、すべてが準備されていることを確認してください。これが実験の始まりです。そして、あなたのラボの時間はあなたの友人ですが、あなたが準備ができていないときにあなたの最大の敵になることができます。ビルの追跡は、時間とともにタンパク質の完全な財産を調査するために限られたタンパク質分解と組み合わせることができます。また、選択された異なる冷凍庫の方法では、すすいまたは厳格化または電荷差の分析が可能になります。研究者と装置を保護するために、すべての地域の放射線安全規則に従わなければなりません。そして、保護措置はプロトコルに従って取られるべきです。あなたのSTHページに使用されるアクリルアミドは神経毒性であることに注意してください。

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生物化学

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タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

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