Name: 全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶナノポアシーケンスを用いた超長リードDNA配列決定法。ヒト細胞からの高分子量DNA抽出とライブラリ調製により、ゲノム構造変異解析や精密医療への応用が可能となる革新的技術を習得する。

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著者は Y. 朱の原稿で彼女のコメントをありがちましょう。この出版物で報告された研究は、賞を受賞番号 P30CA034196 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所で部分的に支持されました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

原則として、ナノ細孔配列は長さ11,12,13megabase の読み取りに 100 kb を生成すること。4 つの主要な要因はシーケンス処理の実行とデータの品質のパフォーマンスに影響します: 1) アクティブな孔数と; 毛穴の活動2) モーター蛋白質; ナノポアを通過する DNA の速度を制御します。3) DNA のテンプレート (長さ、純度、品質、質量);4) シーケンス アダプター結紮効率は、入力サンプルから使用可能な DNA を決定します。最初の 2 つの要因は、フローセルと、製造元によって提供されるシーケンス キットのバージョンによって異なります。次の 2 つの要因は、このプロトコル (HMW DNA の抽出、せん断および結紮術) で重要な手順です。
このプロトコルには、忍耐と練習が必要です。高分子 DNA の品質は、超長い DNA ライブラリ6にとって重要です。プロトコルは高い生存率と細胞から始まります (> 85% 実行可能なセル優先)、死んだ細胞から劣化 DNA を制限します。避けるべきである (例えば、強い不穏な揺れ、渦、複数ピペッティング、繰り返し凍結、融解) DNA に損傷を引き起こす可能性があります任意の過酷なプロセス。プロトコルの設計、我々 は DNA の抽出のプロセス全体でピペッティングを省略します。大口径のヒントは、ピペッティングが図書館の建設中に機械的剪断とシーケンスの後必要なときに使用する必要があります。孔は商工会議所バッファー12化学物質に敏感な必要がありますいくつかの残留汚染物質 (例えば、洗剤、界面活性剤、フェノール、エタノール、蛋白質 Rna 等) 可能な DNA の。長さと収量を考慮するフェノール抽出法は、これまでテスト複数の異なる抽出法と比較して最高と最も再現性のある結果を示しています。
長い読み取りシーケンスを生成するこのプロトコルの能力、にもかかわらず、いくつかの制限は残っています。まず、このプロトコルに最適化されたパブリケーションの時に利用できるナノ細孔シーケンシング デバイスに基づいてしたがって、ナノポア ベースのシーケンスの選択的な化学に制限され、長いリード シーケンス デバイスの他の種類で実行すると最適ではない可能性があります。第二に、結果は (組織または細胞) の原料から抽出した DNA の品質に大きく依存です。開始の DNA は既に劣化または破損した場合の長さの読み取りが低下します。第三に、QC の複数のステップは DNA の品質をチェックするプロトコルに組み込まれているが最終的な収量と読み取りの長さ、フローセルを受けます、間隙ナノ細孔シーケンシング プラットフォームのこの初期段階で変数となる活動開発。
説明されたプロトコルはここで DNA の抽出のため人間サスペンションのセル行のサンプルを使用します。針シャーリング、トランスポザーゼと結紮時間記述結果を見られる DNA の比率で通過時間を最適化します。プロトコルは、4 つの方法で拡張できます。まず、ユーザーは、他の哺乳類細胞と細胞、組織、臨床サンプル、または他の生物とは異なる金額を開始できます。遠心分離や反応量溶解インキュベーション時間をさらに最適化が必要となります。第二に、超長い読み込みシーケンスのターゲット サイズを予測するは難しいです。読み取りの長さが予想よりも短く、ユーザーは機械的剪断に基づく方法で通過時刻を調整したり、トランスポザーゼ トランスポザーゼの断片化法で見られる DNA の比率を変更できます。クリーンアップ手順を実行時にバインドと溶出時間は、高分子 DNA は粘性の高いので便利です。第三に、異なるナノ細孔シーケンシング デバイスと 1 つは、量と DNA シーケンサーの基準を満たすためのボリュームを調整できます。第四に、シーケンス アダプターに結紮 DNA のみをシーケンスに配置されます。結紮術の効率のさらに 1 つはアダプターとリガーゼ濃度を滴定しなさいを試行できます。変更された結紮時間とペグ18など分子混み合いエージェントは、将来的に適用できます。CRISPR19,20と組み合わせて超長い DNA シーケンス プロトコル可能性がありますターゲット濃縮シーケンスのための効果的なツールを提供しています。

過去 10 年間超並列でかつ精度の高い第二世代高スループット シーケンス テクノロジーは生物医学的発見と技術革新1,2,3の爆発を駆動しています。技術の進歩にもかかわらず第 2 世代のプラットフォームで生成された短鎖リード データは複雑なゲノム領域の解決に効果がないと人間に重要な役割を担うゲノムの構造変形 (SVs) の検出に限られています。進化と病気の4,5。さらに、データの短い読み取りは繰り返し変動を解決することができないおよびハプロタイプが遺伝的変異6段階目の肥えたに適しています。
単一分子の配列を提供しています大幅に長くの最近の進歩を読む長さは、SVs7,8,9の完全なスペクトルおよび複合体の提供正確かつ完全なアセンブリの検出を容易にすることができます。微生物および哺乳類ゲノム6,10。ナノポア プラットフォームは、直接 DNA の通過孔11,12,13を介した現在の変更の測定によって単一分子シーケンスを実行します。ポリメラーゼの反応に依存することがなく、リアルタイムまたは人工に、ナノ細孔シーケンシングが長い (kilobases の何千もの数十) 読み取りを生成とは異なり、任意の既存の DNA シーケンスの化学、DNA サンプルの増幅。したがって、ナノ細孔長い読み低複雑さや繰り返しリッチで特に大きく前進するでしょうゲノム ・ バイオメディカル分析14、100 kb を越えて超長い読み取り距離を生成する (NLR seq) 保持している偉大な約束をシーケンス処理ゲノム15の地域。
ナノ細孔シーケンシングのユニークな特徴は、長いを生成するその可能性を理論上の長さ制限なし読み取りです。したがって、読み取りの長さは DNA の整合性とシーケンス テンプレートの品質によって直接影響を受ける DNA の物理的な長さによって異なります。また、操作やピペッティング力と抽出条件など、関連するステップの数の範囲によって DNA の品質は非常に可変。したがって、ちょうど標準の DNA の抽出のプロトコルや製造元の提供されるライブラリ工法を適用することによって長時間の読み取りを生成する 1 つの挑戦です。これに向けて、堅牢な開発した超長を生成する方法を読む (何百もの kilobases の) 収穫した細胞ペレットから始まるシーケンス データ。DNA の抽出とライブラリの準備の手順で複数の改善点を採用しました。我々 は DNA の劣化や損害賠償を引き起こす不必要な手順を除外するプロトコルを簡素化。このプロトコルは高分子量分画法で構成される DNA の抽出、超長い DNA ライブラリ構築およびナノポア プラットフォームの配列。よく訓練された分子生物学者の通常かかります 6 h セル HMW DNA 抽出、90 分またはライブラリ構築せん断方法によって、DNA シークエンシングのためさらに 48 h までの 8 h の完了するために収穫から。プロトコルの使用はゲノムの複雑性の私達の理解を改善し、人間の病気のゲノムの変化に新しい洞察力を得るためにゲノムのコミュニティに権限を与えます。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>無水エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XPビーズ</td><td>ベックマン</td><td>A63881</td><td>クリーンアップ用磁気ビーズ</td></tr><tr><td>BD 従来の針</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>305136</td><td>27G、機械式せん断用</td></tr><tr><td>BD Luer-Lokシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td></td><td>機械的剪断用</td>309628</tr><tr><td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td>pH 8.0, 0.5 M, 500 mL</td></tr><tr><td>Flow Cell</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106</td><td>R9.4.1</td></tr><tr><td>HG00773 cells</td><td>Coriellこの</td><td>プロトコルで使用される細胞</td><td>HG00733</td>研究所</tr><tr><td>ライゲーションシーケンシングキット 1D</td><td>オックスフォード ナノポアテクノロジー</td>ズ <td>SQK-LSK108</td><td>ナノポアライゲーションキット</td></tr><tr><td>MaXtract 高密度チューブ</td><td>Qiagen</td><td>129073</td><td>ゲルチューブ</td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNAリペアミックス</td><td>NEB</td><td>M6630S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II エンドリペア/dA-テーリングモジュール</td><td>NEB</td><td>M7546S</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td>10X、pH 7.4</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:IAA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td> DNA定量用<td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>蛍光光度計アッセイ</td></tr><tr><td>ラピッドシーケンシングキット</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RAD004</td><td>ナノポアトランスポザーゼキット</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td></td><td>SDS Invitrogen</td><td>AM9822</td><td>10% (wt/vol)</td></tr> <tr><td>塩化ナトリウム溶液</td><td>Invitrogen</td><td>AM9759</td><td>5.0 M</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td>pH 8.0, 1 M</td></tr><tr><td>Triton X-100 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td>~10%</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 サーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1851196EDU</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810R</td><td>エッペンドルフ</td><td>22628180</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 自動セルカウンター</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>磁気ラック</td></tr><tr><td>エッペンドルフ サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5382000023</td><td>インキュベーション用</td></tr><tr><td>このプロトコルで使用される冷凍庫</td><td>LabRepCo</td><td>LHP-5-UFMB</td><td></td></tr><tr><td>GridION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>GridION X5</td><td>ナノポアデバイス</td></tr><tr><td>HulaMixer サンプルミキサー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15920D</td><td>ローテーターミキサー</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離</td>機 <td>ベンチマークサイエンティフィック</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-1000</td><td>UV読み取り用</td></tr><tr><td>Pippin Pulse</td><td>Sage Science</td><td>PPI0200</td><td>パルスフィールドゲル電気泳動装置</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 蛍光光度計</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>蛍光光度計</td></tr><tr><td>冷蔵庫</td><td>LabRepCo</td><td>LABHP-5-URBSS</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>サイエンティフィック・インダストリー</td>ズ <td>SI-A236</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR</td><td>89501-464</td><td></td></tr></tbody></table>

全 genomic dna 分析のための超長いリード シーケンス

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

第三世代の 1 分子 DNA シーケンシング技術提供大幅に長く複雑なゲノムと複雑な構造の変形解析のアセンブリを容易にすることができます長さをお読みください。ナノポア プラットフォームは、直接 DNA の通過孔を介した現在の変更の測定によって単一分子シーケンス処理の実行し、最小限の資本コストでプラスミド (kb) の読み取りの数百を生成することができます。このプラットフォームは、さまざまなアプリケーションの多くの研究者によって採用されています。ナノ細孔シーケンシング プラットフォームの価値を活用する最も重要な因子は、長いシーケンスの読み取り距離を達成するため。超長い読み取りを生成するには、DNA の破損を避けるために、生産的な配列のテンプレートを生成する効率を得るために特別な配慮が必要です。ここでは、超長い DNA の塩基配列など新鮮なまたは冷凍細胞、機械的剪断またはトランスポザーゼ断片化によってライブラリーの構築から高分子量分画法 DNA 抽出とナノポア デバイスをシーケンス処理の詳細なプロトコルを提供します。HMW DNA の 20-25 μ g から 90 100 kb の読み取りトランスポザーゼと長さの N50 媒介断片化、およびメソッドは N50 機械的剪断で 50-70 kb の長さの読み出しを実現できます。プロトコルは哺乳類セルから抽出した DNA の構造変形とゲノムのアセンブリの検出の全ゲノム配列を実行するに適用できます。DNA の抽出および酵素反応の追加改善さらにリードの長さを増やすのユーティリティを展開します。

超長い DNA シーケンス プロトコルは、ライブラリ構築に高分子 DNA を適用します。したがって、それはライブの比率でよく培養細胞を選択する重要です &gt; ステップを収穫セルで 85%。DNA の抽出に使用される細胞の量は、品質と見られる DNA の量に影響します。セル換散は、あまりにも多くの細胞で始まる場合にも動作しません。あまりにもいくつかの細胞を使用しても十分な DNA ライブラリ構築のため生成しません HMW DNA の沈殿物が高速遠心分離ではなく手で緩やかな回転を使用して実行されるため。冷えた 100% エタノールを追加し、回転は図 2に白い綿のような沈殿物として表示されます後 HMW DNA の例です。
ライブラリーの構築を開始する前に入力 DNA の品質をチェックすることが重要です。劣化、不適切な数量、汚染 (例えば、蛋白質、Rna、洗剤、界面活性剤と残留フェノールまたはエタノール)、低分子量 DNA は、以後の手順と長さを読んで最終的に大きく影響を持つことができます。高分子 DNA を含むチューブの 3 つの異なる場所から DNA を使った品質管理分析を実行をお勧めします。UV HMW DNA の結果を読んでから OD260/OD280値は約 1.9 と OD260/OD230値は約 2.3 (図 3 aB)。これらの比の値は良い HMW DNA サンプルの 3 つのテスト間で一貫しています。異なるせん断方法入力 DNA の別のボリュームが必要です。高分子 DNA 濃度は、する必要があります &gt; それはする必要があります一方、機械的剪断の 200 ng/μ L &gt; トランスポザーゼ断片化を 1 μ g/μ L。蛍光光度計で検出された濃度は紫外線を読むより少し低いです。ただし、同じ HMW DNA サンプルの濃度の変動係数は、蛍光光度計とアッセイを読んで UV 15% 未満をする必要です。高分子 DNA を破る針通過数はせん断の DNA のサイズに影響を与えるし、最終的な長さの読み出しに針と注射器を適用する機械的剪断します。針 HMW の DNA の大部分を確保するため剪断が図 4に示すように 50 kb を超えるサイズ QC を実行することをお勧めします。機械的せん断法では、30 のパスは、距離と出力の両方を考慮し、最高の結果を配列を生成しました。
機械的せん断ベース ライブラリの N50 は 50-70 kb トランスポザーゼ断片化ベース ライブラリは 90-100 kb です。HG00733 細胞株を用いた 4 つの実行の結果は、表 1のとおりです。すべての 4 失点がある 100 kb より長い長さで 2,300 以上の読み込み。最大長は長くトランスポザーゼ断片化ベース ライブラリで (455 kb、489 kb) (348 kb、387 kb) 機械的せん断ベース ライブラリと比較して後者を生産合計読み取りより高い利回りを示します。トランスポザーゼ断片化ベース ライブラリ構築、少数のステップおよび短い準備時間少ない短い断片を紹介します。トランスポザーゼを使用して 2 つの実行がより長い平均長さを持っている (&gt; 30 kb) と中央の長さ (&gt; 10 kb)。さらに、データは (平均品質スコアは基本精度約 10.0、~ 90%) のすべての実行で一貫した高品質を示しています。総基地の 97% 以上がデフォルトの設定で Minimap216を使用して人間の参照ゲノム (hg19) に配置されます。Raw 読み取りの予想サイズ分布は、図 5のとおりです。すべての実行トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリが超長い読み取り (例えば &gt; 100 kb) の高い比率を持っている 50 kb 以上のデータの大きい割合があります。このプロトコルは、複数のひと細胞株 (補足表 1) に正常に適用されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig1.jpg"> 図 1: ナノポア長いリード シーケンス (seq NLR) ワークフローの図式的な概観します。オレンジ、複雑な転移。黄緑色、ナノポア アダプター。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig2.jpg"> 図 2: フェノール-クロロホルム抽出法から代表的な DNA の沈殿物です。白い矢印は、高分子 DNA を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig3.jpg"> 図 3: UV 読書から見られる DNA の例 QC 結果。(A) HMW DNA ステップ 1.21.1 機械的剪断に基づく図書館の建設の準備ができてから。(B) HMW DNA 1.21.2 トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリ構築のためのステップから。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig4.jpg"> 図 4: 針の品質管理結果が脈打フィールドゲルの電気泳動による高分子 DNA をせん断します。L1: クイック ロード 1 kb の DNA の梯子;L2: クイック ロード 1 kb 拡張 DNA の梯子。1-8: 針シャーリングにより異なる通過タイムが付いている DNA。1-3、せん断;4、10 回5、20 回6、30 回7、40 倍8、50 回。この QC 手順はオプションです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58954/58954fig5.jpg"> 図 5: ナノポア超長い DNA ライブラリのサイズ分布を予想します。MS、機械的せん断ベース ライブラリ。TF、トランスポザーゼ断片化ベース ライブラリ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58954/58954fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>機械 shearing_rep1</td>
			<td>機械 shearing_rep2</td>
			<td>トランスポザーゼ fragmentation_rep1</td>
			<td>トランスポザーゼ fragmentation_rep2</td>
		</tr>
<tr>
<td>セルライン</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
			<td>HG00733</td>
		</tr>
<tr>
<td>読み取りの N50</td>
			<td>55,180</td>
			<td>63,007</td>
			<td>98,237</td>
			<td>95,629</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 Kb を超える読み取りの数</td>
			<td>2,500</td>
			<td>3,082</td>
			<td>2,386</td>
			<td>2,355</td>
		</tr>
<tr>
<td>合計読み取りの数</td>
			<td>97,859</td>
			<td>80,465</td>
			<td>24,166</td>
			<td>21,032</td>
		</tr>
<tr>
<td>最大長さ (bp)</td>
			<td>348,482</td>
			<td>387,113</td>
			<td>454,660</td>
			<td>489,426</td>
		</tr>
<tr>
<td>平均長さ (bp)</td>
			<td>17,861</td>
			<td>20,395</td>
			<td>33,528</td>
			<td>38,175</td>
		</tr>
<tr>
<td>中央の長さ (bp)</td>
			<td>5,335</td>
			<td>5,894</td>
			<td>10,249</td>
			<td>15,656</td>
		</tr>
<tr>
<td>読み取りの平均品質</td>
			<td>10.0</td>
			<td>10.1</td>
			<td>9.9</td>
			<td>10.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Raw 読み取りの総基盤</td>
			<td>1,747,849,822</td>
			<td>1,641,058,932</td>
			<td>810,229,733</td>
			<td>802,886,304</td>
		</tr>
<tr>
<td>一直線に並べられた読み取りの総基盤</td>
			<td>1,693,300,832</td>
			<td>1,607,975,925</td>
			<td>791,422,077</td>
			<td>778,417,627</td>
		</tr>
<tr>
<td>マップされた比総基盤 (hg19、Minimap2)</td>
			<td>96.9%</td>
			<td>98.0%</td>
			<td>97.7%</td>
			<td>97.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>アクティブな毛穴の数</td>
			<td>1225:480, 402, 254, 89</td>
			<td>1058:480, 356, 176, 46</td>
			<td>958:452, 328 148, 30</td>
			<td>1092:487 367, 195, 43</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: パフォーマンス メトリックの概要は、せん断の異なるプロトコルで実行されます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ライブラリ 1</td>
			<td>ライブラリ 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>セルライン</td>
			<td>K562</td>
			<td>GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>発注情報を携帯します。</td>
			<td>ATCC、猫。違います。CCL-243</td>
			<td>コーリエル医学研究所は、猫。違います。GM19240</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロトコル</td>
			<td>機械的剪断</td>
			<td>機械的剪断</td>
		</tr>
<tr>
<td>読み取りの N50</td>
			<td>60,063</td>
			<td>55,295</td>
		</tr>
<tr>
<td>合計読み取りの数</td>
			<td>193,783</td>
			<td>120,807</td>
		</tr>
<tr>
<td>中央の長さ (bp)</td>
			<td>1,843</td>
			<td>4,688</td>
		</tr>
<tr>
<td>平均長さ (bp)</td>
			<td>9,825</td>
			<td>17,408</td>
		</tr>
<tr>
<td>最大長さ (bp)</td>
			<td>548,780</td>
			<td>212,338</td>
		</tr>
<tr>
<td>Raw 読み取りの総基盤</td>
			<td>1,903,989,686</td>
			<td>2,103,015,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>一直線に並べられた読み取りの総基盤</td>
			<td>1,837,350,047</td>
			<td>1,997,419,761</td>
		</tr>
<tr>
<td>マップされた比総基盤 (hg19、Minimap2)</td>
			<td>96.6%</td>
			<td>95.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>アクティブな毛穴の数</td>
			<td>1111:482, 371, 203, 55</td>
			<td>1032:447, 333, 196, 56</td>
		</tr>
</tbody></table>補足の表 1: 機械的せん断プロトコルと他のセルラインを使用して 2 つの NLR seq 実行の概要。

長い読み取りシーケンス大きく複雑なゲノム構造の変化の特徴付けとアセンブリを容易にします。ナノポア ベースのシーケンスのプラットフォームで超長いシーケンスを生成する方法について述べる。アプローチは、人間の細胞から中程度の範囲でプラスミド読み取りの数百人を生成する変更したライブラリの準備に続いて最適化された DNA の抽出を採用しています。

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

このプロトコルは、超長いシーケンス配列を生成する能力の技術的なギャップを埋めます。ゲノミクスにおける現在の短期読み取りアプローチによって制限されているゲノムの複雑さを調べることができます。この方法は、性能、堅牢性、汎用性、および有望な新しいアプリケーションと統合する可能性においてユニークです。それは異なった材料に適して、異なった即刻サイズのために変調することができる。この技術は、臨床環境に革命を起こす始めました。繰り返し膨張障害におけるその診断の有用性は多くの現在の欠点を克服した。いくつかの移植登録は、より良い臨床結果のために高解像度HLAタイピングを利用しています。これらのメソッドは、フェージングや複雑な構造分散など、これまでアクセス不可能な長距離情報を提供します。単一のテストでエピジェネティック読み出しと相まって、精密医療を可能にします。これは、多くの新しい技術を持つ長いプロトコルであり、最終的なシーケンシングまで動作しているかどうかを知るのは難しいです。サンプルを実行する前に、古いフローセルにロードする練習をすることをお勧めします。協力者は、いくつかの技術は短読のアプローチに比べて混乱していると言いました。具体的には、高い品質、高分子量DNAによる抽出が緩やかである。HMW DNAの抽出を開始するには、まず、細胞懸濁液の200マイクロリットルを50ミリリットルチューブの10ミリリットルのリシスバッファーに加えます。その後、3秒間最高速度で渦を起こします。そして、1時間摂氏37度で溶液をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、2マイクロリットルのRNS-Aをライセートに加える。50ミリリットルのチューブをそっと回してサンプルを混ぜ、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール混合物のフェノール層の10ミリリットルをリセートに加える。そして、フュームフードの下に10分間、20 rpmで回転器の上にチューブを置きます。ゲルチューブで遠心分離した後、上清を新しい50ミリリットルチューブに慎重に注ぎます。その後、25ミリリットルの氷冷100%エタノールを加え、DNAが沈殿するまでチューブを手で軽く回転させます。フックを作るために20マイクロリットルの先端を曲げる。フックを使用して、HMW DNAを慎重に取り出し、液体を落とします。次に、70%エタノールの40ミリリットルを含む50ミリリットルのチューブにDNAを入れ、チューブを3回軽く反転してDNAを洗浄します。機械的剪断ベースのライブラリを準備するには、まず100ミリリットルの針を含まない注射器を使用して、すべてのDNAを熱望します。その後、注射器に27ゲージの針を置き、すべてのDNAを優しくゆっくりと皿に排出します。29回繰り返します。次に、再懸濁された磁気ビーズの143マイクロリットルと143マイクロリットルのDNA修復反応混合物をチューブに加える。チューブを6回フリックして穏やかに混ぜ、20rpmの回転器に30分間チューブを置きます。チューブを室温で2秒間遠心分離し、サンプルをスピンダウンし、チューブを磁気ラックに10分間置きます。次に、チューブがラック上にある間に上清を捨てます。400マイクロリットルの作りたての70%エタノールを加えます。30 秒間待ちます。その後、エタノールを除去します。次いで、チューブを1000Gで室温で2秒間遠心し、試料を回転させます。チューブを磁気ラックに戻し、残留エタノールを取り除きます。ペレットを30秒間エアドライします。次に、マグネットラックからチューブを取り外し、103マイクロリットルのT-Eバッファを追加します。次に、ビーズがバッファーに覆われていることを確認するためにチューブを軽くフリックし、30分間室温で回転器にチューブを置きます。最後に、チューブを磁気ラックに10分間戻してビーズをペレットにします。P200ワイドボアチップを使用して溶出液の100マイクロリットルを0.2ミリリットルチューブに移し、dA-tailingおよびアダプタライゲーション反応を終了修復に進みます。トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリを調製するために、まず、HMW DNAの22マイクロリットル、10ミリモルトリスの1マイクロリットル、pH 8、0.02%トリトンX-100、断片化ミックスの1マイクロリットルを0.2ミリリットルチューブに加えてDNAタグメント反応を行う。次に、P200ワイドボアチップを使用して反応を6回混合し、摂氏30度で1分間インキュベートし、続いて摂氏80度で1分間インキュベートします。摂氏4度で保持します。最後に、P200ワイドボアチップを使用して、反応を1.5ミリリットルのチューブに移し、1マイクロリットルのラピッドアダプターミックスを素早く追加します。P200ワイドボアチップを使用して、反応を6回混合します。反応を室温で1時間インキュベートし、シーケンシングに進みます。シーケンスを開始するには、まず Nanopore デバイスのチャネルの 1 つに新しいフローセルを挿入します。次に、付属のシーケンス制御ソフトウェアで、フローセルの位置ボックスを確認します。正しいフローセルタイプを選択し、チェックフローセルのワークフローをクリックします。[テスト開始]ボタンをクリックして、フローセルQC解析を開始します。次に、P1000ピペットを100マイクロリットルに設定して、30マイクロリットル未満のバッファーを引き戻し、フローセルから気泡を除去する。気泡を導入しないようにプライミングポートの上部をカバーするためにプライミングミックスの30マイクロリットルを追加します。次いで、プライミングポートにプライミングミックスのピペット800マイクロリットルをフローセルをロードする。約50マイクロリットルのプライミングミックスが残っている場合は先端を取り出し、残りのプライミングミックスをプライミングポートの上部に追加します。次に、P1000ピペットを使用して、フローセルにプライミングミックスの200マイクロリットルを加えます。次に、ロードの直前に、80マイクロリットルに設定されたP200ピペットを使用して、DNAライブラリを6回上下にピペットします。最後に、ライブラリミックスをサンプルポートを通してフローセルにドロップワイズロードし、シーケンス処理とデータ分析に進みます。機械的剪断ベースのライブラリ構築に対応できるDNAのQC分析により、約1.9の純度比は260~280、260~230の比は約2.3で、良好なDNAサンプルを示しました。同じ結果は、DNAレディ・フォー・トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリ構築を使用して見られた。パルスフィールドゲル電気泳動による針状HMW DNAのサイズ品質管理は、HMW DNAの大部分が50キロベースより大きいことを示した。HG00733セルを用いた4回の実行の結果は、機械的剪断ベースのライブラリのN50がトランスポザーゼ断片化ベースのライブラリよりも短いことを示した。また、4つのランはすべて100キロベースを超える長さの2300以上の読み取り値を持っていました。トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリでは、機械的なせん断ベースのライブラリと比較して、準備時間が短い長さが最大長でした。機械的せん断ベースのライブラリは、トランスポザーゼの断片化ベースのライブラリと比較して、より多くの総読み取りを生成し、より高い収率を示しています。両方のライブラリは一貫した高品質を示し、その総塩基の97%以上がヒト参照ゲノムと一致していた。予想されるサイズ分布は、4つのランすべてが50キロベースを超えるデータの割合が大きく、トランスポザーゼの断片化ベースのライブラリは超長い読み取りの比率が高いことを示しました。全体的な目標はDNAをそのまま維持することですので、DNAの過酷な取り扱いを避けることが重要です。メソッドの値を最大化できる重要な要因は、計算分析です。私たちのチームは、高感度でSVの全範囲を検出できるPICKYと呼ばれる長時間読み取り分析パイプラインを開発しました。これは、複雑なSVを検出し、単一分子レベルでの再調整や修正を行うなどのエキサイティングな分野への新しい道を開きます。これはゲノムアーキテクチャの理解を大きく向上させます。フェノールは非常に腐食性です。手袋、安全メガネ、ラボコート、ロングパンツ、シューズなど、個人的な保護具を備えたヒュームフードで作業する必要があります。

ultra-long-read-sequencing-for-whole-genomic-dna-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、高スループットシーケンシング（DamID-SEQ）に、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ識別（DamID）を結合することにより、本明細書のアッセイを説明します。この改良された方法は、より高い解像度、より広いダイナミックレンジを提供し、可能にする等のChIP-seqの、RNA-配列などの他のハイスループットシークエンシングデータと併せてDamID、配列データを分析します...

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。...

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

ここで説明されているのは、長期のゲノムシーケンシングに使用するための、偏在する生物栄養性真菌病原体であるうどんこ病からのゲノムDNAの抽出、精製、および品質管理の方法です。...

ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製

本稿では葉緑体 ER 以下の低頻度の変異を検出するための手法を説明しますこのメソッドは、2 方向エラー訂正、特別なバック グラウンド...

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々...

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

顕微鏡の有機体のゲノムのシーケンス処理中に汚染大きい問題に残る。ここでは、汚染のリスクを最小限に抑えるため全ゲノム増幅 DNA のわずか 50 pg...

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

このプロトコルの目的は、ベンチの研究と計算の組み合わせを使用して、可能性がありますのみ部分的に知られている共同浄化のシーケンスから容易に分離できない新規シーケンスを検索することです。...

減法混色のゲノム解析による新規シーケンスの発見

ナノポアシーケンシングは、遠隔地でのコスト効率の高いシーケンシングと、リソースの乏しい設定を可能にする新しいテクノロジーです。ここでは、このような条件に適合する全血からの mRNAs...

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

このプロトコルは、尿細菌の培養、シーケンシング、および デノボ...

短読シーケンシング技術を用いた尿細菌の完全ゲノム生成のためのハイブリッド デノボ ゲノムアセンブリ

このプロトコルは、ロングリードシーケンシングプラットフォームを使用して結 核菌...

ロングリードシーケンシング技術を用いたアンプリコンシーケンシング

学ぶナノポアシーケンスを用いた超長リードDNA配列決定法。ヒト細胞からの高分子量DNA抽出とライブラリ調製により、ゲノム構造変異解析や精密医療への応用が可能となる革新的技術を習得する。

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