Name: 7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶ 2色フローサイトメトリーによる7種類の免疫細胞サブセット識別法。CD4+・CD8+T細胞、NK細胞、B細胞、単球などを検出し、5つの追加マーカー記録で複雑な細胞集団の深層免疫フェノタイピングを実現します。

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本研究は国立関節炎研究所と筋骨格系と皮膚病によって支持された < https://www.niams.nih.gov/>、受賞番号 P30-AR053503;ステイブラー財団、www.stablerfoundation.org;国立研究所のアレルギー ・感染症、www.niaid.nih.gov、T32AI007247。ニーナ アイルランド プログラム肺健康 (NIPLH) の https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/。

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ここで提示されたプロトコルは、非常に柔軟で染色バッファー、温度およびセル表面のマーカーを系列の高発現による末梢血細胞作製の変化に鈍感に示されています。高品質で再現性のあるデータを取得するための最も重要なステップは、抗体価は。注記のうち、抗体の滴定はフロー フローサイト メーター パネルのセットアップ中に常に実行する必要がありますのでこの手順に追加されませんベンチ延長戦 2 螢光色素取り組み。抗 CD3 の滴定-CD8,-CD14-CD19 と TCR の γδ 最大指数13,14を染色によって派生した最適な正と負のピークを分離する抗体の濃度を標準的な手順に従います。ピークまたは汚れ指数曲線の立ち上がり側のピークに近いで希釈する必要があります (図 1 a・ C) を選択します。その一方で、抗 cd4 抗体と抗 CD56 抗体のアドホック滴定を実行する必要。抗 CD4 抗体が CD3 単一肯定的な人口と CD3 の CD4 の肯定...

フローサイトメトリーは、1秒あたりのイベント数千の速度で単一の粒子に複数のパラメーターを分析するために開発された手法です。フローサイトメトリーで分析した試料の例などが、セル、ビーズ、細菌、小胞および染色体に限定されません。流体システムは、各パーティクルのパスと交差する 1 つ以上のレーザーさらに分析に複数のパラメーターが記録されます尋問時点で粒子を指示します。純粋なレーザ光の散乱によって生成された前方および側面分散はターゲット人口を識別し、それぞれの相対的なサイズおよび粒子の内部複雑さ/粒度に関する情報を取得に使用されます。すべて他のパラメーター、フローサイトメトリー解析データの大部分を占める、蛍光標識プローブを認識し興味の粒子に特定のターゲットをバインドによって派生します。
フローサイトメトリーは、識別し、特徴付ける細胞集団を免疫学的研究のための主要なツールです。免疫システムの複雑さを分析するには、多色パネルは同時にセル人口1の深い診療の記録のマーカーの数を拡大して常に進化してください。最近のハイエンドの流れの cytometers 20 蛍光パラメーターを超えるとより可能な器械と、蛍光色素の開発につながるためです。これは、結果、螢光色素のスペクトルの重なりによる複雑な研究デザインとカスタム抗体ラベル、熟練したオペレーターに関連付けられているコストが高くつきます。いくつかのインスタンスの異なる細胞集団のマーカーの別のパネルを使用して、複雑さとコストを削減することが。このアプローチは、エラーを起こしやすいは、各パネルの情報を削減し、細胞の限られた数のサンプルに適用することは困難。また、マーカーの数を増やすと、蛍光パラメーターを少なく楽器の深い診療ができなくなります。我々 は以前主要な人間の免疫の人口を識別する汚損のプロトコルを開発した (CD4+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、単球) を使用して 7 つの系列マーカーを組み合わせることによって末梢血単核球 (PBMCs) で7 つではなく 2 つだけ螢は、伝統的な「1 つの螢光色素 1 つマーカー」アプローチ (www.hcdm.org)2,3を使用して必要です。私たちの最初の報告は、探検し、深い診療の種類の蛍光色素で 7 マーカーを組み合わせることの概念を検証します。本報告では実用的な面に焦点を当て、汚損の成功を達成するために手順をトラブルシューティングの特定末梢血細胞を染色しステップバイ ステップ プロトコルを提案します。
このプロトコルは、系統マーカーが細胞表面に定数式をあることおよび各細胞集団が系統マーカーの排他的な組み合わせの観察に基づいています。PBMCs、CD3 式は 2 つの主要カテゴリに免疫細胞を細分化: CD3 陽性 T リンパ球と CD3 陰性細胞。CD4 CD3 陽性サブグループ+、CD8+ γδ T 細胞は CD4、CD8、γδ 受容体をもっぱら対象とする抗体を使用して分けることができます。CD3 陰性サブグループ内の同等の方法で B 細胞、NK 細胞、単球識別できます CD19、CD56 と、CD14 抗体をそれぞれ使用しています。標準的な 1 つの螢光色素 1 つマーカー アプローチで抗 CD3-CD4,-CD8、CD14、-7 つの異なる蛍光色素で CD19 の CD56 と TCR の γδ 抗体が検出されました。我々 のアプローチを組み合わせた抗 CD3-CD56、および 1 つの螢光色素 (利便性螢光色素 A のラベル付き) と抗 CD4, TCR γδ 抗体-CD8、CD14 と - 別の螢光色素 (螢光色素 B) CD19 抗体。これは差動抗原の発現と抗体価の組み合わせで可能です。CD4+および CD8+ T 細胞は螢光色素 B アドホックの滴定で、CD8 の間に CD4 信号を配置しながら CD8 信号の表現を最大化することで分離することができますが、螢光色素に抗 CD3 抗体陽性とCD3 陽性 cd4 陽性/陰性 CD8 陰性細胞。Γδ T 細胞は CD4、CD8 より高いレベルの CD3 を表現、したがって CD3 高い4として識別できます。ラベリングの γδ T 細胞の CD3 低 T 細胞, CD3 高 γδ T 細胞間の分離を向上させる、抗 TCR γδ 抗体を用いた螢光色素 A がこの信号を増幅さらに。B 細胞は CD3 として識別することができます-螢光色素 A と CD19+ B. 螢光色素でB 細胞から CD3 陰性 NK 細胞を分離するには、アンチ CD56 抗体は抗 CD3 として螢光色素 A で使用されました。CD56 は5T 細胞の CD3 よりもはるかに低いレベルで NK 細胞で表されるので、これは可能です。最後に、単球は前方側方散乱プロパティおよび螢光色素 B. の CD14 の式の組み合わせで識別できます。
種類の蛍光色素を使用して最大 4 つのマーカを組み合わせるアイデアは6、7、8、前に既に正常に試みられて、そして悪性リンパ球集団9 を識別するために臨床プロトコルで使用されています.以前のレポートはまた 7 つのマーカーを組み合わせる (マーカーから異なる特異性を持つプロトコルを用いてより)10螢光色素の変化量各抗体の複雑な分類に依存して 2 つ螢、このアプローチを使用して。これは市販の抗体を使用して私たちのメソッドとは対照的し楽器構成に合わせることができる、高分子螢の新世代の利点を取ることができます。
この方法論の全体的な目標は、複雑な細胞集団を尋問できるように 5 つの追加のマーカーの記録のほとんどの流れの cytometers の光の限界を拡大することです。結果として、手頃な価格の 6-10 の螢光色素の流れの cytometers で実行できる高度な免疫学的解析と 2-3 螢光色素フィールド機器が限られた資源での分野で顕著な結果を達成できます。ハイエンド機器のこのアプローチからより深い流れフローサイトメトリー分析を達成するために、同じ時間11時いくつかの系統をターゲット フローサイト メーター パネル モジュール フローを作成する余分な蛍光色素を使用していただけます。これは潜在的モジュラー診療フローサイトメトリーで使用されるパネルの数を削減し、コスト、エラーと処理時間を削減できます。このアプローチはまた細胞の限られた数の臨床サンプルの場合適しています非常によくです。

<table><tbody><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>562426</td><td>Antibody for staining RRID: AB_11152082</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>562751</td><td>Antibody for staining RRID: AB_2732054</td></tr><tr><td>TCRgd</td><td>BD Biosciences</td><td>331217</td><td>Antibody for staining RRID: AB_2562316</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555347</td><td>抗体 for staining RRID: AB_395752</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555367</td><td>抗体 staining RRID: AB_395770</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td>Antibody for staining RRID: AB_395799</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>Antibody for staining RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>555335</td><td>Antibody for staining RRID: AB_398591</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>Antibody for staining RRID: AB_398601</td></tr><tr><td>TCRgd</td><td>BD Biosciences</td><td>331211</td><td>Antibody for staining RRID: AB_1089215</td></tr><tr><td>CCR7</td><td>Biolegend</td><td>353217</td><td>Antibody for staining RRID:</td></tr><tr><td>AB_10913812 CD45RA</td><td>BD Biosciences</td><td>560674</td><td>Antibody for staining RRID: AB_1727497</td></tr><tr><td>CCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>561034</td><td>Antibody for staining RRID: AB_10563066</td></tr><tr><td>CCR6</td><td>BD Biosciences</td><td>353419</td><td>Antibody for staining RRID: AB_11124539</td></tr><tr><td>CXCR3</td><td>BD Biosciences</td><td>561730</td><td>Antibody for staining RRID: AB_10894207</td></tr><tr><td>CD57</td><td>BD Biosciences</td><td>562488</td><td>染色抗体 RRID: AB_2737625</td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD Biosciences</td><td>563083</td><td>staining抗体 RRID: AB_2737994</td></tr><tr><td>CD16</td><td>BD Biosciences</td><td>563784</td><td>Antibody for staining RRID: AB_2744293</td></tr><tr><td>dead cells</td><td>Life technologies</td><td>L-23105</td><td>Live/dead識別</td></tr><tr><td>ファルコン 5 mL 丸底ポリスチレン試験管 セルストレーナー スナップキャップ付き</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>フローサイトメーターを通過する前に細胞懸濁液をろ過する</td><td>352235</td></tr><tr><td>ファルコン 5 mL 丸底ポリスチレン試験管</td><td>BD バイオ</td><td>352001</td>サイエンス <td>全血を染色する</td></tr><tr><td>回復 細胞培養 凍結培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12648010</td><td>細胞</td></tr><tr><td>を凍結96ウェルV底プレート</td><td>Thermo fisher</td><td>249570</td><td>プレート</td></tr><tr><td>FACSAria IIu Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td>De Novo ソフトウェア</td><td></td><td>FACS解析</td></tr><tr><td>Graphpad プリズム</td><td>GraphPadソフトウェア</td><td></td><td>データ解析</td></tr></tbody></table>

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

免疫細胞の特性は、表面マーカーの発現に基づく集団を識別するためにフローサイトメトリー マルチ カラーに大きく依存します。古典的な多色パネルのセットアップには、ハイエンド機器、カスタム標識抗体、およびスペクトル重複を最小限に抑える設計を慎重に検討が必要です。主要な人間の免疫個体を識別するために役立つ multiparametric 分析を開発した (CD4+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、単球) のみ 2 つの蛍光色素を使用して 7 つの系列マーカーを組み合わせることによって末梢血。当社の戦略は系統マーカーが各細胞集団で常にユニークな組み合わせで表現されます観察に基づいています。抗体の慎重な滴定で、この情報を組み合わせることにより、ほとんど流れの cytometers の光の限界を拡大して、5 つの追加マーカーを記録する捜査官。後者はまだ比較を示した手法と古典的な「1 つの螢光色素 1 つマーカーのアプローチ」、同等の精度で末梢血の免疫細胞群の大半を特徴づけることができます。NKT 細胞・ γδ T 細胞などの個体を識別するためのより正確です。種類の蛍光色素を用いた 7 つのマーカーを組み合わせる複雑な免疫細胞群と手頃な価格の 6-10 の螢光色素の流れの cytometers とも限られた資源と地域で 2-3 螢光色素フィールド機器臨床サンプルの解析できます。ハイエンド機器のこのアプローチからより深い流れフローサイトメトリー分析を達成するために余分な蛍光色素を使用していただけます。このアプローチはまた細胞の限られた数の臨床サンプルの場合いくつかの細胞集団をスクリーニングに適しています非常によくです。

7 系統マーカーとステンド グラスのセットアップとひと末梢血細胞の流れの cytometry 実験の解析 (抗 CD3-CD4,-CD8、CD14、-CD19 の CD56 と TCR の γδ 抗体) 2 つだけを使用して螢が表示されます。
抗 CD8 と CD56 抗体価の代表の結果のとおりです。各抗体 (この例では抗 CD8)、汚れ指数曲線 (図 1 a C) を計算する 10 の連続した 2 倍希釈のデータが記録されました。最適な抗体濃度は最大汚れインデックス信号13,14によって決定されました。ピークまたは汚れ指数曲線の立ち上がり側のピークに近い希薄を選択する必要があります。(以前は滴定) 2 螢光パネルで他のマーカーとともに末梢血細胞を染色によって抗 cd4 抗体と CD56 抗体で滴定しま...

ここでは、CD4 を識別するためにフロー フローサイトメトリーによるプロトコルを提案+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、7 つではなく 2 つだけ螢を用いたひと末梢血単球。このアプローチでは、5 つの追加のマーカーはほとんど流れの cytometers に記録できます。

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

この方法論の全体的な目標は、研究者が複雑な細胞集団を尋問するために5つの追加マーカーを記録できるようにすることで、ほとんどの流量サイトメーターの光学限界を超えて拡大することです。この技術を使用すると、細胞数が少ない検出器やサンプルを用いて作業する際に、深い免疫型を実現することができます。50ミリリットル円錐形のチューブに慎重に引き出された血液を移すことによって、この手順を開始します。カルシウムとマグネシウムを含まずに同量のPBSで血液を希釈します。新しい50ミリリットルの円錐管の底に15ミリリットルの密度勾配培地を加えます。密度勾配媒体の上に希釈された血液を慎重に重ね、密度勾配媒体と希釈血液との混合を避ける。インターフェイスの中断を避けるためにブレーキなしで室温で30分間400回gで遠心分離機。遠心分離後、ピペットを使用して慎重に吸引し、上層を廃棄し、血漿と密度勾配媒体の界面で細胞を除去しないように注意してください。50ミリリットル円錐管の底にある赤い細胞ペレットに触れることなく、インターフェースからできるだけ多くの末梢血単核細胞、またはPBMCを収集し、新しいチューブに移します。PBSを追加して最終容積を25ミリリットルにし、数回反転して混ぜます。その後、テキストに示されているとおりに PBMCs を 2 回洗浄します。テキストに記載されているように血小板を取り除き、PBMCをカウントした後、PBS中の細胞を再懸濁し、0.1%アジ化ナトリウムを10〜7番目の細胞/ミリリットルの1倍の濃度にする。PBMCsを染色用に準備するには、各サンプルの100マイクロリットルを96ウェルVボトムプレートに移します。プレートを室温で3分間350回gで遠心分離する。細胞ペレットを邪魔することなく上清を慎重に吸引する。各井戸に、タンパク質上の遊離アミンと反応する生きた/死んだ固定色素を含むPBSの100マイクロリットルを追加し、慎重にPBMC混合物を再中断します。続いて、プレートを室温で10分間座って死細胞の標識を行う。各サンプルに対して、7つの抗体すべてを含む混合物の30マイクロリットルを調製する。この段階では、異なる標的分子に対する滴定抗体と異なるフッ素色クロムに対する抗体も同様に添加することができる。室温で3分間350回gの96ウェルプレートを遠心し、細胞ペレットを乱すことなく上清を注意深く吸引する。各ウェルに抗体カクテルを加え、気泡を発生させることなく慎重に再中断します。暗闇の中で室温で30分間インキュベートする。30分後、各ウェルに150マイクロリットルの染色バッファーを加え、室温で3分間350回gのプレートを遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引し、PBSの200マイクロリットルで細胞を再懸濁する。これで、細胞はフローサイトメトリー解析の準備が整いました。抗CD3、CD8、CD14、CD19、およびTCRガンマデルタ抗体は、最大染色インデックス曲線で滴定される。抗体滴定は、2つのフルオロクロムを使用して7つの免疫細胞サブセットを適切に同定するために、このプロトコルの中で最も重要なステップです。2倍の抗体希釈を調製するには、96ウェルプレートの10個のウェルに40マイクロリットルの染色バッファーを充填します。このビデオの目的のために、アンチCD8の滴定のみが表示されます。最初の井戸では、最終体積を80マイクロリットルの染色バッファに増やし、メーカーが提案した濃度の4倍の濃度で抗CD8を加えます。よく混ぜ、2番目の井戸に40マイクロリットルを移します。よく混ぜて、他のすべての井戸のためにこのステップを繰り返します。先に示したプロトコルに従って、10種類の抗CD8の30マイクロリットルのPBMCまたは全血の10サンプルを染色する。フローサイトメーターでデータを取得し、各希釈からの信号をプロットします。各抗体濃度の染色率をテキストに詳述した後、抗体希釈の割合として表される抗体濃度に対して染色指数をプロットし、最大の染色指数値を用いて抗体の濃度を同定する。抗CD4および抗CD56抗体を評価するには、先に示した2倍希釈戦略から始め、その間に濃度を加えて、CD4陽性T細胞とNK細胞を他の細胞集団から分離できる濃度の範囲を細かく同定する。二重CD8陽性、CD3陽性シグナルとCD3単一陽性集団との間に抗CD4シグナルを配置することにより、抗CD4抗体を活性化する。抗CD56抗体を、抗CD4抗体滴定と同様の戦略に従って、CD3陰性とCD3陽性集団の間にNK細胞を配置することにより、滴定する。この2つのフルオロクローム、7マーカーゲーティング戦略を開始するには、リンパ球ゲートを選択し、各軸上のこのプロトコルで使用される2つのフルオロクロムのうちの1つを持つドットプロットを作成します。CD8陽性T細胞のゲートは、ドットプロットの右上隅にあるCD3およびCD8二重陽性細胞として同定された。NKT細胞を含む可能性のある薄暗いCD8集団を除外する。CD8陽性T細胞とCD3単一陽性集団との間の集団として同定されたCD4陽性T細胞上のゲート。ガンマデルタT細胞上のゲートは、高CD3細胞として同定される。ガンマデルタT細胞をCD8陽性およびCD8陰性に細分化します。CD3陽性細胞とCD3陰性細胞の間の集団として同定されたNK細胞上のゲート。NK細胞をCD8陽性およびCD8陰性に細分化する。ドットプロットの右下隅にCD3陰性、CD19陽性母集団として同定されたB細胞上のゲート。単球ゲートを選択し、このプロトコルで使用される2つのフルオロクロムのうちの1つを各軸に含むドットプロットを作成します。CD3陰性、CD14陽性集団のゲート。この戦略を用いて、多発性骨髄腫患者のリンパ球は、前方散乱および側面散乱およびそれらのフローサイトメトリックプロファイルに基づいてゲートされた。CD45RAおよびCCR7の発現によりCD8陽性記憶亜集団およびナイーブT細胞を同定した。HLA-DRおよびCD57の発現は、CD8陽性ナイーブ、メモリ、中央記憶、エフェクター記憶およびエフェクター記憶CD45RA陽性細胞におけるT細胞活性化を研究するために使用された。同様の方法で、CD4陽性ナイーブおよびメモリT細胞が同定された。CCR4とCCR6は、メモリの母集団内で、CD4陽性T細胞のTヘルパー亜集団を同定するために使用された。NK細胞の亜集団はCD16およびCD57発現によって特徴付けられていた。この戦略は、幹細胞移植を受けた多発性骨髄腫を有するドナーからの縦方向サンプルの免疫集団のダイナミクスを調べるのに使用された。CD8およびCD4亜集団の時間の経過に関する特徴は、持続的なCD4陽性およびCD8陽性T細胞活性化とTヘルパー1表現型へのTヘルパーの歪曲を示した。しかし、60日目に、B細胞の割合が劇的に増強され、患者の再発を予測した。適切な細胞調製および抗体滴定は、この技術を用いて信頼できる結果を達成するために重要なステップである。抗体は、他のマーカーを標的にして、より深いフローサイトメトリー分析を行い、同時に複数の系統を対象とするモジュラーフローサイトメトリクスパネルを作成することができます。記録可能なマーカーの数を拡大することを目的とした同様のアプローチは、マーカーの異なるセットを使用して、または異なる動物モデルで使用するために開発することができます。アジ化ナトリウムは皮膚や目に火傷を引き起こす可能性があることを忘れないでください。したがって、この試薬を取り扱う際には、ラボコート、保護眼鏡、手袋を着用する必要があります。

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7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

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