Name: マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学ぶマイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調べる方法。タッチピンプリンターで細胞外マトリックスを印刷し、腫瘍細胞の表現型を駆動する主要因子を特定します。

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この研究は、NIHコモン・ファンド・ライブラリー・オブ・ネットワーク・セルラー・シグネチャー(LINCS)助成金HG008100(J.W.G.、L.M.H.、J.E.K)によって支援されました。

注:MEMA プロセス全体の概要 (推定時間を含む) は、図 1に示すフロー図に概説されています。このプロトコルは、8ウェルプレートにおけるMEMAの製造について詳しく述べています。プロトコルは、他のプレートまたはスライドに適合してもよい。
1. タンパク質、希釈剤、染色バッファーの調製
<ol><li>EPM、リガンド、サイトカインのバイアルを室温(RT)と短時間遠心分離機に平衡化します。製品データシートに示されているように、適切なRTバッファの適切なボリュームを追加します。在庫濃度に関するメーカーの推奨事項に従ってください。 注:リガンドとEPMの在庫と最終濃度の完全なリストは、表1および表2に記載されています。リガンドとEPMの両方は、通常、標準的な2日間培養アッセイで生物学的効果を引き出す製造業者が推奨する範囲の最高濃度で使用されます。汚染を避けるために層流の下で穏やかに、バイオセーフティキャビネットでタンパク質を扱う。</li>
	<li>RTで1時間の穏やかな揺れでバイアルをインキュベートします。これは、変性を引き起こす可能性がありますので、渦タンパク質をしないでください。</li>
	<li>アリコートタンパク質は長期保存のため、すべてのアリコートは、繰り返し凍結/解凍サイクルで分解を避けるためにのみ単一の使用です。凍結乾燥タンパク質は、必要になるまで-80 °C(特に指定がない限り)に保管してください。(i) タンパク質名、(ii) 準備日、(iii)ロット/バッチ番号、(iv)サプライヤー、(v)カタログ番号、(vi)濃度、(vii)容積、(viii)調製機など、将来の参照のためにすべてのメタデータを収集するように注意してください。</li>
	<li>20%(v/v)グリセロール、10mM EDTA、200mMトリス-HCl、pH 7.2を含む希釈剤バッファーを調製し、濾過殺します。このバッファを無菌に保ち、RTに保存してください。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食液(PBS)に2%(w/v)BSA、1mM MgCl 2、および0.02%NaN3を含む染色バッファーを調製する。フィルターを取り、4 °Cで保存します。</li>
</ol>2. ECMソースプレートの調製
<ol><li>印刷するECMタンパク質のアリクォートストックを取り除き、氷上で解凍します。メタデータ追跡用のすべてのロット番号を記録します。</li>
	<li>解凍されたタンパク質のチューブを穏やかにフリックして、適切なリサスペンションを確保し、遠心分離機でスピンダウンします。</li>
	<li>
無作為化された384ウェルソースプレートを作成する液体処理ロボットで使用するECMプリント混合物(EPM)と蛍光線を作ります。 注:384ウェルソースプレートは、タッチピンアレイプリンタで使用され、8ウェルプレートで印刷されたアレイを作成します。<ol>
<li>各EPMおよび受託者のためのラベル1.5 mLマイクロセントリフュージチューブ。</li>
		<li>125 μL の希釈バッファー (ステップ 1.4 を参照) を適切な体積の ECM ストックと組み合わせて各 EPM を準備し、PBS で合計 250 μL の総体積まで混合物を持ち込みます。各EPMチューブの最終濃度は、1x ECMタンパク質、5 mM EDTA、10%グリセロール、および100mMトリスになります。</li>
		<li>蛍光繊維を製造元が指定した適切なバッファーに溶解して調作し、250 μLを標識された受託チューブに移します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 液体ハンドラを用したソースプレートの作成
<ol><li>EPM の位置をランダム化し、使用するアレイ プリンタ ピン ヘッド用に最適化された 384 ウェル プレート レイアウトを設計します。各ウェルの行 1、列 1 の位置に印刷するように、fiducial の配置を設計し、配列の向きを支援します。 注:堅牢なデータを確保するために、各 ECM の合計 14-15 レプリケートが使用されます。結合の均一性の評価のための堅牢な添付ファイルをもたらすコラーゲンまたは別のECMの追加の複製を含めます。対象の EEC の数に応じて、レイアウトで複数の 384 ウェル プレートを使用する必要がある場合があります。</li>
	<li>EPMチューブを液体ハンドラに移し、冷却されたチューブラックでチューブを4°Cに保つか、コールドルームにある液体取り扱いロボットを使用します。</li>
	<li>液体ハンドラのソフトウェアを使用して、各EPMの15 μLを転送するプログラムを実行し、384ウェルソースプレート内の事前指定ウェルにフィデューシャルを転送します。</li>
	<li>ピペットPBSは、印刷プロセス中に湿度を高め、乾燥から保護するために、任意の未使用の井戸にピペットPBS。 注:4 x 7 ピン ヘッド用に最適化され、コラーゲン I ブロックと PBS を含む 384 ウェル ソース プレート セットの例については、図 2を参照してください。</li>
	<li>シールプレートを、印刷する準備ができるまで4°Cに保ちます。</li>
</ol>4. アレイ印刷ロボットを用いたMEMの印刷
注:プロトコルの次の部分は、MCF7細胞の増殖および増殖に対する異なる微小環境タンパク質の影響を調査するためのMEMAの調製および使用について具体的に説明する。しかし、プロトコルは、異なるリガンド、EEC、および細胞を使用して、他の細胞株および目的のエンドポイントを研究するように容易に適応させることができる。
<ol><li>
タッチピンプリンタを使用して、EPMとフィデューシャルスポットを8つのウェルプレートに印刷します。再現性を確保するために、各 ECM 条件の複数の反復を印刷します。 注:他のプレートフォーマットやスライドは印刷に使用できますが、最適なスポット形成を達成するためにバッファの最適化が必要になる場合があります。<ol>
<li>4 x 7 プリント ヘッド構成に配置された 350 μm の直径ピンを使用して、MEMA の ECM を印刷します。8ウェルプレートの配列を20列35列で印刷し、合計で約700個のスポットを印刷します。より大きい配列はこれらの版で可能であるが、細胞結合および染色の両方の増加した端効果のトレードオフと来る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>印刷後は、使用の3日前までにデシケータにプレートを保管してください。</li>
</ol>5. リガンド処理プレートの作成
<ol><li>関心のあるリガンドを含む96ウェルプレートレイアウトを設計します。一度に多くのMEMAプレートの処理を容易にするために、8ウェルMEMAと96ウェルプレートの間で液体を転送するために4つの間隔の先端を持つマルチチャンネルピペを使用することを可能にする間隔でこのプレートを設計します。 注:このプロトコルでは、表2に記載されているリガンドの完全なセットが利用される。</li>
	<li>氷の上でリガンドを解凍します。簡単にフリックし、各チューブをスピンダウン。</li>
	<li>製造業者の推奨バッファー(通常はPBS)を使用して、200倍の作業ストックにリガンドを希釈します。</li>
	<li>各200xリガンドストックのピペ10μLを96ウェルプレート内の対応ウェルに入れます。</li>
	<li>-20 °Cでプレートをシールして保管します。 注:リガンド処理プレートをバッチで作成し、ダウンストリーム解析用のすべてのメタデータをキャプチャします。</li>
</ol>6. MEMA上の細胞の培養
<ol><li>二重蒸留水(ddH2 O)で1%の非ファウリング遮断剤(材料の表)を含む非ファウリング遮断バッファーのウェルあたり2mLで20分間MEMをブロックします。</li>
	<li>PBSを使用してブロッキングバッファとトリプルリンスウェルを吸引します。乾燥を防ぐために、細胞めっきの準備ができるまで、PBSの最終体積を井戸に残します。 注:MEMの細胞培養ステップのために2人のベンチワーカーを持つことは非常に有用です。1人のベンチワーカーは吸引ステップを実行でき、2人目は加算ステップを実行します。ピペット用の8ウェルプレートと一度に複数のウェルを吸引する2つのパスツールピペットを持つYスプリッターに一致するように間隔をあけた先端を持つ1 mLマルチチャンネルピペットを使用することをお勧めします。</li>
	<li>10%の胎児ウシ血清(FBS)を含有するダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)培地の2mL中の種子2 x 105 MCF7細胞。 注:完全なMEMA実験の前に、MEMAスポットが目的の実験期間の終わりに高い細胞数を持つ(しかし、コンフルエントではない)ので、細胞数を最適化するために細胞滴定実験を行います。</li>
	<li>2−18hの接着後、吸引培地を2mLの低成長培地(DMEMを0.1%FBSで置き換える)。 注:減少した血清(例えば、0.1%FBS)または成長因子枯渇条件は、この時点で特定のリガンドの刺激的影響を分離するために使用することができる。</li>
	<li>氷の上にリガンド処理プレートを解凍します。遠心分離機は1分間200 x gでプレートを解凍しました。</li>
	<li>培養板の各ウェルから200μLの培地を処理プレート内の適切なウェルに移す。リガンドの体積を媒体と混ぜ合わせ、この混合物をMEMAプレートの適切な井戸に戻すために上下にピペを行います。</li>
	<li>手で軽く揺れ、MEMAプレートをインキュベーターに戻します。37°Cおよび5%CO2でのリガンド/ECM組み合わせの存在下での実験の持続期間のための培養。 注:典型的なMEMA実験は72時間実行されます。より長い期間の実験は、培地の置換とリガンドとの再処理を必要とする場合があります。</li>
	<li>パルスMEMAウェルは、100x 5-エチニル-2'-デオキシュリジン(EdU)で71時間で、最終的な濃度は10μMのインキュベートで、EdUを1時間37°Cおよび5%CO2で試験条件でインキュベートする。 注:他の生細胞治療もこの時点で使用されてもよい。</li>
</ol>7. MEMの固定と染色
<ol><li>72時間と任意の生細胞治療の後、井戸を吸引する。RTで2%パラホルムアルデヒド(PFA)のウェルあたり2 mLでMEMAを15分間固定します。</li>
	<li>PFAを吸引する。0.1%のニオニオニック界面活性剤のウェルあたり2 mLで15分間透過性を測定する。</li>
	<li>ニオニオニック界面活性剤を吸引し、PBSのウェルあたり2 mLで洗浄します。吸引PBS。0.05%ポリソルベート20(PBS-T)で2mLのPBSで洗浄します。 注:MEMA表面は疎水性であり、染色および抗体のインキュベーションの前にPBS-Tで洗浄しないと、インキュベーションステップ中にウェルに空隙が形成され、染色アーティファクトが生じます。</li>
	<li>吸引PBS-T.EdU検出反応試薬を添加する。RTで1時間インキュベートし、揺れ、光から保護します。1時間インキュベーション後、提供された市販のクエンチバッファーとのクエンチ反応。 注:EdU検出および染色/抗体ステップは、コストを削減するためにウェルあたり1.5mLで行うことができます。</li>
	<li>クエンチバッファーを吸引し、汚れまたは抗体でインキュベートする前にPBS-Tで洗浄します。</li>
	<li>ヒストンH3K9me3(1:1,000)およびフィブリラリン(1:400)に対する抗体を使用してMEMAウェルをインキュベートし、2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を含む染色バッファーで、1mM MgCl2および0.02%NaN3を4°Cで一晩使用する。 注:完全なMEMAセットでそれらを使用する前に最適な濃度を決定するために抗体滴定を行います。</li>
	<li>一次抗体または染色インキュベーションに続いて、PBSでウェル2xを洗浄し、PBS-Tで1回洗浄します。</li>
	<li>二次抗体(ロバ抗マウスIgGおよびロバ抗ウサギIgG、両方とも1:300)および0.5 μg/mL 4'6‐diamidino‐2‐フェニリンドール(DAPI)を添加する。暗闇の中でRTで1時間インキュベートします。</li>
	<li>PBSのウェルあたり2 mLでウェル2xを洗浄し、最終的な2 mL PBSにそれらを残します。</li>
	<li>光から保護された4°CでPBSで後のイメージングのために染色されたMEMをイメージングまたは保存してください。</li>
</ol>8. MEMAのイメージング
<ol><li>適切な蛍光検出チャネルを備えた自動イメージングシステム上の画像MEMA。</li>
	<li>結果の画像データをイメージ管理システムに出力します。セルをセグメント化し、CellProfiler8を使用して強度レベルを計算します。</li>
</ol>9. データ分析
注:データ分析は、Raw CellProfiler 派生データの正規化、変動補正、および要約で構成されます。この例では、カスタム コードを使用する R 環境を使用して、すべての手順を実行します。ただし、任意の統計環境またはソフトウェア プログラムを使用して、同等のアクションを実行できます。分析用の R 環境のオープン ソース カスタム コードの例は、https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486 にあります。 
<ol><li>セグメント化されたイメージ データを前処理して正規化します。</li>
	<li>DAPI染色された核を使用してスポットセル数を決定します。</li>
	<li>セルを EdU+としてラベル付けする自動ゲート EdU 強度 。各スポットにおけるEdU+細胞の割合を用いて増殖を測定する。</li>
	<li>中央値は、サイトレベルで細胞質汚れと核形態の測定値を要約します。</li>
	<li>データ品質を向上させるために、データに対する不要なバリエーション (RUV) 正規化の除去を実行します 9. 注:このアプローチは、前述の9のように列として行とスポットを使用する配列を持つ行列として、各強度信号と形態信号に個別に適用されます。</li>
	<li>空間的または強度に関連する効果を補正するために、配列行と配列列を独立変数として使用して RUV 正規化された残差に二変量ロース正規化を適用します。</li>
	<li>正規化が完了したら、中央値は、レポート作成およびさらなる分析のために、各マイクロ環境条件の反復を要約します。</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
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<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiated+state+of+normal+and+malignant+cells+or+how+to+define+a+%22normal%22+cell+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture.</a> International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).</li>
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<li>Kaylan, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+lung+tumor+cell+drug+responses+as+a+function+of+matrix+context+and+genotype+using+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays.</a> Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).</li>
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<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

「次元性」と文脈の重要性は、微小環境11との相互作用を通じて癌細胞の特性評価のツールとしてのインビトロ培養システムの開発の動機付け要因となっている11、およびインビトロの能力インビボ環境を模倣する文化システムは、これらの文化システムを改善するための探求の原動力です。しかし、インビトロシステムは、単純化されたモデル12にインビボ状況の複合体を蒸留する能力のために、正確に癌研究の重要なツールを残しています。
2D システムには EPM とリガンドを含めることができますが、従来は、組み合わせのパーチュバゲンの広いパネルを調べるためのスループット能力が欠けていました。一般的な市販の地下膜抽出物は、3Dで培養することができますが、タンパク質の慎重に定義されたパネルの証明を欠いています。市販の抽出物は、通常、不完全に定義された組成物に苦しんでおり、分析を混乱させ、有意なバッチ間変動3、13をもたらす可能性がある。<sup clas...

2次元(2D)単層におけるプラスチック上の癌細胞株の培養は、がん研究者にとって依然として主要な主力の1つである。しかし、微小環境は、細胞の型示しに影響を与える能力のためにますます認識されています。癌において、腫瘍微小環境は、成長、生存、侵侵入、および治療1、2への応答を含む複数の細胞行動に影響を与える知られている。従来の単層細胞培養は、通常、微小環境の影響を欠き、市販の精製基膜抽出物を含む細胞を成長させるより複雑な3次元(3D)アッセイの開発につながっている。しかし、これらの精製行列は、通常、使用が複雑であり、バッチ変動3や複雑な組成3などの技術的な問題に苦しむ。その結果、細胞表現型3に影響を与える可能性のある特定のタンパク質に機能を割り当てるのは困難な場合があります。
これらの限界に対処するため、微小環境マイクロアレイ(MEMA)技術を開発し、微小環境を細胞外マトリックス(ECM)と可溶性成長因子タンパク質の単純な組み合わせにまで削減する4,5.MEMAプラットフォームは、細胞の挙動に影響を与える主要な微小環境因子の同定を可能にします。配列形式を使用することで、何千もの微小環境因子の組み合わせを1回の実験でアッセイすることができます。ここで説明するMEMAは、約2,500の異なるユニークな微小環境条件を尋問する。ウェルプレートに印刷されたECMタンパク質は、細胞を培養できる成長パッドを形成します。可溶性リガンドは個々のウェルに添加され、細胞が露出する各異なるスポットにユニークな組み合わせ微小環境(ECM +リガンド)を作成します。細胞は数日間培養され、次いで固定され、染色され、これらの特定の微小環境の組み合わせへの曝露の結果として細胞表現型を評価するために画像化される。微小環境は単純な組み合わせであるため、細胞の主要な現象的変化を駆動するタンパク質を特定するのは簡単です。MEMAは、細胞の運命決定と治療4、5、6、7への応答を駆動するものを含む、複数の細胞表現型に影響を与える因子を同定するために正常に使用されている。これらの応答は、単純な2D実験で検証することができ、腫瘍微小環境の複雑さをより完全に要約する条件下で評価することができます。MEMAプラットフォームは、良好なプノチピックバイオマーカーが利用可能である場合、様々な細胞タイプおよびエンドポイントに非常に適応可能です。

<table><tbody><tr><td>プロトコルで使用されるAushon 2470</td><td>Aushon BioSystems</td><td></td><td>Arrayerロボットシステム</td></tr><tr><td>Nikon HCA</td><td>Nikon</td><td></td><td>High Content Imagingシステムは、Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope</td></tr><tr><td>BioTek Precision XSリキッドハンドラーBioTek</td><td></td><td></td>プロトコルTrizma塩酸塩緩衝液シグマT2069<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>で使用されるリキッドハンドリングロボットを中心に設計されています</tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Kolliphor P338</td><td>BASF</td><td>50424591</td><td></td></tr><tr><td>384 ウェル マイクロアレイ プレート、円筒形 ウェル</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab1055</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 8井戸皿</td><td>サーモフィッシャー</td><td>267062</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16%溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>フィッシャー</td><td>BP-1600</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>セルマスク</td><td>分子プローブ</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>Click-iTEdU Alexa Fluor</td><td>分子プローブ</td><td>C10357</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>プロモキネ</td><td>PK-CA70740043</td><td></td></tr><tr><td>アルカム</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>656-AL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>カドヘリン-20(CDH20)</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ5604-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-6 (CDH6)</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ2715-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-8(CDH8)</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ188-C8</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CD44</td><td>R &Dシステムズ</td><td>3660-CD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CEACAM6</td><td>R &D Systems</td><td>3934-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>コラーゲン I</td><td>Cultrex</td><td>3442-050-01</td><td>ECM</td></tr><tr><td>コラーゲン II 型</td><td>ミリポア</td><td>CC052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>コラーゲン III 型</td><td>ミリポア</td><td>CC054</td><td>ECM</td></tr><tr><td>コラーゲン IV 型</td><td>シグマ</td><td>C5533</td><td>ECM</td></tr><tr><td>コラーゲン V 型</td><td>ミリポア</td><td>CC077</td><td>ECM</td></tr><tr><td>COL23A1</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ4165-CL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Desmoglein 2</td><td>R &D Systems</td><td>947-DM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>E-カドヘリン (CDH1)</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ648-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ECM1</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ3937-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ1918-FN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>GAP43</td>アブ<td>カム</td><td>ab114188</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-500K</td><td>R&Dシステムズ</td><td>GLR002</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-50K</td><td>R &Dシステムズ</td><td>GLR001</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R &Dシステムズ</td><td>720-IC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>シグマ</td><td>L6274</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ラミニン-5</td><td>Abcam</td><td>ab42326</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ルミカン</td><td>R &Dシステム</td>ズ<td>2846-LU</td><td>ECM</td></tr><tr><td>M-CAD(CDH15)</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ4096-MC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ニドゲン-1</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ2570-ND</td><td>ECM</td></tr><tr><td>オステオアドヘリン/ OSAD</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ2884-AD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>オステオポンチン(SPP)</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ1433-OP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>P-カドヘリン(CDH3)</td><td>R &Dシステムズ</td><td>861-PC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>R &Dシステムズ</td><td>ADP6</td><td>ECM</td></tr><tr><td>テネイシンC</td><td>のR&Dシステム</td><td>ズ3358-TC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>VCAM1</td><td>R &Dシステムズ</td><td>ADP5</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ2308-VN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Biglycan</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ2667-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>デコリン</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ143-DE</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ペリオスチン</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ3548-F2</td><td>ECM</td></tr><tr><td>SPARC/オステオネクチン</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ941-SP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>トロンボスポンジン-1/2</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ3074-TH</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ブレビカン</td><td>R&D Systems</td><td>4009-BC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>エラスチン</td><td>BioMatrix</td><td>5052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Fibrillin</td><td>Lynn Sakai Lab OHSU</td><td>N/A</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ANGPT2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>623-AN-025</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>IL1B</td><td></td><td>RnD_Systems_Own 201-LB-005</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>CXCL8</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>208-IL-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>291-G1-200</td><td>リガンド</td></tr><tr><td></td><td>TNFRSF11B</td><td>RnD_Systems_Own 185-OS</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>BMP6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>507-BP-020</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>FLT3LG</td><td></td><td>RnD_Systems_Own 308-FK-005</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>CXCL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>275-GR-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>DLL4</td><td></td><td>RnD_Systems_Own 1506-D4-050</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>HGF</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>294-HGN-005</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>Wnt5a</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>645-WN-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>CTGF</td><td>Life_Technologies_Own</td><td>PHG0286</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>LEP</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>398-LP-01M</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma_Aldrich_Own</td><td>SRP4037-50UG</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>FGF6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>238-F6</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>IL7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>207-IL-005</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>TGFB1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>246-LP-025</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>PDGFB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>220-BB-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>WNT10A</td><td>Genemed_Own</td><td>90009</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>PTN</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>252-PL-050</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>BMP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>113-BP-100</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>314-BP-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>TNFSF11</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>390-TN-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>CSF2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>215-GM-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>BMP5</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>615-BMC-020</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>DLL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1818-DL-050</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>NRG1</td><td></td><td>RnD_Systems_Own 296-HR-050</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>KNG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1569-PI-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>GPNMB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>2550-AC-050</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td></td><td>RnD_Systems_Own 350-NS-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>IL15</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>247-ILB-005</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>TNF</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>210-TA-020</td><td>配位子</td></tr><tr><td>IGFBP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>675-B3-025</td><td>配位子</td></tr><tr><td>WNT3A</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>5036-WNP-010</td><td>配位子</td></tr><tr><td>PDGFAB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>222-AB</td><td>配位子</td></tr><tr><td>AREG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>262-AR-100</td><td>配位子</td></tr><tr><td>JAG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1277-JG-050</td><td>配位子</td></tr><tr><td>BMP7</td><td></td><td>RnD_Systems_Own 354-BP-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>TGFB2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>302-B2-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>VEGFA</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>293-VE-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>IL6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>206-IL-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>351-FS-010</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>NRG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>378-SM</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>IGFBP2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>674-B2-025</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>SHH</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1314-SH-025</td><td>リガンド</td></tr><tr><td>FASLG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>126-FL-010</td><td>リガンド</td></tr></tbody></table>

マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

細胞の表現型に対する微小環境の影響を理解することは、生体内の微小環境における可溶性成長因子とマトリックス関連タンパク質の両方の複雑な混合物による困難な問題である。さらに、インビトロでの微小環境のモデリングに容易に利用可能な試薬は、通常、不完全に定義され、バッチからバッチの変動に苦しむタンパク質の複雑な混合物を利用します。マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)プラットフォームは、単一のアッセイにおける細胞表現型への影響について、マイクロ環境タンパク質の数千もの単純な組み合わせの評価を可能にします。MEMAはウェルプレートで調製され、個々のリガンドをアレイされた細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を含むウェルを分離することができます。各印刷されたECMとの可溶性リガンドの組み合わせは、ユニークな組み合わせを形成します。典型的なMEMAアッセイには、細胞が単一のアッセイでさらされている2,500を超えるユニークな組み合わせ微小環境が含まれています。試験ケースとして、乳癌細胞株MCF7をMEMAプラットフォーム上でメッキした。このアッセイの分析は、これらの細胞の増殖および増殖を増強および阻害する因子を同定した。MEMAのプラットホームは非常に適用範囲が広く、癌の研究を超えて他の生物学的質問と使用するために拡張することができる。

細胞増殖および増殖に対する微小環境影響を簡素化し、細胞増殖および増殖を促進または阻害する条件を同定するために、乳癌細胞株MCF7は、プロトコルに記載されている8ウェルMEMAのセットに播種した。このアッセイは、合計2736の組み合わせ微小環境条件のために、48の異なるEPMと57の異なるリガンドに細胞を曝露しました。培養71時間後、細胞をEdUでパルスし、固定、透過化、DAPI、EdU検出に対する反応、抗フィブリリン抗体、および抗H3K9me3抗体で染色した。細胞を高含有量の顕微鏡で画像化した。画像はOmeroサーバー10にアップロードされ、CellProfiler8を使用してセグメント化され、R9で正規化および分析されました。以下に説明する結果は、DAPI シグナルと EdU シグナルに焦点を当てています。
MEMAの画像解析プラットフォームは、DAPIに基づいて所定のリガンドで処理された細胞に対して2Nおよび4N画分を示すDNA含有量プ...

ここで提示される方法の目的は、マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)を作製し、培養細胞の表現型に対する何千もの単純な組み合わせ微小環境の影響を調べるために使用する方法を示すことです。

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

腫瘍微小環境の研究は、その複雑さのために困難です。我々は、腫瘍細胞型の主要な要因を同定することを可能にする単純な組み合わせ微小環境からなる微小環境マイクロアレイを開発した。MEMA プラットフォームの主な利点は、マイクロ環境条件がすべて定義されているため、関心のあるフェノタイプを駆動する微小環境要因を識別することが簡単であるということです。MEMAプラットフォームは、一次細胞株および幹細胞を含む他の非癌系で広く適用可能である。湿ったベンチの仕事をスピードアップし、プロトコルを簡素化するために開発したエンジニアリングのトリックとステップの数があります。まず、タッチピンプリンタを使用して、受託者スポットの細胞外マトリックス印刷混合物を8ウェルプレートに印刷します。直径350マイクロメートルのピンを4回7回のプリントヘッド構成に配置して、微小環境マイクロアレイ用の細胞外マトリックスを印刷します。コラーゲンブロックは、グリッドとしてMEMに印刷されます。PBS充填されたウェルは、細胞外マトリックス印刷混合物ソースプレートの乾燥を防ぐために余分な湿度を提供します。8 ウェルプレートに配列を 20 列ずつ 35 行で印刷し、合計 700 個のスポットを印刷します。印刷後は、使用前に少なくとも3日間デシケータにプレートを保管してください。まず、多くのMEMAプレートの処理を一度に行うことができるように、4つの間隔のチップを持つマルチチャンネルピペットの使用を可能にする間隔を持つ96ウェルプレートレイアウトを設計します。次に、冷凍庫からリガンドを取り出し、層流フードの氷で解凍します。各チューブを簡単にフリックしてスピンダウンします。メーカーの推奨バッファを使用して、リガンドを200倍の作業在庫に希釈します。ピペット10マイクロリットルの各200回のリガンドストックは、96ウェルプレート内の対応するウェルに入った。シールフィルムを使用してプレートを密封し、マイナス20度で保管してください。リガンド処理プレートをバッチで作成し、下流分析用のすべてのメタデータをキャプチャします。細胞を培養する前に、非汚汚ブロックバッファーのウェルあたり2ミリリットルでMEMAsを20分間ブロックします。2つのパスツールピペットを備えたYスプリッターを使用して、ブロッキングバッファーを一度に複数のウェルに吸い込み、PBSで3倍に洗浄します。乾燥を防ぐために、細胞めっきの準備ができるまで、PBSの最終容積を井戸に残します。完全なMEMA実験の前に、細胞滴定実験を行うことによりMCF7細胞の播種濃度を最適化する。理想的なスポットは、ここに示すように、データを抽出するのに十分なセル番号を持っていますが、スポットが過度にコンフルエントであるほど多くはありません。MEMAでは、残りのPBSを吸引し、2ミリリットルの播種培地で30,000〜35,000個の細胞を1ウェルで播種する。MEMAを摂氏37度のインキュベーターに入れる。インキュベーターで一晩接着した後、培地を吸引し、2ミリリットルの還元成長培地に置き換えて、特定のリガンドの刺激的影響を単離する。その後、氷の上に以前に凍結したリガンド処理プレートを解凍します。遠心分離機は1分間200回gでプレートを解凍した。MEMA培養板の各ウェルからリガンド処理板の適切なウェルに培地200マイクロリットルを移す。ピペットを上下にしてリガンドを培地と混合し、この混合物をMEMA培養プレート内の適切なウェルに戻します。軽く手で揺れ、MEMAプレートをインキュベーターに戻し、リガンドとECMの組み合わせを摂氏37度と5%の二酸化炭素で培養する。71時間後、MEMAウェルに100回EdUを加え、10マイクロモルの最終濃度を求めます。摂氏37度と5%の二酸化炭素でさらに1時間インキュベートします。最終インキュベーションの後、井戸を吸引する。室温で15分間2%PFAのウェルあたり2ミリリットルでMEMAsを固定します。その後、井戸からPFAを吸引します。15分間0.1%の非イオン性界面活性剤のウェルあたり2ミリリットルで透過化する。界面活性剤を吸引し、次いでPBSとPBS-Tの2ミリリットルでウェルを順次洗浄する。その後、各ウェルに1.5ミリリットルのEdU検出反応試薬を加えます。室温で1時間インキュベートし、揺れ、光から保護します。その後、1.5ミリリットルの市販のクエンチバッファーを使用して反応を焼き付けます。再度吸い込み、最適化された濃度の汚れまたは抗体でインキュベートする前にPBS-Tで洗浄します。MEMAウェルを染色バッファーの一次抗体でインキュベートし、一晩で摂氏4度で揺れます。一次抗体インキュベーションに続いて、PBSでウェルを洗浄し、続いてPBS-Tを洗浄する。2次抗体を1ミリリットル当たり0.5マイクログラムのDAPIに添加し、染色バッファーで希釈します。インキュベート、暗闇の中で室温で1時間揺れる。PBSの井戸あたり2ミリリットルで井戸を2回洗い、PBSの最後の2ミリリットルに残します。画像染色MEMAに、適切な蛍光検出チャネルを備えた自動イメージングシステムの顕微鏡ステージに配置します。結果の画像データを画像管理システムに出力します。セルをセグメント化し、CellProfiler を使用して強度レベルを計算します。このプロトコルでは、ビン分割されたDAPI強度値のセルサイクルプロファイルと1つの8ウェルプレートからのセルカウントは、G1とG2細胞周期期の細胞を示す。これは、初期の増殖期の細胞内の2つのnDNA含有量と、有糸分裂を起間させる細胞内の4つのnDNA含有量に相当する。リガンドとECMの微小環境が細胞数とEdUの組み込みの両方に及ぼす影響を示す。赤はセル番号が高いことを示し、青はセル番号の低さです。ECM条件が細胞数またはEdU陽性に強く影響を与えなかったことを示す効果の多くは、リガンド駆動である。Natagen 1は、このECM分子の存在がMCF7の細胞結合および増殖を阻害するので、明確な例外である。FGF6やノイレグリン-1アルファなどのリガンドは細胞数を高め、EdUの取り込みの割合が高く、アンファイヤグリンやノイレグリン-1 SMDFなどのリガンドは細胞結合および細胞増殖を阻害します。ニューレグリン-1αで処理されたMEMAスポット上で増殖するMCF7細胞の一例は、ピンク核によって示される高いEdUの取り込み率を示す。この画像では、緑色の染色はセルマスク、青はDAPIです。完全なMEMA実験は高価であるため、完全な実験を行う前に、細胞および血清滴定などの最適化ステップを実行することが非常に重要である。MEMAプラットフォームを用いて目的とする微小環境条件を特定すると、従来の2Dおよび3D細胞培養システムを用いて、特定のリガンドおよび細胞外マトリックスタンパク質をより深く研究することができます。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

細胞機能上の微小環境の分子組成の影響についての洞察を得るためのコンビナトリアル機能的スクリーニング方法が記載されている。この方法は、細胞接着および機能解析をサポートしていることを定義したコンビナトリアル微小環境の配列を生成するために、既存のマイクロアレイベースの技術を活用しています。...

微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

この動画では、抗体マイクロアレイを用いて特定の遺伝子発現を測定することにより、miRNAトランスフェクト肺がん細胞におけるタンパク質発現を研究する技術について説明しています。注目のプロトコルでは、細胞周期の停止と血管新生におけるコンビナトリアルmiRNA処理の活性を同定するための抗体マイクロアレイを行います。...

抗体マイクロアレイ:miRNA処理肺がん細胞のタンパク質発現を研究する技術

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。...

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

細胞分化は、マトリックス組成物と基板材料の特性の両方を含む微小環境因子の宿主によって調節されます。ここでは細胞分化および微小環境のコンテキストの関数としての生体力学的な細胞 - 基質相互作用の両方を評価するための牽引力顕微鏡と組み合わせて、細胞マイクロアレイを利用した技術が記載されています。...

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

ここで分離し、確立された皮下腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小環境のコンポーネントを豊かにする方法をについて説明します。この手法は、腫瘍免疫浸潤と非免疫腫瘍腫瘍免疫微小環境の包括的な評価を可能にすることができます独立した分析のためことができます。...

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

ここでは、様々 な細胞モデルにおけるシグナル伝達経路の変化を識別するために抗体のアレイのためのプロトコルを提案する.薬/低酸素/超紫外光・放射、または過剰発現/ダウンレギュレーション/ノックアウトによって発生、これらの変更は様々...

抗体のアレイによるシグナル伝達経路の尋問でチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性の評価

miRNA の治療には、癌の進行を調節する重要な可能性があります。ここに示す解析的アプローチ、組合せ miRNA...

組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

この原稿は、腫瘍低酸素症が転移に及ぼす影響を直接テストし、その作用メカニズムを解読することを可能にする動物モデルの開発について説明しています。ここで説明する実験はユーイング肉腫に焦点を当てていますが、同様のアプローチを他の腫瘍タイプにも適用できます。...

腫瘍転移に対する低酸素のテストの効果のためのインビボモデル

学ぶマイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調べる方法。タッチピンプリンターで細胞外マトリックスを印刷し、腫瘍細胞の表現型を駆動する主要因子を特定します。

マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る

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