Name: 生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学ぶAAVベクターの生産・精製プロトコル。HEK細胞を用いて高純度・高収率のAAVベクターを調製し、遺伝子治療や分子生物学研究における細胞特異的発現を実現する方法を解説します。

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原産地は、フォン フォール Wetenschappelijk Onderzoek フランデレン (FWO) ポスドク研究員プログラム (133722/1204517N) に支えられて、フンダシオン心血管・ デ ・ コロンビアと管理科学科の継続的なサポートが認めています。技術と技術革新 (グラント CT-FP44842-307-2016、プロジェクト コード 656671250485)。MM は、FWO 博士フェローシップ (1S48018N) によってサポートされます。M.G.H. は、VIB 制度助成金とアルツハイマー病研究 (サンパウロ-FRA) (P #14006)、FWO (グラント 1513616N)、欧州研究会議 (ERC) (開始のグラントにティエリー Latran 財団 (SOD VIP)、財団から外部のサポートによって支持されました。281961-AstroFunc;コンセプト グラント 713755 - 広告-VIP の証拠)。著者は、マウス飼育でご支援 Jeason ・ ホートン、ステファニー Castaldo の尾静脈注射を実行する助け、キャロライン Eykens transfected HEK293T 細胞の画像を提供するためにご了承ください。M.G.H. には、マイケル ・ ダンロップ、ピーター ・ ヒックマン、ディーン ・ ハリソンが認めています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ソリューション</td>
			<td colspan="2">組成</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">細胞培養とトランスフェクション</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">DMEM1</td>
			<td>DMEM 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="5"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="7"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="8"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr></tbody></table> <ol><li> </li><li></li><li> </li><li><ol><li><li><li><li> </li></ol></li><li><li><li> </li><li><li></li><li><li></li></ol><img alt="Supplementary Figure" src="/files/ftp_upload/58960/58960sfig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960sfig1large.jpg" target="_blank"></a><ol start="12"><li> </li><li></li><li><li> </li></ol><ol><li><li> </li><li><li><li></li><li><li> </li><li></li><li> <ol><li><li></li><li> </li><li> </li></ol></li><li><li></li><li> </li><li></li><li><ol><li></li><li> </li><li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig1large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li></li><li><li></li><li> </li><li> </li><li><li></ol><ol><li><ol><li><li> </li><li><li><li></li><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li><li> </li><li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/Table_3._Stock_plasmid_volume_calculator.xlsx" target="_blank"></a><ol start="2"><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig2large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"></td><td></td><td></td><td></td><td rowspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td rowspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol start="4"><li><ol><li> </li><li></li><li><li> <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58960/58960eq1.jpg"> </li></ol></li></ol><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/Table_6_qPCR_data_template.xlsx"></a><ol><li><li><li> </li><li><li><li> </li><li></li><li><li><li><li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol start="12"><li><li> </li><li><li><li></li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig3large.jpg" target="_blank"></a>

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使用材料および装置のほとんどの分子生物学実験室および細胞培養設備に共通、組換え AAV のベクトル生産はここで説明します。純粋な前臨床等級 AAV のベクトルを生体外でそして生体内のアプリケーションの範囲を渡る複数の細胞・組織の種類を対象とする使用することができますを取得するユーザーをことができます。このプロトコルは、(すなわち、cscl 浄化)、他の人に比べての最大の利点の 1 つは、必要な作業時間の短縮です。AAV のベクトルを使用する準備ができて、最大 HEK293T 細胞の初期のトランスフェクション後 6 営業日で得られる。
最終的な収量や AAV ベクターの品質にいくつかの要因が影響悪影響。貧しいトランスフェクション効率は低ウイルス収量33のための主な理由の 1 つです。主要な推薦がなく 20 回以上継代されて、トランスフェクション21の時に 90% を超えるセル合流していない HEK293T 細胞の使用であります。さらに、選択したトランスフェクション法では、結果が大きな影響を与える。このプロトコルは、PEI の使用に基づいています。プリンスエド ワード島はカチオン性ポリマー高分子核酸、セルと人身売買によるエンドソーム34によってとられる polyplexes として知られている複合体の生成を介して細胞核に外因性 DNA を提供する能力を持つ。プリンスエド ワード島ベースのトランスフェクションは、簡単かつ迅速に実行、リン酸カルシウム35DNA の共沈殿など、他の広く使用されている方法とは対照的です。また、PEI ベースのトランスフェクションは、カチオン性脂質と磁石を介したトランスフェクション36の使用などの他の新たに導入された方法と比較するとはるかに安いです。
浄化戦略は、プロトコルの重要な役割を果たしています。他の方法と比較して、iodixanol ベース浄化は空ウイルス粒子 (20%)20の割合が高いが含まれて傾向があります。これは、ある程度事実によって相殺 iodixanol ベース浄化は日常的に 100 未満の粒子の感染性比 AAV ベクターの準備の結果します。これは従来の cscl のプロシージャは、対象粒子の感染性のかなりの損失が報告された37と比較して大幅に改善を表します。AAV のベクトルに別の一般的な方法は、クロマトグラフィーによる浄化です。ただし、このメソッドは、特定の列が使用される各ベクトル キャプシドに必要な主な欠点: たとえば、AAV2 はヘパリンの列を使用して古典的な分離が、この方法で動かない AAV4 と AAV5、ヘパリン結合を所有していません。その縁どら38のサイト。クロマトグラフィー精製も高価であることを考えると、浄化の iodixanol ベースは一般的に小規模な33,39,の AAV のベクトルの高品質のバッチを生成したい所に適して40。 ただし、最終的な収量とベクトルの純度を最大限に細心の注意が必要 iodixanol の勾配を作るとき。様々 な iodixanol の分画は、先端部が管の壁に触れて滅菌パスツール ピペットを用いて遠心管に転勤: iodixanol は、ゆっくりと継続的にピペットから追放する必要があります。ベクトル粒子は 40 %iodixanol 層に蓄積、ケア グラデーション インターフェイスが20を混在させないようにする必要があります。最後に、ベクターを含む分数の計 20 g. よりも大きくしないとステンレス鋼の鈍針の挿入によって復旧すべきベクトルの回復を最大にするには、明確な割合がそのままの状態で取得されます。この手順では、タイミングが重要です。準備の純度を損なうことを避けるため、それはグラデーションの他 (汚染) の段階を収集する前に、コレクションを停止することが欠かせません。
得られたベクトル力価の違いはパッケージ化された粒子を生成するベクトルの固有の能力にまた帰することができます。それぞれ異なる AAV の血清型の比較を示したいくつかの AAV のベクトルが他の (例えば、AAV2) よりも高価で生産が難しく41。ベクトルの脱塩のステップの間に沈殿物は低力価の可能な理由をすることができ、一極33を回避することによって簡単に防ぐ。また、それも iodixanol の勾配に基づく精製の効率とはちょっと違う血清型間や、異なる血清型で得られる抗体価の不一致したがって、41を観察することができます可能です。
最後に、それにもかかわらず、qPCR は非常に正確な DNA の定量化法手法でいくつかの自然な可変性が観察された指摘される必要があります。滴定の精度は、主に精密分注とすべてのソリューションの適切なボルテックスに依存します。読んで最も正確な価を保証するため、qPCR 繰り返すことができます独立していない、し、得られた値の平均します。このプロトコルでプライマーの選択は、私たちの研究室で使用される pTransgene プラスミドである CBA プロモーターの順序に基づきます。CBA のプロモーターは、複数の細胞のタイプ間でドライブ式にベクトル分野で広く使用されている強力な合成プロモーターです。サイトメガロ ウイルス (CMV) 初期エンハンサー要素を含む複数の要素が組み込まれていますプロモーター、最初のエクソンと CBA 遺伝子のイントロンが最初ウサギ β グロビン遺伝子のスプライスのアクセプター。ただし、(プロモーター、遺伝子、および規制要素含む) 式カセット内にあるあらゆる要素のプライマーを設計することができます。問題のベクトルに共通の地域に対してプライマーが使用される提供する、バッチ間で抗体価の比較も可能です。
結論としては、このプロトコルは、カプシド、ゲノム構成、プロモーター型および遺伝子貨物の様々 な AAV ベクターを生成する使用できます。これはユーザーを簡単に実験ニーズに合わせて自分のベクトルの最終的な特性を適応になります。代表的な結果の提示例 PHP の使用。効率的に BBB を交差させる、B のキャプシドは、中枢神経系、次尾静脈注射32の高効率遺伝子発現を与えた。CNS 浸透ベクトルの全身投与には、可能性のある副作用2,17,32面でかなりの利点があります。侵襲の警告を回避しながら、末梢注入に可能な選択肢は、脳脊髄液に AAV ベクターの配達から成っている髄腔内配信です。この配信ルートは、周辺臓器や免疫応答42の低レベルで少ないオフターゲット効果、中枢神経系の広範な導入遺伝子発現を示す有効性が証明されます。ただし、髄腔内注射ははるかに難しく、尾静脈注射より高い技術的なスキルが必要なのでです。
カプシドの更なる開発でこの技術を絞り込むは、AAV ベクター使用では遺伝子療法のための機会によって駆動されます。このようなアプローチは、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー ・ マリー ・ トゥース病、パーキンソン病、アルツハイマー病18など、現在不治の中枢神経系疾患を治療するために魅力的な可能性を提供しています。

過去 30 年間、野生型通気は、中枢神経系1,2,3,4への遺伝子導入のための非常に便利なツールであると証明、組換え AAV のベクトルを作成する設計されています 5,6遺伝子治療に病気 (fda と EMA 療法を含む)4,7に近づきます。中枢神経系で使用するための適合性は主として非分裂、分裂後の細胞に感染、通常8CNS で発見する能力から派生します。ただし、AAV を用いたベクトルも他のウイルスのベクトルの7、に比べて穏やかな免疫応答を惹起しながら任意の特定の治療遺伝子4,9長期的な表現を許可する利点があります。 8,10、11,12。
任意の AAV のベクトルの主な要素は、ゲノムとキャプシドです。野生型の通気は、一本鎖 (ss) 約 5 kilobases (kb)13のゲノム DNA ウイルス。組換え AAV のベクトル生産のため担当者とキャップの遺伝子 (ゲノム複製とウイルスのキャプシドのアセンブリに必要) が野生型 AAV のゲノムから削除されトランスのための部屋を去る、transgene14,15を含む式カセット。元のウイルスのゲノムの倒立ターミナル繰り返しシーケンス (ITRs) は、レプリケーションおよび包装の3、10,14必須では、AAV ベクターの残留要素だけです。AAV のベクトルは、遺伝子発現の; を高めるよう設計されてすることができます。ITRs の 1 つの突然変異は、相補的な DNA ストランド3,7,15の生成を効果的にできるヘアピン ループの形成に します。自己補対 (sc) ゲノムと呼ばれる、この構成の主な利点はそれがの第 2 鎖合成さ、速度および遺伝子発現のレベルをかなり増加の従来のライフ サイクルの一般的な必要性をバイパスします。1. それにもかかわらず、scAAV ゲノムを使用するベクターの貨物容量約 2.4 kb に減少します。これにより、遺伝子のシーケンス、プロモーターやマイクロ Rna 結合部位、特定のセルの種類16の式を制限するなど、規制のシーケンスが含まれます。
AAV キャプシド ベクトル ホスト細胞間相互作用を決定し、遺伝子発現の特定の場所への制限にも使える AAV 血清タイプのセル型や組織トロピズムの学位を与えます。他は遺伝子組換え手法 (つまり、PHP 研究所で生産されているに対し、自然にいくつかの AAV の血清型があります。B). さらに、いくつかのカプシドも全身投与後遺伝子中枢神経系全体の配信の結果、BBB を交差する機能など、他の有用な特性を与えます。これは、AAV9 のためだけでなく、最近は、PHP のために示されています。B キャプシド17。結果として、これらの血清型は神経変性疾患1,17,18の新しい遺伝子療法のアプローチのために特に関連する証明します。
このプロトコルの目的は、AAV のベクトルを高価と純度の小規模生産のためコスト効果の高い方法の説明です。ただし、ここで示された結果は、PHP を使用します。B キャプシドと scAAV 式カセット、プロトコルはいくつかの AAV ベクター血清型とゲノム構成では、最大の実験的柔軟性の生産に適しています。ただし、ベクトルの収量および最終的な純度、選択した血清型によって異なります。
プロトコル自体ウイルスのベクトル生産のため古典的なトライ トランスフェクション法の変種で、ベクトル クリーンアップ、セシウム塩化 (CsCl) グラデーションの古典的な使用と比較して、あるされての iodixanol の勾配の使用が組み込まれています時間効率の良い方法19,20,21の高い純度の AAV のベクトルを生産するとされます。
トランスフェクション ・精製・濃縮の手順は、ウイルスのベクトルの作品評価組織培養室で試験実施基準 (GLP) に従って行われなければならないものです。各タスクは、ウイルスのベクトル生産に関する関連の地域および国の法律に準拠して実行し、使用する必要があります。層流フードの下で、無菌状態で、この作業を実施する必要があります。ベクトルの施設内は、通常の組織培養研究室コートに加えて、ラボのエプロンを着用することをお勧めします。さらに、すべての回で、手袋だけでなく、プラスチック製のシューカバーのダブルのペアを着用ください。
前にすべての必要な機器を確保するベクトル生産を開始、プラスミドがあります。1) pCapsid プラスミドには、レプリケーション、Rep78、Rep68、Rep52、および Rep40、すなわちに必要な 4 つの非構造タンパク質をエンコードrep遺伝子には 3 構造キャプシド蛋白質、すなわち VP1、VP2 と VP3 をエンコードキャップ遺伝子が含まれています。2) pHelper プラスミド遺伝子を含んでE4、E2AとVAからアデノ ウイルス、AAV HEK293T 細胞の生産を促進します。3) pTransgene プラスミドには、2 つの ITRs が並ぶ transgene 式カセットが含まれています。これらのプラスミッドはシーケンスの利用可能なオンラインの22を使用して実験室で合成・ デ ・ ノボをすることができます。プラスミド・ デ ・ ノボを作られて、新規遺伝子を含む特にそれらシーケンス必要です、遺伝子と ITRs が正しいことを確認します。また、オンライン プラスミド リポジトリを通じてあらかじめ作られたプラスミドを直接取得できます。必要に応じて、プラスミドは増幅することができ、製造元の手順23によると標準的なキットを使用して精製します。
ベクトル力価、純度は、ベクトルの伝達能力は悪影響があります。追加のプロトコルは、作り出されたベクトルの品質評価に供給されます。最終的なベクトルの in vitroとin vivoの両方で中枢神経系細胞機能の研究に有用であります。

<table><tbody><tr><td>Plasmid production</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTransgene plasmid</td><td>De novo designまたはプラスミドリポジトリから取得</td><td>N/A</td><td>詳細については、メインプロトコルのステップ1を参照してください</td></tr><tr><td>pCapsid</td><td>De novo設計またはプラスミドリポジトリから取得</td><td>N/A</td> 詳細については<td>、メインプロトコルのステップ1を参照してください</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド Plus maxi キット</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>AAV Helper-Free System</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養およびトランスフェクション </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコs Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td><td>Life technologies</td><td>11960-044</td><td>FBS (1% or 10% v/v) と GlutaMAX 200 mM (1% v/v) で DMEM を補い、0.22 &micro を使用して培地をろ過滅菌します。mフィルター</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplement</td><td>GIBCO</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>(200 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コーニング ボトルトップ真空フィルターシステム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'カルシウムおよびマグネシウムのなかったリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>GIBCO</td><td>の14190094</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td>アメリカのティッシュカルチャーのコレクション</td><td>CRL3216</td><td>受け取ったら、プロトコルに記載されているように細胞および培養を解凍する。最小限のパッセージの後、将来のためにサブフラクションを凍結します。&nbsp;常に継代番号20より下のセルを使用してください。培養細胞を20回以上継代したら、保存した分注から培養を再開します</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>Greiner Cellstar</td><td>639160</td><td>直径15cmの培養皿</td></tr><tr><td>細胞スクレーパー</td><td>VWR</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン(PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>粉末状のPEIは1μで溶解します。g/&micro;脱イオン水(ddwater)中のpH = 2(HClを使用)のL。ビーカーで準備し、2〜3時間かき混ぜます。溶解したら、NaOHでpHを7に戻します。再懸濁したストック溶液を滅菌し、-20°Cで1mlのアリコートに保管します。
 複数回凍結/解凍します。</td></tr><tr><td>Virkon solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9821357</td><td>Virkon solution</td></tr><tr><td>Mutexi 長袖エプロン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>11735423</td><td>通常の白衣の上にエプロンを着用</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 最大保護 使い捨てオーバーシューズ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td><td>ック 15401952</td><td></td></tr><tr><td>AAV 精製および脱塩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optiprep 密度勾配培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep は、水中のイオジキサノールの 60% (w/v) 溶液です (滅菌)。注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P0290</td><td>注意。層流フードの下で使用</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z627992</td><td>使用前に滅菌</td></tr><tr><td>OptiSeal ポリプロピレンチューブ</td><td>ベックマン</td><td>361625</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ (250 U/&micro;L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>すぐに使用できるソリューションとして供給</td></tr><tr><td>Acrodiscシリンジフィルター</td><td>ポールコーポレーション</td><td>4614</td><td></td></tr><tr><td>Omnifixシリンジ(5 mL)</td><td>ブラウン</td><td>4617053V</td><td></td></tr><tr><td>鈍いシリンジニードル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z261378</td><td>ステンレス鋼316シリンジ針、ピペッティング鈍い 90&deg; チップゲージ16、L 4 in.本文中では鈍い針と呼ばれ</td></tr>ています <tr><td>Aqua Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td>滅菌エンドトキシンフリーの水。「超純水」</td></tr>と呼ばれる<tr><td>アミコン超15遠心フィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td>UFC910024</td><td>これらのフィルターは、連続的な遠心分離ステップでベクトル粒子を収集することにより最終製品を濃縮</td></tr>します <tr><td>プルロニックF68(100x)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>24040032</td><td>非イオン性界面活性剤。滅菌PBSで希釈して0.01%(v / v)で使用する</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-374</td><td>取り扱いが簡単なスカート付きチューブを使用してください</td></tr><tr><td>AAV 滴定</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>制限酵素:StuI (10 U/&micro;L)</td><td>プロメガ</td><td>R6421</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (1 U/&micro;L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115852001</td><td>超純水で再構成し、最終濃度 10 mg/mL で使用します。溶液は-20°Cで保存できます。C</td></tr><tr><td>EasyStrip Plus チューブストリップ (キャップ付き)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB2000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microtube 3810x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>White ポリプロピレンプレート (固有の識別バーコード付き)</td></tr><tr><td>マイクロシール 'A' PCR プレートと PCR プレート シーリングフィルム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>msa5001</td><td></td></tr><tr><td>AAV 純度制御 </強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>超純水で 10% (v/v) に再構成します。注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td>注意<td>。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>トリスベース ULTROLグレード</td><td>メルク</td><td>648311</td><td>注意:層流フードの下で使用してください。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&reg;Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.3</td><td>30%アクリルアミドおよびビスアクリルアミド水溶液を37.5:1の比率で配合。注意: 層流フードの下で使用してください。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>Serva Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6104-58-1</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus 染色済みマーカー</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374edu</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td>注意: 層流フードの下で使用してください。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>Immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GFP</td><td>Synaptic Systems</td><td>132002</td><td>1:300 希釈</td></tr><tr><td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>Equipmentstrong</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Vector production lab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotina 380ベンチトップ遠心分離機 *</td><td>Hettich</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN 80 超遠心分離機 *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>Entris digitalスケール *</td><td>ザルトリウス</td><td>2202-1S</td><td></td></tr><tr><td>温水浴 *</td><td></td><td></td><td>37°Cに設定;C</td></tr><tr><td>アイスバケツ *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td>ベクター生産ラボで使用する材料は、標準的なラボエリアで使用する材料とは別にしてください</td></tr><tr><td>Pipetboy pro *</td><td>Integra</td><td>156,400</td><td></td></tr><tr><td>目盛り付きピペット:セルスター *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>5mLの容量</td></tr><tr><td>目盛り付きピペット:セルスター *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>10mLの容量</td></tr><tr><td>目盛り付きピペット Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>容量 25 mL</td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター CB150 *</td><td>バインダー</td><td>9040-0038</td><td>37°Cに設定;C、5% CO2、湿度 95%</td></tr><tr><td>Nuaire 安全キャビネット NU 437-400E *</td><td>Labexchange</td><td>31324</td><td>使用前後に 70% エタノールと Virkon ですべての表面を清掃</td></tr><tr><td>Conventional lab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー *</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II *</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー *</td><td>エッペンドルフ</td><td>C 5382000015</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ *</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND 2000</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアンテトラセル*</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658001FC</td><td>ハンドメイドまたはプレキャストゲル用</td></tr><tr><td>プロテオシルバーシルバーステインキット</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>PROTSIL1</td><td>低バックグラウンドによる高感度タンパク質検出</td></tr><tr><td>遠心分離機 5804 R *</td><td>エッペンドルフ</td><td>B1_022628045</td><td>中容量のニーズに対応する高速遠心分離機(最大250mL)</td></tr><tr><td>目盛り付きピペット セルスター *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>目盛り付きピペット セルスター *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>目盛り付きピペット セルスター *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>フィルターチップ *</td><td>Greiner bio-one</td><td>750257</td><td>1250 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>フィルターチップ *</td><td>Greiner bio-one</td><td>738257</td><td>300 &micro;L</td></tr><tr><td>フィルターチップ *</td><td>Greiner bio-one</td><td>771257</td><td>10 & micro;L</td></tr><tr><td>ふた付きアイスバケツ *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td></td></tr><tr><td>ミニダイヤフラム真空ポンプ、VP 86 *</td><td>VWR</td><td>181-0065</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマンP2</td><td>ギルソン</td><td>F144801</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペットマンP20</td><td>ギルソン</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマンP100</td>ギ<td>ルソン</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマンP200</td><td>ギルソン</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>* アスタリスクでマークされた材料は高価な機器であり、通常は複数のラボ間で共有される中央インフラストラクチャ アイテムです。これらのアイテムは、利用可能な場合は同等のものと交換することもできます。異なる超遠心分離機を使用する場合は、正しいローターと遠心分離チューブを選択するように注意する必要があります。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

アデノ随伴ウイルス (通気) に基づく遺伝子配信ツールは、遺伝子療法アプリケーションを含む中枢神経系 (CNS) に transgenes の配信するための人気のある選択肢です。AAV のベクトルは非複製、分割、非分割の細胞に感染して長期的な遺伝子発現を提供することができます。重要なは、いくつかの血清型、新しく記述された PHP など。B、血液脳関門 (BBB) 動物モデルでクロスすることができます以下の全身配信。研究室での AAV のベクトルを効率的に生成できます。しかし、堅牢かつ再現性のあるプロトコルが十分な純度のレベルと十分な体内用高価値の AAV のベクトルを取得する必要です。このプロトコルでは、iodixanol の勾配浄化戦略に基づいて、AAV のベクトル生産の効率的かつ再現可能な戦略について説明します。Iodixanol の浄化方法は、他の浄化方法と比較した場合の高純度、高価 AAV ベクターのバッチを取得に最適です。さらに、プロトコルは一般に現在記載されている他の方法よりも高速です。さらに、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)-ベクトルの純度を決定するベクトル力価として銀染色法の迅速かつ正確な定量ベースの戦略を説明。最後に、AAV PHP の全身投与、中枢神経系への遺伝子導入の代表の結果。B が表示されます。このような結果は、この資料に記載されているプロトコルを使用してすべてのラボでできるはずです。

AAV9 が最近まで考慮された BBB を交差し、中枢神経系、末梢投与の細胞を伝達に最も効果的な AAV ベクターの血清型にします。カプシドの設計で重要な進歩が達成されたとき Devermanらは Cre 組換えベース AAV をターゲットとした進化 (作成)17と呼ばれるキャプシドの選択メソッドを使用。このメソッドを使用して、それらは、PHP という名前新しいキャプシドを識別しました。B: 彼らは全身噴射17に続く複数の中枢神経系領域のニューロンとアストロ サイトの大半を変換することができると報告しました。この時点で、それはする必要があります指摘したにもかかわらず PHP。B (これは最初の分離の実験で使用されるひずみ) C57/Bl6 マウスで肯定的な結果を提供します、速報を示唆その効率はひずみ依存的に異なる場合があります。さらに実験は間違いなく、この問題31光を当てるが。
しかし、にもかかわらず、これらの問題は、PHP。B では、疾患モデルの概念実証の遺伝子治療実験を含むマウスの中枢神経系の非侵襲的遺伝子操作のためのエキサイティングな可能性を提供しています。そのため、PHP を使用して遺伝子発現の効率を評価にしました。B対AAV9、2009年2以来末梢投与中枢神経系伝達の 'ゴールド スタンダード' ベクトルをされています。遺伝子発現により、最適な条件の下で、両方の血清型の直接比較を実行するには、sc ゲノム構成32を使用しました。両方のベクトルは、ユビキタス鶏 β-アクチン (CBA) プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質 (GFP) の遺伝子を運んだ。生後 42 (重量約 20 g) で雌の C57/Bl6 マウスは、1 x 1012 vg scAAV2/PHP のいずれかのマウスごとの線量を受け取った。B CBA GFP または scAAV2/9-CBA-GFP。ベクトル管理だった尾静脈注射を介して実行されます。実験は、ルーヴェンの倫理委員会で承認されました。
3 週間これらマウスは 4% (w/v) 冷たいパラホルムアルデヒド (PFA) に続いて、氷冷 pbs transcardial 潅流を施行しました。自分の脳は収穫され、さらに詳細な分析まで 0.01% (w/v) Na-アジ化/PBS のストレージに転送する前に同じ固定液で一晩インキュベートして産を施行しました。その後、脳が振動ミクロトームを使用して切断された、50 μ m 厚いセクションを免疫組織染色を行った。
遺伝子発現のレベルを評価するセクション GFP (ウサギ抗 GFP) に対して一次抗体に蛍光色素 (抗家兎 Alexa Fluor 488) 二次抗体を用いる検出染まっていた (図 4 a、B).蛍光強度測定 (任意の単位 [au]) で GFP 発現時 sc の大幅な増加を確認したゲノムと PHP。B キャプシドは、AAV9 に対して使用されました。大脳 (2105 ± 161対1441 ± 99 au; GFP の増加を認めたp = 0.0032)、小脳 (2601 ± 196対1737 ± 135 au;p = 0.0032)、および脳幹 (3082 ± 319対2485 ± 88 au;p = 0.0038) (図 4)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> 図 4: scAAV2/PHP の全身配信。B CBA GFP は、中枢神経系における高 GFP 発現に します。scAAV2/PHP。B CBA GFP または scAAV2/9 CBA GFP (1 x 1012英領バージン諸島/マウス) は、6 週間旧 C57/Bl6 マウス尾静脈注射で投与されました。GFP は、コロナの脳のセクション 3 週間これらの免疫組織化学を使用して検出されました。(A) 大脳および小脳と脳幹が表示されます (B)。スケール バー = 1 ミリメートル。 (C) GFP シグナル (10 のセクションごとにマウス; ベクトル グループごとの 3 つのマウス) 各ベクトルで達成のレベルを決定する相対蛍光強度の数量化を行った。一方通行 ANOVA テストを行った、続いて 2 尾スチューデントのt-テスト;データは、平均 ± 標準偏差; として表されます。p &lt; 0.01;au。任意の単位。pCapsid、AAV のベクトル生産用には、血清型 2 型から遺伝子担当者および血清型 PHP から遺伝子キャップが含まれています。B または AAV9、それに応じて。この図は、リンコンから変更されているら32。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、生成する効率的かつ再現性のある戦略、力価、およびアデノ随伴ウイルスベクターの品質管理バッチについて述べる。それは高価にベクトル準備を取得するユーザーをことができます (1013ベクトル ゲノム/mL x ≥ 1) と高純度、生体外でまたは生体内で使用する準備ができて。

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

このプロトコルに従うことによって、ユーザは高純度のAAVベクターを産生し、インビトロまたはインビボ用途に適した収量を得ることができる。このプロトコルは、構成の違いを持つAAV血清型の範囲を製造し、精製するために使用することができます。これら2つの元素を組み合わせることは、細胞型および組織特異的発現を得るのに有用であり得る。いくつかの血清型の生産は、低収率を与えることができます。これは、密接な血清型があり、個々に評価されるべき生産です。これらの手順を実証することは、私たちの研究室の技術者シェリー・フリポンです。HEK細胞を増殖した後、ヘルパープラスミドの360マイクログラム、ベクターカプシドをコードするプラスミドの180マイクログラム、および150ミリモル塩化ナトリウムの18ミリリットルでトランスジーンを含むプラスミドの180マイクログラムを混合し、DNA混合物を調製する。このミックスを3本の50ミリリットル円錐形チューブに分配します。新しい円錐形チューブで、840マイクログラムのPEIと150ミリモル塩化ナトリウム6ミリリットルを混合し、6つの細胞培養皿用のPEIミックスを準備します。次に、6ミリリットルのPEIミックスを加え、滴下して、DNAミックスを含む円錐管の1つに滴下する。室温で20分間インキュベートします。次に、培養器から6種類の細胞培養皿を取り除きます。層流フードで、各皿から培地を完全に吸引する。5ミリリットルのあらかじめ温めたDPBSで皿をすすいで、培地の痕跡を取り除く。各皿を軽く傾けて、DPBSが表面全体に均等に分散するようにします。その後、DPBSを軽く吸引する。12ミリリットルのDMEMを各皿にゆっくりと加え、ピペットを皿の端に置きます。PEIとDNA混合物を上下に3〜5回ピペットして混ぜます。6つの細胞培養皿のそれぞれにこの混合物の2ミリリットルをドロップして追加し、慎重に表面全体に配布することを確認します。18個の細胞培養皿に到達するまで、一度に6つの細胞培養皿を使用してこのプロセスを繰り返します。細胞培養皿を軽く振ってPEI DNA混合物を分配する。トランスフェクトした細胞を湿度95%、炭酸ガス5%で摂氏37度で5時間インキュベートします。この後、既存の培地を取り除くことなく、18個の各ディッシュに12ミリリットルのDMEM 10を追加します。同じ条件でトランスフェクトされた細胞をインキュベートし続けます。トランスフェクション後72時間で、細胞スクレーパーを使用して、各培養皿から慎重に細胞を取り外します。培地と2つの培養皿の細胞を15ミリリットルの円錐管に集め、氷の上に保管します。チューブを420倍G、摂氏4度で10分間遠心分離し、遠心分離機の加速と減速を最大に設定します。各チューブから上清を丁寧に廃棄し、廃棄容器にそっと注ぎます。次に、細胞ペレットを含むチューブを氷の上に置きます。各ペレットを2ミリリットルのリシスバッファーに吊り下げ、5~10回上下にピペットで混合します。3本のチューブからAAVを引き出します。まず、再懸濁した細胞をエタノールと混合したドライアイスを含むバケツに入れて凍結します。その後、すぐに摂氏37度に設定された水浴に入れて細胞を解凍します。この凍結と解凍サイクルを3回繰り返して細胞を融解し、AAV粒子を放出します。第3の解凍ステップの後、1167倍Gで遠心分離機、15分間摂氏4度で。慎重に50ミリリットルの円錐管をきれいにするために上清を移します。各チューブにヌクレアーゼを加えて、上清のミリリットル当たり50単位の最終濃度にします。37°Cで30分間インキュベートし、10分ごとにチューブを渦巻きさせ、ヌクレアーゼが上清と完全に混合されるようにします。上清を明確にするために13490倍Gで、摂氏4度で20分間遠心分離機。この後、10ミリリットルのシリンジのプランジャーを取り外し、0.45マイクロメートルのフィルターをシリンジに取り付け、清潔な50ミリリットル円錐形チューブの上に置きます。慎重に明確化した上清で注射器を充填します。プランジャーを使用して、フィルターを通してライセートを強制します。次に、テキストプロトコルの表1に概説されているように、4つの別々の50ミリリットル円錐管に各iodiキサノール画分を調製する。ピペット8ミリリットルの15%のイオジキサノールを3つの超遠心チューブのそれぞれに入れた。ピペット5.5ミリリットルの25%のイオジキサノールを清潔な50ミリリットルの円錐管に入れた。非卒業パスツールピペットを使用して、慎重に15%のiodiキサノール溶液の下に25%のiodiキサノール溶液の5.5ミリリットルを重ね。テキスト プロトコルで説明されているように、40% と 60% のソリューションを追加します。イオジキサノール画分は、層状に混ぜてはならない。パスツールピペットを使用して、粗溶解液とイオジキサノール溶液との界面を乱さないように、15%のiodiキサノール勾配の上に粗溶解物を重ね、滴下して落とす。半月板がチューブネックの基部に到達するまで、各超遠心チューブにリシスバッファーを充填し、超遠心分離中に発生する非常に高い力でチューブが崩壊しないようにします。適切な蓋を使用してチューブを閉じます。デジタルスケールを使用して、3つの超遠心チューブがすべて同じ重量を持っていることを確認してください。必要に応じて重量を調整し、粗リセートの上にさらにリシスバッファーを加える。固定角度のチタンローターを使用して、最大加速度と減速を使用して、301580倍Gでチューブを遠心分離し、摂氏12度で1時間40分間使用します。次に、5ミリリットルの注射器に針を取り付けます。ローターのチューブからスペーサーを取り出し、遠心分離後にチューブを回収します。ベクター粒子を含む40%のイオジキサノール画分のみを吸引する。サンプルを処理するか、摂氏4度で保存します。ここで、様々なキャプシド、ゲノム構成、プロモータータイプ、およびトランスジーン貨物を用いてAAVベクターを産生することができるプロトコルが実証される。この例では、自己の無料ゲノムから緑色蛍光タンパク質を発現する2つの異なるAAVベクターを製造および精製しました。2 つのベクトルは、PHPB と AAV9 という異なるキャプシドによって区別されます。彼らは尾静脈注射を介して、成体C57黒6匹のマウスに送達された。注射後3週間で遺伝子導入発現のレベルを評価するために、切片は蛍光色素に結合した二次抗体を用いた検出を用いてGFPに対する一次抗体で染色される。蛍光強度測定では、AAV9に対してPHPBベクターを使用した場合のGFP発現の有意な増加を示す。GFPの増加は、大脳、小脳、および脳幹で観察された。このプロトコルでは、分数を含むベクトルの正確なコレクションが重要です。これが適切に行われていない場合、ベクターの収率とベクターの純度が悪影響を受けます。AAVベクターを産生することができるので、小さな実験室は中枢神経系に遺伝子を送達するために多くの実験的可能性を利用する立場にあるでしょう。このプロトコルは、超遠心分離機の使用を必要とし、事故を避けるために、これを処理する前に適切な訓練を受けることが重要です。さらに、AAVベクターはバイオハザードに分類されることが多いため、それらを取り扱い管理する前に現地の規制を参照する必要があります。

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