Name: ラット胎盤ナチュラルキラー細胞細胞溶解機能の評価のためのプレートベースの細胞毒性アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶラット胎盤由来ナチュラルキラー細胞の細胞毒性評価法。プレートベースの比色アッセイを用いて、免疫応答におけるNK細胞機能を簡便かつ安全に解析する手法を解説します。

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この研究は、グラント R00HL130456 の下で国立衛生研究所の国立心臓肺と血液研究所によってサポートされていました, 国立衛生研究所の P20GM104357 賞の下で, そして、ミシシッピ INBRE は、認可番号 P20GM103476 の下で国立衛生研究所の一般医学研究所からの制度的開発賞 (アイデア) によって資金を提供されました。コンテンツは、著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

すべてのプロトコルは、ミシシッピ大学医療センターの機関の動物ケアと使用委員会によって承認されました。動物のケアと取り扱いは、倫理的な動物治療のための健康ガイドラインの国立研究所と一致していました。
1. 胎盤からのリンパ球細胞の分離
<ol><li>ラット子宮から1つの胎盤を除去し (妊娠19日目)、10 mL の氷冷 PBS8に入れる。</li>
	<li>100μ m フィルターに1つの胎盤を置き、13.5 mL の RPMI および 1.5 mL の FBS を含むペトリ皿に座らせる (総容積は 15 mL である)。注射器の平らな面を使用してフィルターを通して胎盤をペトリ皿に押し込む。</li>
	<li>各組織に 3 15 mL の円錐チューブを準備します。各チューブに密度勾配培地 (材料の表を参照) を 3 ml 追加し、均質化した胎盤5ml を各チューブに慎重にオーバーレイします。</li>
	<li>300 x gで室温 (RT) で25分間遠心分離し、ブレーキをかけない。転写ピペットで薄い白のバフィー層を収集します。 注:遠心分離後、3層が表示され、上部には赤色の RPMI、中央には白色の軟部層、下部には透明な密度の勾配媒体層があります。トランスファーピペットを使用して、チューブから白いバフィー層を引き上げます。同じ胎盤のすべてのチューブからのバフィー層を1つのチューブに結合します。</li>
	<li>結合されたバフィー層に 10 mL の RPMI を加えます。10分、300 x g、4° c で遠心分離を行い、上清を廃棄します。</li>
</ol>2. ナチュラルキラー細胞の分離
<ol><li>50μ l の氷冷 PBS 中の再懸濁細胞ペレット</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従ってペレット化された細胞にビオチン標識 CD3 抗体を追加し、ピペットでよく混ぜる.チューブ回転子にチューブを置き、4° c で20分インキュベートします。</li>
	<li>1 mL の RPMI を加え、400 x gおよび4° c で10分間遠心分離し、そして上澄みを捨てる。</li>
	<li>再懸濁ペレットを 1 mL の RPMI で、1.5 mL マイクロ遠心チューブ中の150μ l の磁気ビーズと組み合わせます。チューブ回転子にマイクロ遠心チューブを置き、4° c で30分間インキュベートしながら回転させます。 注:この時点でリリースバッファを引き出して、バイオセーフティキャビネットの RT に到達することができます。</li>
	<li>1分間の磁石にチューブを配置し、上清を収集し、氷の上に 15 mL のチューブ内の CD3 細胞集団を保存します。 注:これは CD3-細胞の集団です。</li>
	<li>マグネットからチューブを取り出し、1 mL の RPMI を加えます。ピペットで細胞とビーズを5回混合する。</li>
	<li>ステップ2.5 を繰り返します。</li>
	<li>400 x gおよび4° c で10分間細胞の CD3-集団を遠心分離し、上清を捨てる。細胞ペレットを50μ l の氷冷 PBS で再懸濁</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って CD3 細胞にビオチン標識された CD161a 抗体を追加し、よく混ぜる.チューブ回転子にチューブを置き、4° c で20分間インキュベートします。</li>
	<li>1 mL の RPMI を加え、400 x gおよび4° c で10分間遠心分離し、そして上澄みを捨てる。再懸濁ペレットを 1 mL の RPMI で、1.5 mL マイクロ遠心チューブ中の150μ l の磁気ビーズと組み合わせます。</li>
	<li>チューブ回転子にマイクロ遠心チューブを配置し、4° c で30分間インキュベートしながら回転させます。</li>
	<li>1分間磁石にチューブを置き、上清を収集し、CD3-/CD161a 細胞を捨てます。</li>
	<li>マグネットからチューブを取り出し、1 mL の RPMI を加えます。ピペットで細胞とビーズを5回混合する。</li>
	<li>ステップ2.12 を繰り返します。</li>
	<li>マグネットからマイクロ遠心チューブを取り外し、1 mL の RT リリースバッファを追加します。管の回転子に管を置き、RT の 15 min のためにインキュベートしている間回転しなさい。</li>
	<li>1分間磁石にチューブを置き、氷の上に新しい 15 mL の円錐管で上清を収集します。 注:これが NK 細胞の個体数です。</li>
	<li>マグネットからチューブを取り出し、RT RPMI 1 mL を加えます。ピペットで細胞とビーズを5回混合します。</li>
	<li>ステップ2.16 を繰り返し、同じチューブに上清を置く。よく混ぜると細胞を数える20μ l のサンプルを取る 注:チューブを氷上に保つ。</li>
	<li>/CD161a +細胞を 10 分間、400 x gを4° c で遠心分離し、その後、上清を除去する。再懸濁の細胞を RPMI (10% FBS、1% ペン/喉頭炎、2 ng/mL IL-2) および 3 x 105細胞/ウェルの 2.5 ML の NK 細胞活性化培地中で播種する。48 h の細胞を37° c でインキュベートし、 5% co2 を加湿したインキュベーター内で培養する。</li>
</ol>3. 細胞毒性アッセイ: 培養または通過細胞から NK 細胞または YAC1 を取り出す
注:すべてのステップは、ボンネットの下で行わなければなりません。すべての細胞管は常に氷上で維持されなければならない。
<ol><li>ガラス血清 pipet を使用して、フラスコから YAC1 細胞および培地を収集し、氷上で 50 mL チューブに置き、よく混ぜる。細胞を数える20μ l を取る。</li>
	<li>YAC1 細胞を 300 x gおよび4° c で10分間スピンさせる。これらがスピンしている間、セルを数えます。</li>
	<li>NK 細胞6ウェルプレートの各ウェルにトリプシン/EDTA を加えます。プレートをタップし、インキュベーター内に配置します。</li>
	<li>細胞をトリプシン/EDTA と共に37° c で ~ 5 分間インキュベートした後、プレート/フラスコを滅菌プレートスクレーパーで掻き取る。各ウェルに 1 mL の NK 細胞培地を加えます。</li>
	<li>血清学的 pipet を用いて細胞および培地を収集し、15 mL の遠心管に集めます。細胞を数える20μ l を取る。</li>
	<li>NK 細胞を10分間、400 x gを4° c で回転させる。この遠心分離の間にステップ3.5 からの細胞のサンプルを数える。 注:培養プレートを廃棄する前に顕微鏡で見て、井戸の底に付着した細胞がないことを確認します。この実験では NK 細胞と YAC1 細胞を使用しているため、それぞれを個別にカウントしてください。</li>
	<li>最適化試験で決定された濃度で細胞および再懸濁をカウントし、適切な数の標的: エフェクター比を試験する。これは、次の細胞濃度を作るために、対応する媒体中のペレットを再懸濁させることによって達成される: 4 x 105細胞/ML で YAC1、NK 細胞を 2 x 107細胞/ml で。</li>
</ol>4. 細胞毒性アッセイ: アッセイプロトコル
<ol><li>円形ボトムを使用して、培養処理 96-ウェルプレートは、表 1に示唆されるようにプレートをセットアップする。次の表は、実験的なコントロールと3セットの NK 実験カラムを示しています。これは96プレートの NK 実験カラムを合計10個まで拡大することができます。</li>
	<li>250 x gのアッセイプレートを4分間遠心し、エフェクタとターゲットセルが接触していることを確認します。96-ウェルプレートを37° c で加湿されたチャンバーインキュベーター内で5時間インキュベートし、5% co2 をエフェクター細胞による標的細胞およびエフェクターセルと標的細胞溶解との十分な接触を達成する。 注:プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>45分上清を収穫する前に、ターゲット細胞最大 LDH 放出ウェル (ウェル1E、1F、1G、1H) に10μ l を添加し、プレートを加湿チャンバ内に戻します。</li>
	<li>インキュベーション時間が終了したら、250 x gのプレートをマルチチャンネル Pipettor を使用して4分間遠心し、すべてのウェルから50μ l のアリコートを新鮮な96ウェルフラットボトムアッセイプレートに移します。 注:細胞が新鮮なアッセイプレートに移されないように、ウェルの底部に触れないでください。培養処理したプレートをフレッシュなアッセイプレートとして使用しないでください。</li>
	<li>
アッセイ試薬を作成します。
	<ol>
<li>アッセイバッファーが室温に達した後、12 mL のアッセイバッファーを1つの基板混合ボトルに追加します。反転し、完全に溶解するまで穏やかに振る。1ボトルは 2 96 ウェルプレートのために十分です。 注:アッセイバッファーは、解凍中に光から保護する必要があります。使用直前に混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ4.6 からのアッセイプレートのすべてのウェルに50μ l のアッセイ試薬を加えます。光から保護するためにホイルでプレートを覆い、室温で30分インキュベートします。 注:新しく作られた試金試薬はフリーザーで貯えられるべきである。試薬は約8週間有効です。</li>
	<li>各井戸に50μ l の停止溶液を加えます。停止溶液を加えた後、1時間以内にプレートを読み取り、490 nm で吸光度を記録します。代表的なデータを表 2に示す。</li>
</ol>5. 結果の計算
<ol><li>培養基のバックグラウンドウェルからの平均吸光度値を計算し、実験のためのすべての吸光度値から差し引く、標的細胞自発的 LDH 放出およびエフェクター細胞自発 LDH 放出井戸。</li>
	<li>ボリューム補正制御ウェルの平均吸光度値を計算し、ターゲットセル最大 LDH 放出制御ウェルについて取得された吸光度値から減算します。</li>
	<li>次の式でステップ5.1 と5.2 の修正後の値を使用して、各エフェクタの細胞毒性率を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58961/58961eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Mediators%3A+A+causal+link+to+hypertension+during+pregnancy-+Studies+in+Preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia.</a> British Journal of Pharmacology. , (2018).</li>
<li>Elfarra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+mediate+pathophysiology+in+response+to+reduced+uterine+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure.</a> Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).</li>
<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), 0141074(2015).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), 89357(2014).</li>
<li>Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+gastroschisis+experimental+model+and+the+influence+of+the+mother%27s+diet+enriched+with+glutamine+in+the+fetal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cir%C3%BArgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology.</a> Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).</li>
<li>Lv, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+distinction+of+rat+liver+natural+killer+cells+from+spleen+natural+killer+cells+under+normal+and+acidic+conditions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+and+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro.</a> Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).</li>
<li>Flieger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+cellular+cytotoxicity+test+based+on+the+differential+assessment+of+living+and+killed+target+and+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
</ol>

利益相反、金銭的またはその他の利害関係は、著者によって宣言されていません。

最適な結果を得られるように考慮すべき重要事項がいくつかあります。利用される細胞の無菌性は非常に重要である。胎盤の採取の後、NK 細胞の調製および単離がバイオセーフティキャビネットの無菌条件下で行われることが重要です。さらに、すべての細胞が細胞損傷によって LDH を放出するので、分離後および共培養プロセス中に NK 細胞の高い生存率を得るために注意が必要である。NK 細胞からの自然な LDH 放出が多すぎると、しばしば陰性で使用できないデータが生じることがある
このプロトコルには、ユーザーとそのニーズに固有のいくつかの側面があります。例えば、この記事では、機械的および酵素的分解などの方法に加えて胎盤からの単核細胞の単離のための様々な方法がある。さらに、最適な標的細胞数およびエフェクターを決定するためにユーザが、それらの実験に適するであろう目標比である。我々の手では、1万の標的細胞およびエフェクター: 50:1 の標的比は、我々の実験に最適であると判定された。これらの数は、選択された標的細胞および NK 細胞が単離される組織に応じて変化し得る。他の研究者は、肝臓および脾臓<sup c...

子癇前症は、胎児の発育制限、末端器官の損傷および慢性免疫活性化によって特徴付けられる妊娠の高血圧性障害である。子癇前症の女性における慢性免疫活性化は、増加した循環および胎盤炎症性サイトカイン、CD4+ T 細胞集団の不均衡、および活性化されたナチュラルキラー (NK) 細胞の集団の増加につながる。当研究室が最近発表した研究は、子癇前症の減少した子宮灌流圧 (ラップ) ラットモデルにおける子癇前症に関連する病態生理学の一部を引き起こすことにおける NK 細胞の役割を実証する。フローサイトメトリーを用いて、NK 細胞に対する活性化マーカーの表面発現を測定するために、正常な妊娠 (NP) ラットと比較してラップラットの循環および胎盤における活性化 NK 細胞の集団の増加が観察された2。
フローサイトメトリー観測を確認するために、NP およびラップラットの胎盤から単離された NK 細胞の細胞傷害活性を評価するための機能的研究を行った。細胞傷害性 CD8+ T 細胞および NK 細胞の細胞毒性機能の評価のために利用可能ないくつかの方法がある。機能的細胞傷害性分析のための金本位は、クロム放出アッセイ3である。利用される他の発達したプロトコルは、フローサイトメトリー4、イメージサイトメトリ5、カルセインリリース6、および最も最近の生物発光7を含む。このビデオでは、市販の LDH 細胞毒性アッセイキットを使用して NK セルの細胞毒性機能を測定するために、十分に確立された乳酸脱水素酵素 (LDH) 放出アッセイを用いた詳細なプロトコルを提供する。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf チューブ</td><td>Fisher</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>100 & micro;L フィルター</td><td>フィッシャー</td><td>22363549</td><td>ナイロン メッシュ</td></tr><tr><td>15 mL コニカル チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>3 mL シリンジ</td><td>フィッシャー</td><td>14823436</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカル チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>7203510</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル細胞培養プレート</td><td>コーニング</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル組織培養プレート</td><td>CELLTREAT</td><td>229190</td><td>滅菌、丸底</td></tr><tr><td>AOPI</td><td>Nexcelom</td><td>CS201065ML</td><td></td></tr><tr><td>細胞スクレーパー</td><td>フィッシャー</td><td>8100241</td><td></td></tr><tr><td>セロメーター 使い捨て計数チャンバー</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>セロメーター ビジョンイメージサイトメーター</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox 96 非放射性細胞毒性アッセイキット</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Flowcomp Flexi Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11061D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sigma</td><td>Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Fisher</td><td>NC0460539</td><td>Density gradient中程度;4 x 250 mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>フィッシャー</td><td>SH3025801</td><td>10 x 500 mL</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td>9720500</td><td>パッドなし</td></tr><tr><td>精製マウス抗ラット CD161a</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>555006</td><td></td></tr><tr><td>精製マウス抗ラット CD3</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>554829</td><td></td></tr><tr><td>組換えラットIL-2</td><td>R&D Systems</td><td>502-RL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td>1640 Medium</td></tr><tr><td>T25 フラスコ</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>YAC-1 cell</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr></tbody></table>

ラット胎盤ナチュラルキラー細胞細胞溶解機能の評価のためのプレートベースの細胞毒性アッセイ

A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function

Decidual ナチュラルキラー (NK) 細胞が正常妊娠の確立と維持に重要な役割を果たすことはよく知られています。最近の研究は、再発流産や子癇前症などの有害な妊娠合併症に苦しむ女性で、循環し、decidual NK 細胞の変化した人口を示しました。我々のグループからの研究では、妊娠中の高血圧は、表面活性化マーカーの発現に基づいて、胎盤の活性化された NK 細胞の増加した集団と関連していることが示されている。本稿では、外科的に誘導された胎盤虚血の子癇前症様動物モデルに胎盤から分離した NK 細胞の細胞毒性機能を評価するための詳細なプロトコールを提供する。以下のステップについて詳細に説明する: 単一細胞懸濁液の生成、NK 細胞単離、ex in vivo 刺激、エフェクター: 標的細胞共培養、および細胞傷害アッセイ。

NP 及びラップラットから得られた胎盤 NK 細胞を50:1 の割合でそれぞれの媒体中の標的細胞と共に5時間インキュベートした (NK: 標的)。吸光度は 490 nm で記録され、生データは表 2に示されている。培地背景と体積補正制御ウェルの平均吸光度を計算した。これらの平均値は、製造元のプロトコルに示されている適切なウェルから減算され、表 3に示します。次いで、修正された値を、製造業者によって提供されるプロトコルを使用して% 細胞傷害性を得るために使用した (表 4)。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tcs</td>
			<td>Vcc</td>
			<td>ECSR-1</td>
			<td>ECSR-2</td>
			<td>ECSR-3</td>
		</tr>
<tr>...

ここでは、比色プレートアッセイによって胎盤からナチュラルキラー細胞の細胞毒性機能を分離・評価するための詳細な方法論を提供する。胎盤虚血の減少した子宮灌流圧ラットモデルは、抗体媒介性の分離とナチュラルキラー細胞の細胞傷害機能の評価を実証するために選ばれた。

It is well known that decidual natural killer (NK) cells play a critical role in establishment and maintenance of normal pregnancy. Recent studies have ...

この方法は、特殊な装置を必要としない簡単で安価な方法を用いて、異なる細胞型の細胞傷害活性を比較するのに役立ちます。この技術の主な利点は、危険物の使用を必要とせず、安価であり、特殊な機器の使用を必要としないことです。この方法は、CD8+細胞分解細胞などの他の細胞タイプの細胞傷害活性を測定したり、細胞の培養を行わずに細胞の自発的死を評価したりするために適用することができます。この技術に新しい個人は、エフェクター細胞比への目標の最適化に苦労する可能性が高い.私のアドバイスは、プロトコルを最適化するときにテストする比率を決定するために文献を徹底的に検索することです。この方法は、正確にピペットを行う以外に専門的なスキルを必要としませんが、単核細胞の単離とアッセイプレートのセットアップは、視覚的に観察されれば理解され、模倣することができるステップです。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるチェルシー・ジェケリーです。この手順を開始するには、100マイクロメートルフィルターを含むペトリ皿に1.5ミリリットルのFBSで13.5ミリリットルのRPMIを加えます。フィルターに1つの胎盤を置き、注射器プランジャーの平らな側面を使用して、フィルターを通してペトリ皿に押し込みます。次に、各組織に対して3本の15ミリリットル円錐管をセットする。各チューブに3ミリリットルの密度勾配媒体を加え、均質化された胎盤の5ミリリットルを各チューブにゆっくりと重ね合わせていきます。Gの300倍、室温で25分間、休憩なしで遠心分離機。次に、移管ピペットを使用して薄い白いバフィー層を採取する。組み合わせたバフィー層にRPMIを10ミリリットル加えます。遠心分離機はGの300倍、摂氏4度で10分間、上清を捨てます。まず、50マイクロリットルの氷冷PBSで細胞ペレットを再懸濁する。メーカーのプロトコルに従ってビオチン標識CD3抗体を加え、ピペットとよく混ぜます。チューブをチューブ回転器に入れ、摂氏4度で20分間インキュベートします。次に、RPMIを1ミリリットル加えます。400倍Gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を捨て、RPMIの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに150マイクロリットルの磁気ビーズと細胞懸濁液を組み合わせます。チューブをチューブ回転器に移し、摂氏4度で30分間インキュベートしながら回転させます。インキュベーション中に、放出バッファーを取り出し、バイオセーフティキャビネット内の室温に達させます。インキュベーションが完了したら、チューブをマグネットに1分間入れ、上清を収集し、氷の上の15ミリリットルのチューブにCD3陰性細胞集団を保存します。磁石からチューブを取り出し、RPMIを1ミリリットル加え、ピペットを使って細胞とビーズを5回混合

a-plate-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-rat-placental-natural

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

HIV感染細胞にナチュラルキラー細胞溶解反応を測定するために細胞毒性のアッセイは、標的細胞の純度によって制限されます。ここでは、CD4をダウンモジュレートするHIV - 1の能力を活用することにより、HIV -...

ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるHIV - 1感染プライマリCD4 + T細胞を標的細胞としての準備と使用

このビデオは、カルセインAM染色剤を使用して、がん細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞毒性を測定するアッセイを示しています。ナチュラルキラー細胞との共培養後に蛍光がん細胞の数が減少することは、ナチュラルキラー細胞ががん細胞に対して細胞毒性を示すことを示しています。...

がん細胞に対するナチュラルキラー細胞媒介性細胞毒性を評価するためのカルセインアセトキシメチル染色

このビデオは、がん細胞に対するサイトカイン誘導キラー(CIK)細胞の細胞傷害能力を測定するin...

サイトカイン誘導キラー細胞の細胞傷害性能を研究するためのIn vitroアッセイ

このビデオは、蛍光染色された標的細胞に対するナチュラルキラー細胞の溶解活性を示しています。この手法では、死細胞を染色し、フローサイトメーターを使用して生細胞と死細胞の標的細胞を定量することにより、NK細胞による細胞毒性の測定が可能になります。...

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Flow Cytometric Analysis 用サンプル調製

このビデオでは、乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを実施して、標的がん細胞に対するナチュラルキラー(NK)細胞の細胞毒性を決定する方法を示します。このアッセイは、形成された赤色の生成物の吸光度を測定することにより、がん細胞からの細胞質乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の放出を定量化します。...

がん細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞毒性を評価するためのin vitroアッセイ

Marginating-肝白血球の選択的ハーベスティング

流れ cytometry ベースの人間のナチュラル...

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

がん細胞によるナチュラルキラー(NK)細胞介在の根絶の回避は、がんの開始と進行に重要です。ここでは、肝腫瘍細胞に対するNK細胞媒介性細胞毒性を評価するための非放射活性ベースの2つのプロトコルを紹介する。さらに、NK細胞の移動を分析するための第3のプロトコルが提示されます。...

肝腫瘍細胞の文脈における自然キラー細胞媒介性細胞毒性と遊性の測定

ヒトナチュラルキラー細胞における治療抗体によるFcγRIIIA駆動事象を研究するためのプロトコルをここに説明する。この人工刺激プラットフォームは、脱顆粒、ケモカイン/サイトカイン産生、および結合に関与する抗体のFcγRIIIaおよびFc部分によって媒介されるシグナル伝達経路などの下流エフェクター機能の尋問を可能にする。...

治療抗体の存在下におけるFcγRIIIa関与によるヒトナチュラルキラー細胞事象の評価

このプロトコルは、細胞の生存率を効率的に決定するための、高速で高スループット、信頼性、安価、および公平なアッセイを記述します。このアッセイは、細胞のミトコンドリアが損傷し、他のアッセイに干渉する場合に特に有用である。このアッセイは、Hoechst...

マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぶラット胎盤由来ナチュラルキラー細胞の細胞毒性評価法。プレートベースの比色アッセイを用いて、免疫応答におけるNK細胞機能を簡便かつ安全に解析する手法を解説します。

ラット胎盤ナチュラルキラー細胞細胞溶解機能の評価のためのプレートベースの細胞毒性アッセイ

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