Name: オープン ソース ソフトウェア パイプラインによる寒天培地に固定化活性汚泥粒子径・形状を測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぶ 活性汚泥粒子の粒径・形状測定法。オープンソースソフトウェアを用いた半自動化プロトコルで、主観的バイアスを低減し、多様な形態の粒子を正確に測定できます。廃水処理効率の評価に適用可能です。

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1. 粒子解析のためのサンプルを収集します。
<ol><li>統計分析10の十分な粒子が生成されます特定の原子炉のサンプル ボリュームを決定 (> 500) 粒子の重複を回避しながら。<ol>
<li>混合液のサンプルあたり 0.5 ~ 2 mL の範囲が 250 と 5,000 mg/L の間中断された混合液固体 (MLSS) と汚泥サンプルのために十分であると仮定します。</li>
		<li>それ以外の場合、0.5、2、および 5 mL のサンプル (ステップを通じて 2.7 1.2) を使用して 3 つのテスト寒天プレートを準備します。</li>
		<li>(もしあれば) を視覚的に推定最高サンプル ボリュームが 1.1 の手順に記載されている条件を満たします。</li>
		<li>0.5 mL サンプルの粒子がまだ重なっている場合は、追加 0.5、1、および 2 mL に 0.5 mL のサンプルは、2.1 のステップの前に薄くならなければならない度合いを判断してリン酸緩衝生理食塩水で希釈した 3 つの 0.5 mL サンプル 1.1.2 と 1.1.3 の手順を繰り返します。 注: 手順 1.1 − 1.1.4 実験につき一度のみ実行必要がありますまたは原子炉の内容変更以降の測定値は、もはや基準を満たしているような場合に、1.1 ステップします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>グラブ 〜 40 mL ビーカーまたは 50 mL の遠心管、軽く混合し、すぐに十分に混合されたグラブの断固としたなサンプル ボリュームを 15 mL 遠心管に注ぐによって原子炉の十分に混合された部分からの代表的なサンプルを取得します。1.1.4 の手順によって決定される、必要に応じてサンプルを希釈します。 注: プロトコルがここで一時停止にすることができ、サンプルは、最大 48 時間まで冷蔵 (4 ° C) の下で保存されるかもしれない。サンプルは凍結しないでください。 注意: 一般的な保存媒体 (例えば、ホルムアルデヒド/ホルムアミド) は適していません。オープン コンテナーとの組み合わせで、板の表面積の大きい潜在的不完全に換気された顕微鏡のセットアップと、光源からの熱は、画質に少し利益のため不必要に危険な条件を生成します。</li>
</ol>2. ステンド グラス、固定化粒子の寒天を準備します。
<ol><li>各サンプルに 1% (w/v) メチレン ブルーの 5 μ L を追加し、キャップし、優しく混ぜるを 3 回以上で反転します。サンプルを室温で 30 分以上は、少なくとも 5 の染色を許可します。</li>
	<li>脱イオン水で 7.5% (w/v) 寒天のサンプルあたり約 10 mL を準備します。 注: 寒天が前もって生産し、滅菌される場合無期限に格納されます。アガロースは代えることができるが、イメージは大幅に向上しません。</li>
	<li>電子レンジまたは水浴を使用して寒天を溶かし、使用前にわずかに冷却することができます。寒天が完全に溶け、簡単に注ぐことを確認します。寒天の固体球は質の悪い画像を生成、異なる染色されます。</li>
	<li>6.5 および 9 mL の間に総管容積をもたらす遠心管に十分な溶かされた 7.5% (w/v) 寒天を転送します。</li>
	<li>遠沈管を要約し、優しくミックスに、少なくとも 3 回を反転します。</li>
	<li>自分自身の事からまたはフード キャップを指差しながらキャップを開きます。完全な滑らかなコーティングと視覚的に均一な粒子を達成するために皿を軽く揺動中 100 mm プラスチック シャーレにチューブ内を注ぐ。 注意: 寒天から熱管にわずかな間隙が生じる。これは頻繁に聞こえるヒスノイズが生成され、熱い寒天の小さな小滴を放出する可能性があります。</li>
	<li>寒天が固化するまで、少なくとも 5 分間室温で冷却するプレートを許可します。 注: プロトコルはここで一時停止可能性があります。メッキ ストア反転し、封印されていた (例えば、密封ビニール袋やパラフィン フィルム) 48 時間まで冷蔵 (4 ° C)。</li>
</ol>3. 実体顕微鏡とデジタル カメラを用いた粒子画像を取得します。
<ol><li>10 倍 20 倍の倍率にことができる顕微鏡のステージに表向きで覆いを取られたプレートを配置します。LED 照明スタンドや照明板などの機器を使用しても、拡散光でサンプルを下から照らします。</li>
	<li>イメージ キャプチャ ソフトウェアを開き写真顕微鏡の光パスを設定ことを確認カメラ リストから適切なカメラをクリックします。</li>
	<li>複数のパーティクルは、大規模な明確に定義されたエッジを持つフォーカル プレーンでソフトウェアで表示されるように、顕微鏡を調整します。10-20 倍の倍率を使用すると、比較的深い焦点面を維持しながら粒子を測定します。<ol>
<li>一時的に寒天プレートを削除し、マイクロメータをステージに配置します。マイクロメータの目盛が絞った画像キャプチャ ソフトで表示されるまでは、良い焦点を調整します。</li>
		<li>キャリブレーションされていない場合は、現在の倍率のマイクロ比ピクセルを記録します。<ol>
<li>クリックして、ズームを 100% に設定ズーム > 実際のサイズし、オプション > 調整、0 〜 200 μ m の卒業式を中心とした垂直のバーで、マイクロメータの長軸に沿ってメイン ビューポートで赤い校正バーを配置。[調整] ダイアログ ボックスで、現在の拡大率と 200 μ m の実際の長さを入力します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>場合既にメニュー バーから [表示倍率を調整し、選択現在の倍率レベルし校正を確認します。<ol>
<li>選択測定 > ライン > 任意ライン。0 卒業とマイクロメータの軸の交点をクリックします。200 と長い軸の交差点を再度クリックします。A 正しいキャリブレーションが約 200 を表示する必要があります μ m を削除します。 行クリックし、del キーを押して、確認ボックスではいを押します。 注: カメラのキャリブレーションを選択するための指示は、このハードウェアに使用されるソフトウェアに固有です。同様の機能は、他のイメージング ソフトウェアで利用可能なする必要があります。目標は、正確な粒子サイズ計測用画像のミクロン比するピクセルを決定します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>寒天プレートを交換し、イメージング ソフトウェアの最大の詳細を達成するために良いフォーカスを調整します。</li>
	<li>イメージング ソフトウェアを調整最大の画像品質を実現します。<ol>
<li>カメラのサイドバーのビット深度パネルでラジオ ボタンを選択して、許容される最大値にビット深度を増加します。カメラのサイドバーの色/グレーパネルで該当するラジオ ボタンを選択してグレースケール画像を取得するソフトウェアを設定します。</li>
		<li>露出とヒストグラムの任意の開いているサイドバーのパネルを折りたたみます。1.0 に利得の減少し、ビューポートで、ヒストグラム ボックスの両端にクリップされていない分布とヒストグラムが表示されるまで、鮮明な画像が表示されるまで、露出を増やします。</li>
		<li>避けるためのヒストグラムと露出不足を調整します。カメラのサイド ・ バーのヒストグラム パネルでだけで最低値外にヒストグラムの左端と右端だけで最高値外にスライドさせます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>として、圧縮されていない TIFFイメージのメタデータ内の倍率情報などを使用して、イメージを保存、ファイル > 名前を付けてダイアログ ボックス、TIFF 形式を選択して、キャリブレーション情報を保存ボックスを確保することチェックされます。 注: は空間のキャリブレーションも含め、画像メタデータを保存取得プログラムによって異なります。フィジー15、パイプラインによって使用される基になるソフトウェアは、最も一般的な変種を理解しています。記録するための重要な情報は、ピクセルの高さ、幅、および関連するユニットです。</li>
	<li>どちらかモバイル ステージを使用して、プレート自体を手動で移動または板; 下交互に左から右へと一つとして右から左に移動するパスを次以前の画像を重複しない別のエリアを選択します。またとして知られている ' 芝刈り機検索パターン '。3.6 のステップを繰り返してよりは優れている、少なくとも 500 の視覚的に推定される粒子をキャプチャするための十分なイメージは生成されます。 注: 代替パターン (例えば.、円、ランダム) が許容されるが、報告する必要があります。デジタル ステッチ生成を介してモザイクの組み合わせに対して複数の重複画像を取得大幅ダウン ストリームの処理やステッチからの人工物を妨げる結果として得られるファイルのサイズは導入してもよいし、推奨されていません。</li>
	<li>潜在的なフォロー アップ用画像解析後までプレートを保持します。最終的なイメージング後、生物系廃棄物の適切な破棄します。</li>
</ol>4. 測定、粒子のシルエットを分析
<ol><li>必要な画像解析ソフトウェア パッケージをインストールします。<ol>
<li>フィジーをインストール (」の手順に従って、国立衛生研究所の ImageJ v1.52e の拡張バージョン: https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
		<li>次の手順に従って、存在しない場合、git をインストール: https://git-scm.com/downloads</li>
		<li>16git リポジトリのクローンを作成してから粒子解析コードを取得します。<ol>
<li>コマンド ・ ラインで入力してコードの最新バージョンを取得します。 git のクローン https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git<ol>
<li>クローンしたリポジトリの最上位のディレクトリで見つかった README.md テキストファイルの指示解析コード次をインストールします。 注: は、それが自動的にコードの最新バージョンを取得、最寄り、git を使ってです。Git を使用できない場合もコードのリリース ページに zip ファイルとしてダウンロード可能です: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>省略可能なパラメーターと共に、処理されるディレクトリを列挙したテキスト ファイルを編集します。パラメーターの例一覧例/分析サブディレクトリを参照します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>コマンドラインで入力して分析を実行します。 < フィジー パス > \ImageJ-win64.exe - コンソール - マクロ SParMorIA SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile > ここで < フィジー パス > は ImageJ win64.exe が置かれているディレクトリ、< paramsfile > 解析セットアップを記述するテキスト ファイルの場所 注: にインストールされているオペレーティング システムのフィジーをによって実行可能ファイルの名前は異なる場合があります。数や画像のサイズに応じて分析時間に数分をかかることがあり、自動的に実行されます。</li>
	<li>品質管理チェックを実行します。<ol>
<li>指定された出力ディレクトリのオーバーレイ サブディレクトリ内にある品質管理ファイルを調べます。スプリアス、不在、および不十分なキャプチャされた粒子、すべて背景が合わない場合、影付きのアウトラインとして明らかに画像に注意してください。このような例については図 3を参照してください。粒子データは実験に固有解析図生成の準備が整いました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>注意ファイルおよび/または粒子を無視 Id 解析コードで指定することによって全体の板または個々 の粒子を拒否します。例/関連する R と Python コードのリポジトリの修正を参照してください。</li>
	<li>各イメージは、指定された出力ディレクトリの結果サブディレクトリに整頓された12コンマ区切り形式のテキスト ファイルに格納されているために、画像解析結果を用いた実験の特定の数値を生成します。結果ファイルを読み取る方法の例の例/数字/R と例/数字/Python サブディレクトリを参照してください。</li>
</ol>

<ol><li>Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+granulation%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Aerobic granulation: Advances and challenges.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).</li>
<li>Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+granular+sludge%3A+Recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Aerobic granular sludge: Recent advances.</a> Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).</li>
<li>Williams, J. C. Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162</a> (2004).</li>
<li>Moghadam, B. K. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761</a> (2012).</li>
<li>Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+observation+of+aerobic+granulation+in+sequential+aerobic+sludge+blanket+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor.</a> Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).</li>
<li>Kelly, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphical+Comparison+of+Image+Analysis+and+Laser+Diffraction+Particle+Size+Analysis+Data+Obtained+From+the+Measurements+of+Nonspherical+Particle+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+Pharm+SciTech%22%5BJournal%5D)">Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems.</a> AAPS Pharm SciTech. 7 (3), Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.aapspharmscitech.org">http://www.aapspharmscitech.org</a> E1-E14 (2006).</li>
<li>Walisko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Taming+of+the+Shrew+-Controlling+the+Morphology+of+Filamentous+Eukaryotic+and+Prokaryotic+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).</li>
<li>Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Openstage%3A+A+Low-Cost+Motorized+Microscope+Stage+with+Sub-Micron+Positioning+Accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy.</a> PLoS ONE. 9 (2), e88977(2014).</li>
<li>Dias, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+identification+and+quantification+of+filamentous+bacteria+in+in+situ+acquired+images%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedical+Engineering+OnLine%22%5BJournal%5D)">Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images.</a> BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64(2016).</li>
<li>Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+Species-Specific+Filament+Levels+to+Filamentous+Bulking+in+Activated+Sludge%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).</li>
<li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+twisted+pixels%3A+ethical+guidelines+for+the+appropriate+use+and+manipulation+of+scientific+digital+images%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Engineering+Ethics%22%5BJournal%5D)">Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images.</a> Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tidy+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Statistical+Software%22%5BJournal%5D)">Tidy Data.</a> Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).</li>
<li>R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> (2017).</li>
<li>van Rossum, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Rossum%2C+G+%22Python+tutorial%22">Python tutorial</a>. , Amsterdam. CS-R9526 (1995).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIJI%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FIJI: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Weaver, J. E. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis">https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</a> (2018).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide%3A+IJ+1.42+r%22">ImageJ User Guide: IJ 1.42 r</a>. , National Institute of Health. (2012).</li>
<li>Sezgin, M., Sankur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+over+image+thresholding+techniques+and+quantitative+performance+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electronic+Imaging%22%5BJournal%5D)">Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation.</a> Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).</li>
<li>Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+pixel+resolution+for+shape+analysis%3A+Proposal+of+a+new+data+validation+method+for+computerized+images%5BTitle%5D)+AND+%22Powder+Technology%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images.</a> Powder Technology. 245, 297-313 (2013).</li>
<li>McKinney, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+Structures+for+Statistical+Computing+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+9th+Python+in+Science+Conference%22%5BJournal%5D)">Data Structures for Statistical Computing in Python.</a> Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).</li>
<li>Waskom, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaskom%2C+M+%22seaborn%3A+v0.5.0+%28November+2014%29%22">seaborn: v0.5.0 (November 2014)</a>. , (2014).</li>
<li>Wickham, H. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html">https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html</a> (2016).</li>
<li>Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. Available from:
 <a target="_blank" href="http://ggplot2.org">http://ggplot2.org</a> (2009).</li>
<li>Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Photography%3A+A+Primer+for+Pathologists%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Laboratory+Analysis%22%5BJournal%5D)">Digital Photography: A Primer for Pathologists.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).</li>
<li>Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pipeline+for+illumination+correction+of+images+for+high-throughput+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy.</a> Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).</li>
<li>Eastwood, B. S., Childs, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Alignment+for+Multiple+Camera+High+Dynamic+Range+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+IEEE+Workshop+on+Applications+of+Computer+Vision%22%5BJournal%5D)">Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy.</a> Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).</li>
<li>Bell, A. A., Brauers, J., Kaftan, J. N., Meyer-Ebrecht, D., Aach, T. High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology). 3 (1), Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/">https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/</a> 170-184 (2009).</li>
<li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supervised+Learning+of+Image+Restoration+with+Convolutional+Networks%5BTitle%5D)+AND+%222007+IEEE+11th+International+Conference+on+Computer+Vision%22%5BJournal%5D)">Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks.</a> 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).</li>
</ol>

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画像解析システムはかなり堅牢な QC の手続きして、悪いイメージを削除、サンプリング、プレートの準備、および画像の取得の固有の問題に適切な注意ができる両方のデータの精度との割合品質管理を通過した画像。
サンプル濃度 代表的なサンプルを撮影されていると仮定すると、最も重要なステップは、十分な粒子が粒子が重なってないので集中し、代表9と解析の効率化のために存在していることを確認することです。
これは合計の懸濁物質が広い範囲にわたって約 0.5 ~ 2 mL の混合液に対応したが、実験固有の決意が必要かもしれません。過度に集中の例は過度に - 希釈、適切な粒子濃度が参考として図 5に示すように。染色は粒子濃度によっても影響を受けます。下希釈可能性があります最適な閾値の十分なコントラストを持つ粒子を作り出さない間、過剰希釈が過度にステンド グラス、ぼやけて粒子で起因できます。
<p...

このメソッドの目的は、バイオリアクター、活性汚泥フロックと好気性顆粒1を含む特にそれらの粒子のサイズと形状の分布を決定する明確で反復利用と部分的に自動化された方法を提供するには,2この方法の後ろの理論的根拠は、手頃な価格、シンプルさ、スループットを高めると、既存社内プロトコルの3、4、再現性、他の粒子計測を容易にし共有を容易にすると。データの比較。
粒子測定分析 - の 2 つの広範なカテゴリ、光散乱5としてそのような資質を使用して直接撮像および推論の方法があります。推論方法を自動化し、スループットが大きく、装置は高価です。さらに、推論方法は粒子6の同等のサイズを正確に判断できます中、に、彼らは、形状詳細情報7を行いません。
図形データのための必要性、我々 は直接画像に本手法を基づいています。いくつかの高速イメージング メソッドが存在する場合、高価な商用ハードウェアまたはカスタム ビルド ソリューション8,9が伝統的に彼ら必要。一般的な手頃な価格のハードウェアと、スループットの低下に苦しんでいるが多くの分析10に必要な最小値よりもはるかに多くの粒子画像を生成するソフトウェアを採用する私たちの法を開発しました。
既存のプロトコルでは、重要なサンプリングおよび画像取得手順を指定できません。他のプロトコルは、(アドホック閾値11) などの主観的なバイアスを導入する手動の手順を指定できます。自由に利用できる解析ソフトウェアと組み合わせてサンプリング、固定化、イメージの取得手順を指定する明確に定義されたメソッドには、ラボ内で画像解析と実験室間の比較を強化します。このプロトコルの主要な目的は、ワークフローと同じサンプルの別の研究室から再現可能な結果につながる必要がありますツールを提供することです。
画像解析処理を正規化し、離れて使用に適した明確に定義された、適切にフォーマットされたファイル12にこのパイプラインで生成されるデータを記録人気データ分析パッケージ13,で14実験を緩和(カスタム図生成) などの特定の分析と実験室間の共有促進のデータ。
このプロトコルは、粒子形状データを必要とする、推論のメソッドへのアクセスを持っていない、独自の画像解析パイプラインを開発し、他のユーザーとデータを簡単に共有したいしたくない人のため特に勧め

<table><tbody><tr><td>10% 漂白剤溶液</td><td>クロロックス</td><td>31009</td><td>ワークスペースの消毒用。</td></tr><tr><td>キャップ付き15mL遠心分離チューブ</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>サンプルあたり。</td></tr><tr><td>50 mL 三角フラスコ</td><td>Corning</td><td>4980-50</td><td>他の容器は、> 40 mLのサンプルを含み、</td></tr><tr><td>500 mL Kimax Bottle</td><td>Kimble-Chase</td><td>14395-50</td><td>または、寒天処理に十分な</td></tr>量 <tr><td>寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Solid、7.5% ゲルを調製する</td></tr>のに十分です。<tr><td>データ分析ソフトウェア</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>RまたはPythonをお勧めします</td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>汚れや寒天を準備するのに十分です。利用できない場合は、タップしても問題ありません。</td></tr><tr><td>デスクトップコンピュータ</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>画像分析はCPUを集中的に使用するものではなく、2017年頃の「普通の」デスクトップコンピュータであれば十分です。</td></tr><tr><td>外付けハードドライブ</td><td>Seagate</td><td>STEB5000100</td><td>完全には必要ではありませんが、画像の数とサイズを考えると非常に便利です。2 TB 以上のストレージを推奨します。</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>NIH</td><td>バージョン1.51d</td><td>バージョンはImageJコアです。プラグインは執筆時点で更新されています。利用可能場所:https://imagej.net/Fiji/Downloads</td></tr><tr><td>GIT</td><td>オープンソース</td><td>バージョン2.19.1以降</td><td>利用可能:https://git-scm.com/</td></tr> <tr><td>画像キャプチャソフトウェア</td><td>ToupView</td><td>バージョン3.7.5177</td>カメラ<td>と互換性のあるものなら、カメラが付属している場合があります。TIFF画像を空間キャリブレーションデータとともに保存できるようにする必要があります。</td></tr><tr><td>メカニカル(X/Y)ステージ</td><td>OMAX</td><td>A512</td><td>完全には必要ありませんが、画像取得に大いに役立ちます。</td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>フィ</td><td>ッシャーM291-100</td><td>固体、1%w / v溶液を調製します。 サンプルあたり5 uL溶液。</td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>OMAX</td><td>A35140U</td><td>顕微鏡に対応したデジタルカメラなら何でも。10倍の倍率でピクセルあたり少なくとも5umを提供し、カラーチャネルごとにピクセルあたり少なくとも8ビットのダイナミックレンジを提供する解像度が推奨されます。</td></tr><tr><td>光学ステージマイクロ</td><td>メーターOMAX</td><td>A36CALM1</td><td>または、空間キャリブレーションには十分です。</td></tr><tr><td>ペトリ皿、100 mm</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875712</td><td>サンプルあたり1個。</td></tr><tr><td>PPE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>標準的な白衣、手袋、眼鏡。</td></tr><tr><td>Sparmoriaマクロ</td><td>NCSU</td><td>バージョン0.2.1github</td><td>リポジトリで入手可能:https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</td></tr><tr><td>ステレオ/解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ-2T</td><td>は、10〜20倍の倍率を提供し、内蔵カメラまたはCCDの取り付けポイントのいずれかでデジタル写真を許可する必要があります。</td></tr></tbody></table>

オープン ソース ソフトウェア パイプラインによる寒天培地に固定化活性汚泥粒子径・形状を測定

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

それらの治療の排水などの実験的バイオリアクターには、粒子サイズと形状は、重要なパラメーターにはが含まれています。たとえば、サイズおよび活性汚泥フロックの形、マイクロ スケールでの条件が指定でき、浄水汚泥のどれだけ定着にも直接影響します。
粒子のサイズと形状は、両方の 'シンプルな' 誤解の測定値です。多くの微妙な問題、頻繁に非公式なプロトコルと放置は、サンプリング、イメージング、および粒子を分析するときに発生します。サンプリング メソッドは、バイアスされることがあります。 または統計的十分な電力が供給されません。サンプルそのものでは不十分な維持可能性があります。 または固定中に変更を受けます。十分な品質のイメージができない場合があります。重なり合った粒子像、被写し界深度、倍率、様々 な騒音がすべて悪い結果を生みます。不十分な指定された分析は、手動閾値処理と領域分割によって生成されるよう、バイアスを導入できます。
手頃な価格とスループットが再現性と望ましいです。手頃な価格、高スループット方法がより頻繁に粒子計測、粒子の数千人を含む多くの画像を生成できます。安価な試薬、共通の解剖顕微鏡および自由に利用できるオープン ソースの解析ソフトウェアを使用するメソッドでは、反復可能なアクセス可能な再現できる、部分的に自動化の実験結果をことができます。さらに、このようなメソッドの製品は整形済み、ラボ内で解析と実験室間のデータ共有の両方を緩和、データ分析ソフトウェアで容易に理解できる、明確に定義をすることができます。
このような製品を生産するために必要な手順を詳しく説明するプロトコルを提案するなど: サンプリング, 試料調製及び寒天、デジタル画像集録、デジタル画像解析および実験固有図生成の例で固定、分析結果。我々 はまた、このプロトコルをサポートするオープン ソースのデータ解析パイプラインを含まれています。

生成されたファイル 図 1に示すプロセス分析画像ごとの 2 つのファイルが生成されます。最初のファイルはコンマ区切り値 (CSV) テキスト ファイル個々 の粒子に対応するそれぞれの行、列エリア、真円度、堅牢性など様々 な粒子のメトリックを記述して ImageJ マニュアル17で定義されています。例/データ ディレクトリ、補足情報として CSV ファイル例にはが含まれます
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58963/58963fig1.jpg"> 図 1:グラフィカルなワークフローのプロトコルの 4 つの主要な手順を説明します。<a href="https://www.jove.co...

サイズと活性汚泥粒子の形状は、さまざまな方法を用いて測定される重要なパラメーターです。代表でないサンプリング、最適イメージ、および主観的な解析パラメーターの不確かさが生じる。これらのエラーを最小限に抑えるため、測定を容易にするオープン ソース ソフトウェア パイプラインを含むすべての手順を指定するプロトコルを提案します。

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

活性汚泥粒子の大きさと形状は、排水処理の効率に不可欠です。しかし、彼らの測定はしばしばアドホックです。このプロトコルは、測定のための反復可能な、明確に定義された、半自動マブル測定を提供する。このプロトコルの主な利点は、主観的かつ体系的なバイアスを低減しながら、幅広い形態に渡って大量の粒子を測定できることです。この技術は活性汚泥に焦点を当てていますが、技術的にはマイクロプラスチックのような同じ粒子形態を有するものは、この方法で測定することができます。初めてこのテクニックを試すときは、一度に1枚ずつプレートを作って、その1つのプレートを作る物理的な動きを練習してみてください。また、顕微鏡で時間を取ってください。サンプリングとプレートの準備には、視覚的に最もよく伝達される多くの小さなテクニックが必要なため、この記事のビデオ版は重要です。また、再現性を確保するためには、プレートの良い写真を見せて見ることが重要です。今日、このプロトコルを実証しているのは、私の研究室の博士候補生であるジョセフ・ウィーバーです。まず、反応器のよく混合された部分から代表的なサンプルを取得する。サンプルを軽く混ぜ、決定したサンプル量を15ミリリットルの遠心分離管にすぐに注ぎます。次に、各サンプルに1%メチレンブルーの5マイクロリットルを加えます。キャップをキャップし、少なくとも3回チューブをそっと反転してサンプルを混合します。サンプルを少なくとも5分間、室温で30分以下に染色します。染色したら、6.5~9ミリリットルの間にチューブの総体積を持って来るために、十分な量の7.5%の寒天と脱イオン水を遠心管に移します。その後、遠心分離管を要約し、少なくとも3回はそっと反転してサンプルを寒天に混ぜます。キャップを自分から離したまま、キャップを開きます。各チューブのチューブの内容物を100ミリリットルのプラスチックシャーレに注ぎ、皿を優しく揺らし、完全で滑らかなコーティングと視覚的に均一な粒子の分布を達成します。寒天が固まるまで、プレートを室温で少なくとも5分間冷却します。10~20倍の倍率が可能なステレオ顕微鏡の顕微鏡ステージ上に、覆い隠されたプレートの表面を上に置きます。LED照明器スタンドやライトプレートなどの機器を使用して、拡散光でも下からサンプルを照らします。画像キャプチャソフトウェアを開き、顕微鏡の光路が写真に設定されていることを確認します。次に、カメラリストから適切なカメラを選択します。大きく、明確に定義されたエッジを持つ焦点面に複数の粒子が現れるように、顕微鏡を調整します。比較的深い焦点面を維持しながら、粒子を測定するために10〜20倍の倍率を使用してください。寒天プレートを一時的に取り外し、マイクロメーターをステージ上に置きます。マイクロメーターの卒業が画像キャプチャソフトウェアに鋭く焦点を当てて表示されるまで、細かい焦点を調整します。そして、ミクロン比にピクセルを較正する。次に、ビューをクリックして実際のサイズを選択して、ズームを 100% に設定します。次に、オプションを選択し、キャリブレーションに移動します。ここでは、マイクロメーターの長い軸に沿ってメインビューポートの赤いキャリブレーションバーを位置合わせします。垂直バーは、ゼロと200ミクロンの卒業を中心に。[キャリブレーション]ダイアログボックスで、現在の倍率と実際の長さ200ミクロンを入力します。すでにキャリブレーションされている場合は、メニューバーから倍率を選択し、現在の倍率レベルを選択してキャリブレーションを確定します。測定メニューで、行に移動して任意の行を選択します。マイクロメーターのゼロ卒業と長軸の交点をクリックします。その後、200ミクロンの線と長い軸の交差点をもう一度クリックします。正しいキャリブレーションは約200ミクロンで表示されます。オブジェクト選択ボタンをクリックし、行をクリックして Delete キーを押し、確認ボックスで yes を押して、行を削除します。次に、寒天プレートを交換し、ファインフォーカスを調整して、イメージングソフトウェアの細部を最大限に引き出します。これを実現するには、まずカメラサイドバーのビット深度パネルでラジオボタンを選択して、許容最大値のビット深度を大きくします。また、カメラサイドバーのカラーグレードパネルで適切なラジオボタンを選択して、グレースケール画像を取得するようにソフトウェアを設定します。今、露出とヒストグラムの間で開いているサイドバーパネルを折りたたみます。ゲインを 1 に減らし、クリアイメージがビューポートに表示されるまで露出を増やし、ヒストグラムがヒストグラム ボックスの両端でクリップされない分布として表示されるまで、露出を増やします。ヒストグラムを調整して、露出を超えないようにします。カメラサイドバーのヒストグラムパネルで、ヒストグラムの左境界を下の値のすぐ外側にスライドさせ、右側の境界を最も大きな値のすぐ外側にスライドさせます。イメージを非圧縮 TIF ファイルとして保存します。保存時にキャリブレーション情報ボックスをチェックして画像メタデータに倍率情報を含めます。プレートを下に移動する場合に左から右、右から左に交互に移動するパスに従って、前の画像と重ならない別の領域を選択します。分析のために、少なくとも 500 個の視覚的に推定されたパーティクルをキャプチャします。GIT リポジトリを複製して、パーティクル分析コードを取得します。コマンド ラインで、ここに示すコマンドを入力して、最新バージョンのコードを取得します。複製されたリポジトリの最上位ディレクトリにある read me テキスト ファイルの指示に従って、分析コードをインストールします。次に、処理するディレクトリをオプションのパラメータと共に一覧表示するテキスト ファイルを編集します。パラメーターと例のリストについては、例および分析サブディレクトリーを参照してください。ここで、ここで示すコマンドを入力して、コマンド ラインで分析を実行します。フィジーパスは、imageJ-win64 のディレクトリです。exe が見つかりました。そして、解析設定を記述するテキストファイルの場所をparamsfileします。実行可能ファイルの名前は、フィジーがインストールされているオペレーティング システムによって異なる場合があります。解析は自動的に実行され、画像のサイズと数に応じて数分から数時間かかります。次に、指定した出力ディレクトリのオーバーレイ サブディレクトリにある品質管理ファイルを調べます。スプリアスミストまたは不十分にキャプチャされたパーティクルを持つ画像に注意してください。それです。これで、データは実験固有の分析と図形の生成の準備が整いました。粒子の閾値法は完璧ではありませんが、許容可能な結果の例を次に示します。QC イメージを評価する際に、3 つの一般的なエラーが見つかりました。パーティクル境界に正確に適合しない、パーティクルを識別できなかった、アーティファクトが含まれる。ここでは、2つの実験反応器間の粒子分布が、研究者によって指摘された定性的なメタデータと表示され、組み合わされる。このグラフは、この場合、リアクタは一般的に同様の粒径分布を持ち、時間が進むにつれてより大きな平均とより広い広いスプレッドに向かう傾向があることを示しています。この手順を行う場合、均一に分散した粒子を含む寒天の薄層でプレートを均一にコーティングすることが重要です。練習し、時間をかけてください。この手順を超えて、興味深い粒子を寒天から切除し、研究することができました。データの観点から言えば、このプロトコルから得られるファイルは明確に定義されており、空は分析的に限界です。この技術は、有酸素顆粒状汚泥に新しい洞察を提供する道を開いた。それは形態が非常に重要であり、標準的な方法でそれを測定することができました。廃水は生物学的に活性です。バイオ安全レベル1のプラクティスが奨励されています。また、寒天はマイクロ波を介して泡立ち、遠心管を開けるとホット液滴を噴霧する方法。

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オープンソースソフトウェアパイプラインによる寒天培地に固定化活性汚泥粒子径・形状を測定

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