Name: 萌芽期ティッシュと胸腺の例を使用してウズラ鶏キメラ器官の形成の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学ぶウズラとニワトリの胚組織分離法。微小外科手術と酵素処理で純粋な組織を取得し、遺伝子発現解析や機能アッセイに活用できます。発生生物学研究に有用な手法です。

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著者は原稿の批判的読解のイザベル Alcobia に感謝していますビデオ ナレーションの Mário エンリケスとセルバンテス ・ デ ・ Histologia e Biologia の組織サービスからビトー プロアは Desenvolvimento、Faculdade ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・ リスボアテクニカル サポートのためのパラナ ・ デ ・ リスボア。Faculdade ・ デ ・ Unidade ・ デ ・ audiovisuais (視聴覚ユニット) からサンパウロ Caeiro とヒューゴ ・ シルバに特にお世話になっておりますメディチーナ ・ デ ・ リスボア、このビデオの生産への顕著なコミットメントのパラナ ・ デ ・ リスボア。我々 は親切提供するビデオ システムと Interaves を装備した堅実ライカマイクロシス テムズ株式会社を認める - Sociedade 農業 Pecuária、ウズラに貢献してくれて S.A 受精卵。この作品は、Faculdade ・ デ ・によって支えられたメディチーナ ・ デ ・ リスボア、パラナ de Lisboa (FMUL)。

これらすべての実験動物の世話やセントロ Académico ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・倫理的なガイドラインに従うリスボア。
1. 受精ウズラと鶏の卵孵化
<ol><li>場所は、3 日間 38 ° C の加湿インキュベーターでウズラ (について) の卵を受精しました。空気室の上向き卵 (卵の鈍い端) を孵化させなさい。 注: 加湿環境インキュベーターの下に水のコンテナーを配置することによって実現されます。</li>
	<li>38 ° C の加湿インキュベーターで 2.5 日間鶏 (ギャラス) の受精卵を孵化させなさい。水平位置で卵を孵化し、胚の場所を識別するために木炭の部分を使用して上側をマークします。 注: は、この実験を確立するとき、40 のウズラの卵と鶏の卵を 60 開始します。</li>
</ol>2 胚葉胸腺原基の将来のドメインの分離
注: は、無菌状態で水平層流フードと滅菌器具と卵操作手順のための材料を使用します。
<ol><li>3rdと 4thを含む咽頭アーチ領域として記述されている7,8(3/4PAR) のアーチ、胸腺原基の推定領域を含む萌芽期の領域を削除します。<ol>
<li>60 ml の冷たいリン酸緩衝食塩液 (PBS) の大規模なホウケイ酸ガラスのボウル (100 mm × 50 mm; 100 cm3) を入力します。</li>
		<li>曲線はさみの助けを借りて、タップ、3 日間の培養されて卵ウズラの殻に穴をあけます。卵の反対側に穴を鈍的に作り、冷 PBS にボウルに (胚) と卵黄を転送します。</li>
		<li>曲線はさみを使用して余分な胚の血管を外部から卵黄膜を切断することによって、卵黄から胚を削除します。</li>
		<li>細い鉗子の助けを借りて、小さなボウル (60 mm × 30 mm; 15 cm3) 転送胚は 10 mL の冷 PBS でいっぱい。</li>
		<li>スキマー、100 mm ブラック ベースでシャーレに胚を移動 (材料の表を参照してください) 10 mL の冷 PBS を含むと顕微鏡の下に置きます。</li>
		<li>前述8として 3/4PAR を切り裂きます。</li>
		<li>3/4PAR とガラス皿 4 分の 3 への転送は満ち冷 PBS 2 mL 滅菌パスツール ピペットを使用して吸引。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パンクレアチン酵素消化によって胸腺原基 (3/4 pp 内胚葉) の推定領域を含む内胚葉を分離します。<ol>
<li>ヘラと細い鉗子の助けを借りて、ガラス皿 4 分の 3 への転送 3/4PAR は冷たいパンクレアチン (8 mg/mL; 25 mg/mL 冷 PBS での 1:3 希釈) でいっぱい。</li>
		<li>酵素の消化力のための氷の上で 1 時間インキュベートします。 注: 酵素消化時間 (表 1) の開発の段階によって異なります。</li>
		<li>3/4PAR から内胚葉を分離する (40 x-60 x 倍率) 顕微鏡の下でガラスの皿を配置します。 注意: すべてのサーフェスおよびソリューション冷たいこのプロシージャの間に。組織を解剖する長い時間を取る場合、新しい冷たいパンクレアチン ソリューションに変更 (> 15 分)。照明源として限られた熱負荷を考慮した、顕微鏡や光ファイバーを組み込んだ LED ライトを使用します。</li>
		<li>周囲の組織から内胚葉を分離、剣山で 2 つのステンレス鋼の microscalpels を使用します。 注: 0 mm から 1 mm の顎の開口径を 0.1 mm と 0.2 mm ニッケル ピン ホルダーの直径 microscalpels を使用します。<ol>
<li>最初に神経管と咽頭内胚葉の背側表面に付着した中胚葉を削除します。</li>
			<li>背側を上には、慎重にデタッチし咽頭のアーチの間充を削除し、咽頭のポーチを公開します。3/4PAR の両側には、この手順を実行します。</li>
			<li>心臓の管と前部ポーチを取り巻く間充織を取り外します。</li>
			<li>腹側、2ndと 3rd咽頭アーチの外胚葉をカットし、袋に接続されている間充織を慎重に取り外します。3/4PAR の反対側にこの手順を繰り返します。この段階では甲状腺原基が見えるはずです。</li>
			<li>2 つの microscalpels と咽頭内胚葉に接続されている任意の残りの間葉系細胞を削除します。</li>
			<li>2ndと 3rd PP、解離の 3rdと甲状腺原基と 2nd内胚葉の前方の部分から 4thポーチを含む咽頭内胚葉の間横のカットをします。咽頭嚢。</li>
			<li>ヘラと細い鉗子の助けを借りて、ガラス皿 4 分の 3 へ移転分離 3/4 pp 内胚葉は 100% 冷牛胎児血清 (FBS) でいっぱい。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>In vitro アッセイの準備の間に氷の上の隔離されたティッシュのガラス皿を保ちます。または、隔離されたティッシュを立体的に保存でき、遺伝子発現をその場で分析します。</li>
</ol>3. 鶏 somatopleura 中胚葉の分離
メモ: 実行卵水平層流フードと滅菌器具と材料を使用して無菌状態で操作手順。
<ol><li>体節 19-24 (ss19-24) のレベルで somatopleura 中胚葉を含む萌芽期の領域を削除します。<ol>
<li>2.5 日間の培養後、インキュベーターから鶏の卵を削除します。</li>
		<li>曲線はさみでシェルで小さな穴を開けます。針を挿入し、卵の中のアルブミン量を下げ、(シェルのマークの領域の下にある) 胚の損傷を防ぐための 10 mL の注射器とアルブミンの 2 mL を吸引します。吸気のアルブミンを破棄します。</li>
		<li>円形のカット (最大 3 分の 2 の上面の面積) を曲線はさみを使用してシェルのマークされた領域に穴します。</li>
		<li>細い鉗子で胚を押しながら胚の血管を外部から卵黄膜をカットします。</li>
		<li>、顕微鏡下で 10 mL の冷 PBS を含むブラック ベースで 100 mm ペトリ皿に胚を配置します。 注: は、マイクロサージュリーの進歩的な倍率のためこの時点から顕微鏡を使用します。</li>
		<li>プレートの底に胎児を保持するために 4 つの薄い昆虫ピンを使用します。正方形の形状を形成する胚地域にピンを配置します。</li>
		<li>19 と胚軸に横 24 体節時空警察ヴェッカーシグナ目はさみを使用して、すべての胚領域と交差している間 2 つのカットを実行します。</li>
		<li>限界胚端を切断胚セクション, ss19-24 をリリースします。</li>
		<li>吸引 ss19 24 組織、ガラス皿 4 分の 3 に転送冷 PBS 2 mL 滅菌パスツール ピペットを使用して満ちています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パンクレアチン (8 mg/mL; 25 mg/mL 冷 PBS での 1:3 希釈) とタンパク質分解酵素で somatopleura 地域 (ss19-24) から横中胚葉を分離します。<ol>
<li>ヘラと細い鉗子、転送の助けを借りてガラス ss19 24 組織の冷たい pancreatin 液でいっぱい 4 分の 3 を皿します。</li>
		<li>酵素の消化力のための氷の上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>、実体顕微鏡下でホルダーに 2 つの microscalpels を使用して周囲の組織から中胚葉を分離します。 注意: すべてのサーフェスおよびソリューション冷たいこのプロシージャの間に。組織を解剖する長い時間を取る場合、新しい冷たいパンクレアチン ソリューションに変更 (> 10 分。)。照明源として限られた熱負荷を考慮した、顕微鏡や光ファイバーを組み込んだ LED ライトを使用します。</li>
		<li>中胚葉分離中に腹側に位置する splancnopleura 組織の慎重な剥離が続く界面外胚葉をまず削除します。</li>
		<li>神経管を平行移動でそれを切断することによって somatopleura の右側側中胚葉のリリースです。</li>
		<li>中胚葉分離胚の左側にあるを繰り返します。 注: この手順中に microscalpel の動きを遅くを作る。露出した細胞外マトリックス蛋白質組織と流れるような動きを防止する楽器に固執します。</li>
		<li>ヘラと細い鉗子の助けを借りてガラス皿 4 分の 3 へ移転分離中胚葉は冷たい FBS でいっぱい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>In vitro アッセイの準備の間に氷の上の隔離されたティッシュのガラス皿を保ちます。</li>
</ol>4。In vitro における切片の試金: 異種 3/4 pp 胚葉と中胚葉鶏 somatopleura 協会
<ol><li>10 %fbs と 1% ペン/連鎖球菌3,5培 RPMI 1640 培養培地を準備します。</li>
	<li>35 mm 5 ml の培地のシャーレに金属グリッドを配置します。 注: グリッドの上部で培地表面を水平にする液体の過剰を削除します。</li>
	<li>細い鉗子の助けを借りて、培地に膜フィルターを浸し、空気との接触の 1 つの表面を持つ grid の上にそれを置きます。 注: (13 の mm の直径) と膜面積の四分の一は組織協会に適しています。</li>
	<li>、実体顕微鏡下でメンブラン フィルター上に隔離されたティッシュを関連付けます。まず移植スプーン (またはヘラ) の助けを借りて穏やかなスライド ガラス皿から 3/4 pp 内胚葉 (手順 2) を転送し、薄い鉗子。分離中胚葉 (ステップ 3) のためには、この手順を繰り返します。 注: microscalpel の助けを借りて、その協会を最大化するために組織をミックスします。</li>
	<li>慎重に漿膜 (CAM) に 48 h. 培養組織を組み入れることができるため、5% CO2と 37 ° C で加湿のインキュベーターで関連組織を配置します。 注: カムにおける異所性の器官形成は、以前詳細8だった。</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li>
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<li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li>
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<li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

以下萌芽期ティッシュの隔離プロシージャは、異なる生物学的文脈3,5,6うずら鶏キメラ胚を作り出すための前の技術から改善されました。
この方法は、遺伝子操作や決定、遺伝子組み換え動物モデルの使用を制限することが多い、組織特異マーカーの使用を必要とせず純粋な萌芽期ティッシュの分離に適しています。それは、制限要因である純粋な組織を分離する能力を持つ、開発時に上皮間葉相互作用を研究する使用ことができます。例えば、開発が進むにつれて、組織はより厚くよりコンパクトになるし、彼らの分離が難しくなるように他の隣接組織に添付します。この分離手順適していません、したがって、すなわち後半器官の開発の後の段階です。
このメソッドは、3 D 保存萌芽期ティッシュの遺伝子発現を研究に固有です。隔離されたティッシュの 3 D 整合性を確保するには、機器、材料・ ソリューシ...

1970 年代初頭のエレガントなウズラ鶏キメラ システムは開発1,2の間に細胞の遊走や細胞間相互作用の役割を理解する新たな道を開くル Douarin によって開発されました。2 種間のセル交換が大幅胚形成、神経系の形成、造血など数多くの発達過程を研究するために使用するとき後で確認を妨げないことを前提に考案されたモデルシステム1。後者の例として取って、造血前駆細胞胸腺上皮原基を植民地化の周期波最初うずら鶏キメラ システム3を使用してを観察されました。そのため胸腺、第三および第四咽頭ポーチ (3/4 pp) の内胚葉の未探査地域機械的および酵素によってから分離されたウズラ (q) 胚体節段階 15-30 [日 (E) 1.5-E2.5].これらの段階は、チキン ハンバーグとハミルトン4 (HH) - 12-17 の段階に対応します。分離のプロシージャは、トリプシン酵素によって添付充から内胚葉を分離するに使用を開始しました。孤立した内胚葉は、E3 E3.5 (HH-ステージ 20 21) でホスト鶏 (c) 胚の somatopleura 領域に移植されました。この異種間充織は器官形成3にも貢献して胸腺上皮の開発に「寛容な」と考えられていた。その後、鶏ホスト血液媒介性前駆細胞の連続波はウズラ ドナー胸腺の上皮の相手はホスト胚3で胸腺形成に貢献することを浸透させた。
最近では、このアプローチの修正版は、胸腺形成5初期における上皮間葉相互作用を研究するために重要であることもわかった。この点で、キメラ胚3では異所性胸腺形成に関与する組織が分離、両方のドナーとホストの胚から・前のヴィヴォ関連付けられています。改良されたプロトコルは、ウズラ 3/4 pp 内胚葉 (E2.5 E3) および鶏 somatopleura 中胚葉 (E2.5 E3) を分離する使用されました。簡単に言えば、萌芽期ティッシュはマイクロサージャリーであり、体外パンクレアチン消化を分離した.また、組織型と発達段階 (表 1) によると、酵素の消化力、温度、培養時間の条件が最適化されました。
次に、隔離されたティッシュ関連していた、切片、48 時間培養システムで以前に報告された5,6として。体外組織協会は、生体内での操作のいくつかの制限を克服するための胚のローカルの細胞間相互作用を模倣します。このシステムは咽頭の装置の開発などの複雑な形態形成イベントで細胞間相互作用の研究に特に有用です。
胸腺の組織構築の各組織の貢献だけでなく、胸腺を生成する異種の協会の能力さらに探検使用カム方法論、以前詳細5,7,8をすることができます。簡潔に、培養組織は cE8 胚のカムに接ぎ木され 10 日間の卵の開発を許可しました。その後、胸腺形成は収穫の外植体における形態素解析によって評価しました。3古典的なウズラ鶏研究のようにウズラの胸腺上皮臓器開発9,10 に貢献する後で示されていたニワトリ胚由来造血前駆細胞 (HPCs) によって植民地だった.HPCs は胚から高度に血管カム5,7,8を通じて異所性キメラ胸腺に移行。ウズラ派生胸腺上皮特異的抗体 (すなわち、QCPN-MAb ウズラ核)、組織特異的分子マーカーの必要性を克服する免疫組織化学によって識別できます。
この実験前文書8で報告される 2 段階のアプローチとして、体外および ovo 開発において薬理学的エージェントの規則的な管理によって信号経路の変調をできます。また、植はもちろん実験8の任意の時点で収穫できます。
ここで詳細な分離のプロトコルは最後に、自然のプロパティの保存と萌芽期ティッシュの萌芽期の地域の場での遺伝子発現パターンをそれ以外の場合詳細設定に特に役立つの 3 D アーキテクチャによってアクセスできません。従来の方法。さらに、RNA シーケンスなどのマイクロ アレイ、トランスクリプトーム解析のアプローチは、組織固有の高スループット オミクス解析を提供しながら遺伝マーカーを必要とせず隔離されたティッシュの適用もできます。

<table><tbody><tr><td>鶏の受精卵(Gallus gallus)</td><td>ポルトガル、</td><td></td>ピントバール養<td>鶏場&nbsp;</td></tr><tr><td>ウズラの受精卵 (Coturnix coturnix)</td>ポルトガル<td></td><td>、インタラーブス</td><td>バードファーム&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP遠心分離管</td><td>コーニング</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP遠心分離管</td><td>コーニング</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm パイレックス皿</td><td>デュラングループ</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm パイレックス皿</td><td>デュラングループ</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>金属グリッド</td><td>グッドフェローズ</td><td></td><td>細かいメッシュ&nbsp; ステンレス鋼グリッド</td></tr><tr><td>メンブレンフィルター</td><td>ミリポア</td><td>DTTP01300</td><td>0.6 mm イソポア メンブレン フィルター</td></tr><tr><td>シャーレ 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>スーパーマーケットの60 x 30 mmパイレックスボウル(小型)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr>スーパーマーケットの<td>100 x 50 mmパイレックスボウル(大サイズ)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL プラスチックピペット</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>Normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr>スーパーマーケットの<td>透明プラスチックテープ</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>サイトケラチン(パン、酸性および塩基性、I型およびII型サイトケラチン)、クローンLu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen、Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Pancreatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3292</td><td>メーカーの指示に従って25 mg / mL溶液を調製します。分注前に遠心分離機とろ過を行い、-20°Cで保存します。数年。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&nbsp;</td><td>GIBCO、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B シリコーンエラストマー 1.1Kg キット</td><td>ELKEM/シルミド</td><td>RH141001KG</td><td>ペトリ皿のバックベースを準備するには</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>細い鉗子</td></tr><tr><td>極細ボンハサミ、湾曲</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14085-08</td><td>湾曲ハサミ</td></tr><tr><td>昆虫ピン&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26001-30</td><td>0.3 mm ステンレス製ピン</td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10087-12</td><td>移植スプーン</td></tr><tr><td>ミヌーティアンピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-20</td><td>0.2 mm ステンレス製マイクロメス</td></tr><tr><td>ミヌーティアンピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-10</td><td>0.1 mm ステンレス製マイクロメス</td></tr><tr><td>モリア ニッケルメッキピンホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26016-12</td><td>ニッケルメッキピンホルダー</td></tr><tr><td>モリア穴あきスプーン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10370-17</td><td>スキマー</td></tr><tr><td>ウェッカー アイ シザー</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>ライカ マイクロシステムズ&nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>ナノズーマー&nbsp;S360デジタル&nbsp;スライドスキャナー&nbsp;</td><td>浜松ホトニクス</td><td>C13220-01</td><td></td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>ライカマイクロシステムズ&nbsp;</td><td>ライカM80</td><td></td></tr></tbody></table>

萌芽期ティッシュと胸腺の例を使用してウズラ鶏キメラ器官の形成の分離

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

萌芽期ティッシュを分離する能力は、順番発表発生生物学における主要なプロセスへの明白な貢献を提供しているうずら鶏キメラ システムを確立するための重要なステップだった。
ここにはうずらとマイクロサージェリーとその生物学的特性を維持しながら酵素消化による鶏胚組織を分離するための最適化手法を説明しました。分離後、両種から組織は 48 h. ウズラの in vitro における切片アッセイ、関連付けられて、ニワトリ組織は明瞭な核機能と細胞間クロストークの検討できるように分子マーカーによって差別することができます。異種組織の協会。このアプローチは、したがって、前腸の形成と咽頭の形態形成時に発生するものなど、非常にダイナミックな空間変更と発達過程の複雑な組織の相互作用を研究するための便利なツール内胚葉由来の器官。この実験的アプローチは、胸腺形成の初期段階における上皮・間葉相互作用を最初に開発されました。これは、内胚葉由来の将来胸腺原基と中胚葉由来の間充織であったウズラと鶏の胚から分離。
鶏胚漿尿膜 (CAM) にそれらを移植で臓器を生成する関連組織の容量をさらにテストできます。カムは栄養素を提供し、explanted ティッシュにガス交換をできます。Ovo 開発の 10 日後は、キメラの臓器収穫植で従来の形態学的方法で分析できます。この手順も可能、初期開発 (体外) からの器官形成中に組織固有の貢献を勉強 (ovo 開発) における器官形成の最終段階です。
最後に、改善された分離メソッドも提供します立体的 (3 D) 保持萌芽期ティッシュのティッシュ特定の遺伝子発現パターンの高解像度地形解析も使用できます。

プロトコルは、いくつかの細胞および進化の生物学の技術的なアプローチで使用される鳥の萌芽期ティッシュを分離する方法を詳しく説明します。このメソッドは、胸腺形成5の初期段階の間に上皮間葉相互作用を研究する以前採用されました。ここで、図 1と図 2、同様のアプローチを使用して新しい結果が表示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58965/58965fig1.jpg"> 図 1.遺伝子発現の代表の結果の研究三次元保存を示す推定領域を含む咽頭内胚葉の胸腺原基...

この記事は、ex vivo キメラ器官を形成して結合することができますウズラと鶏の胚から純粋な萌芽期ティッシュを分離する方法を提供します。

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

この手順の全体的な目標は、ウズラおよび鶏の胚から胚組織を単離するための最適化された実験的アプローチを提示することです。この技術により、遺伝子発現研究や機能アッセイに用いることができる純粋な胚組織を得る。ウズラおよび鶏の胚からの組織はマイクロサージャストによって単離され、その生物学的特性を維持しながら体外酵素消化を受ける。分離後、3次元保存組織を使用して、高解像度の地形遺伝子発現パターン解析を行うことができます。このアプローチは、従来の方法ではアクセスできない胚領域におけるsitu遺伝子発現の詳細化に特に有用である。さらに、トランスクリプトーム解析アプローチは、遺伝子マーカーを必要とせずに単離された組織に適用され、組織固有の高スループットオミック分析を提供する。あるいは、両方の種からの単離された組織は、48時間のインビトロ・オルガヌティピックアッセイに関連付けることができる。ウズラと鶏の細胞は、別個の核特徴と分子マーカーによって識別することができるので、このアプローチは、組織の相互作用を研究することができます。培養組織が器官を形成する能力は、ovoアッセイで更に試験することができる。したがって、この方法は、非常に動的な容量修飾を伴う発達過程における複雑な組織相互作用を研究するのに有用なツールであり、また、臓器形成に対する特定の胚領域の可能性を明らかにするのに役立つ。一例として、本明細書では、単離胚組織からのウズラ-ニワトリキメラ胸腺の形成について説明する。第1に、第3および第4咽頭パウチの内因性は、前向きの胸腺初歩が、3日間の発達を伴うウズラ胚の咽頭領域から単離される。そして、この組織は、その発達を支えることができる間質と関連している、ソマトプレウラ中皮。最後に、組織の異物性関連は、キメラ胸腺を形成するために、インビトロおよびオボで培養される。水平ラミナルフローフードと滅菌された器具および材料を使用して、滅菌条件ですべての卵の操作手順を実行します。受精したウズラの卵は、空気室を上に向けてインキュベートした。まず、ウズラの卵を保育器から取り除きます。冷たいPBSで満たされた大きなホウケイ酸ガラスボウルを準備します。湾曲したはさみで、3日間のインキュベーションでウズラの卵の殻に円形の穴をタップしてカットします。卵の反対側の穴を鈍くし、冷たいPBSでボウルに黄身を移します。卵黄から胚を取り除き、ビテリン膜を胚外の血管に外から切断する。薄い鉗子の助けを借りて、冷たいPBSで満たされた小さなボウルに胚を移し、その後、スキマーで黒いベースを持つペトリ皿に胚を移動します。前のJove SPAライゲーションに記載されているように、第3および第4咽頭パウチを含む咽頭領域を除去する。次に、冷たい膵臓で満たされたガラスに第3および第4の咽頭アーチ領域を移し、氷上で酵素消化のために1時間インキュベートする。酵素消化のインキュベーション期間は、開発段階に依存する。ガラス皿をステレオ顕微鏡の下に置き、ホルダーに2つのマイクロメスを使用して、第3および第4咽頭アーチ領域から内臓を分離する。第1位の咽頭領域を裏側を上にして、内外面に内胚葉と外胚葉を内部に示す。神経管の外胚葉、内胚葉、間質、心臓管、および腹側部分を観察する。咽頭内膜の後面に付着した神経管と中胚葉を取り除く。咽頭の内胚葉、第4咽頭のパウチ、心臓管を観察する。背側を上にして、慎重に取り外し、咽頭のアーチの間の間葉を取り除き、咽頭のパウチを露出させる。咽頭領域の反対側で、この手順を実行する。内胚葉の最も後部に取り付けられた間葉を取り除き、第4咽頭袋を観察する。後部側を上にして、左右の4番目の咽頭パウチを観察します。内胚葉の最も後部および第2のポーチに取り付けられた間質を取り除くことによって続ける。心臓チューブと内部ポーチを囲む間分煙を取り除きます。腹側を上にして、咽頭の内臓と第2咽頭弓の右側を観察する。この段階では、甲状腺の初歩の内胚葉が目に見えるはずです。第2および第三咽頭アーチの外皮を取り外し、慎重にアーチの間質を取り除きます。右側の第2咽頭アーチの間葉の除去を観察する。4番目と3番目のパウチと甲状腺の初歩の位置に注意してください。咽頭袋に付着した間葉系細胞に残った細胞を除去する。右側の3番目と4番目のポーチと左側から4番目のポーチを観察します。左側の間葉剥離を繰り返します。左側の3番目のポーチを観察してください。左側の第2アーチの間葉剥離を観察します。この手順では、すべてのサーフェスとソリューションを冷たく保つ必要があります。組織を解剖するのに長い時間がかかる場合には、新しい冷たい膵臓溶液と皿に変更します。最後に、第2咽頭のパウチと第3咽頭パウチの間で横断的な切断を行い、2番目のパウチと甲状腺の初歩を取り除きます。この時点で、孤立した内胚葉は、咽頭の第3および第4咽頭のパウチおよび後端から構成される。2つのマイクロメスの助けを借りて、剥離された間分煙を取り除きます。分離された内胚葉を冷たい牛の血清で満たされたガラス皿に移し、インビトロアッセイの準備中に氷の上に保管します。卵を水平位置に置き、上側は炭を使用するためにマークしました。まず、インキュベーターから卵を取り出します。湾曲したはさみで、シェルに小さな穴を開け、針を挿入し、10ミリリットルの注射器で2ミリリットルのアルブミンを吸引する。シェルのマークされた領域に円形の穴を開け、薄い鉗子で胚を保持しながら、余分な胚性血管に外的にビテリン膜を切断します。ステレオ顕微鏡の下で、冷たいPBSを含む黒いベースのペトリ皿に胚を入れます。4本の昆虫ピンを使用して、胚をプレートの底まで保持します。正方形の形状を形成する胚外領域にピンを置きます。スマイト19と24の間で、胚軸に横切って、胚を横切る2つの切り傷を行う。このセクションをリリースするために、周辺の胚エッジを切断します。横板、神経管、およびスマイトを観察します。吸引し、冷たい膵臓で満たされたガラス皿に組織を移す。酵素消化のために氷の上で30分間インキュベートする。ステレオ顕微鏡の下で、ホルダーに2つのマイクロメスを使用して周囲の組織から中皮を分離します。ソマトプレウラ中皮、スプランチノプレラ、神経管、外皮を観察する。まず、表面の外皮を取り除きます。外皮から解離したソマトプレウラ中皮を観察する。その後、腹腔内に位置するスプランチノプレラを体性胸膜から慎重に取り外します。ソマトプレラの右横中皮を観察する。神経管に平行な動きでそれを切断することによってそれを解放する。この手順では、すべてのサーフェスとソリューションを冷たく保つ必要があります。組織を解剖するのに長い時間がかかる場合には、新しい冷たい膵臓溶液と皿に変更します。ソマトプレラ、スマイト、神経管、外皮の左横中皮を観察する。この側の中皮解放を繰り返します。マイクロメスでゆっくりと動きます。露出した細胞外マトリックスタンパク質は組織や器具を通して座り、流体の動きを防ぎます。慎重に神経管に平行運動で体細胞腫をカット.分離した中皮を冷たい牛の血清で満たされたガラス皿に移し、インビトロアッセイの準備中に氷の上に保管します。ペトリ皿に細かいメッシュの金属格子を入れ、培養液で満たします。過剰な液体を取り除き、中程度の表面を格子の上部に当てはめます。薄い鉗子の助けを借りて、培養培地に膜フィルターを浸し、慎重に彼女と接触する表面を持っている火格子の上に置きます。ステレオ顕微鏡の下で、スパチュラと薄い鉗子の助けを借りて穏やかに滑ることによって、ガラス皿から膜フィルターに孤立した内胚を移す。分離した中皮についてこの手順を繰り返します。マイクロメスの助けを借りて、組織を混ぜて、それが関連付けを最大化します。関連する組織を37度の加湿インキュベーターに慎重に入れ、5%CO2を48時間置きます。インキュベーション期間の後、培養組織をコリオラン型膜に移植し、先に述べたように臓器形成を完了するためにさらに10日間楕円形で発達することを可能にする。ここでは、鳥の胚組織の単離を明確な実験アプローチで使用することを可能にする網状法があります。一例として、咽頭パウチの形成に関与することが知られている遺伝子の発現は、胚の3日目における鶏の胚からの第2、第3、および第4咽頭パウチを含む単離された内胚をその現場での全てのマウントによって評価した。ソニックヘッジホッグの発現は中央咽頭の内胚葉で検出され、パウチから除外され、BMP7は第2咽頭および第3咽頭パウチの内胚葉で発現し、中央咽頭および第4咽頭ポーチから除外された。単離された組織はまた、48時間のインビトロで特異的に関連付けられたvitro、コリオラン型膜上への移植、およびさらに10日間の発達を許すことができる。外植は、従来の神学と免疫検査によって分析することができます。鶏のソマトプレウラ中胚葉との第3および第4咽頭のパウチからのウズラ内胚葉の関連のいくつかの代表的な結果は、以下のグラフトはQCPNおよび鶏リンパ球細胞に陽性のウズラ由来の胸腺由来の完全に形成されたキメラ胸腺を示した。さらに、サイトケラチン陽性胸腺上皮は正常な形態学的特徴を示し、典型的な網状体系を示した。このビデオを見た後、あなたは遺伝子発現研究で使用することができるウズラと鶏胚組織を分離する方法をよく理解している必要があり、キメラ臓器を形成することによって、臓器遺伝学の複雑さを解読するのにも役立ちます。

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