Name: 心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶ心臓細胞治療におけるiPS細胞由来細胞のDNA損傷評価プロトコル。コメットアッセイとγ-H2AX免疫染色法を用いて移植前の細胞品質を確認し、再生医療の成功率向上に貢献します。

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この作品は、国立心臓、肺、血液研究所助成金 RO1-HL-99507、によって部分で支えられた HL-114120 UO1 HL-134764 (j. 張) に、HL138023、HL 131017、アメリカ心臓協会の科学的な開発補助金 17SDG33670677 (R. Kannappan) します。

1. コメットアッセイ
<ol><li>
試薬の準備
	<ol>
<li>低融点アガロースの低融点アガロースの 500 mg を 100 mL の DNA - に/水の RNA 無料します。Agarose が溶けるまで電子レンジでボトルを加熱します。37 ° C の水浴必要になるまでにボトルを置きます。 注:さらに、DNA の巻き戻しの時間といくつかの電気泳動の要因23agarose 濃度の影響を検討した Azqueta et al., を参照してください。</li>
		<li>SYBR グリーン DNA 在庫の染料の解決の作業 × 1 を入手する 1: 10,000 の割合でトリス EDTA (TE) バッファーに色素を薄くしなさい。この染料は、光に敏感な暗い場所でそれを保存します。</li>
		<li>セル換散バッファー 100 mL の溶解バッファーを解散 (2.5 M の NaCl、0.1 M の EDTA、10 mM トリス、1% トリトン X-100) 脱イオン水 (ディ H2O)。10.0 に pH を調整する 10 M NaOH を追加します。4 ° C にバッファーをクールします。</li>
		<li>アルカリ DNA 巻き戻し/電気泳動の実行バッファーを解散・ ディ ・ H2o. クール 4 ° C にバッファーにおけるアルカリ溶液 (0.3 M NaOH、1 mM EDTA) 1 LPH を確認 > 13。</li>
		<li>プレコート彗星のスライド、スライド ガラスに 0.5% の agarose を数滴を配置します。Agarose のコーティングの薄層を形成する agarose がすぐに、別のスライドの平らな面を使用すると、広がった。 注:スライドを使用する前に乾燥させます。</li>
		<li>IPS 細胞培養のため簡単に材料表を基底膜マトリックス コート (を参照) の iPS 細胞文化 mTESR1 培地の平板の confluency に到達するまで。 注:ひと心臓線維芽細胞由来の iPS 細胞は、このプロトコルで使用されました。IPS 細胞誘導と培養条件のリプログラミングは私たち研究グループ12,13,21からの最近の記事で説明されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンプル準備
	<ol>
<li>培を破棄し、セルを洗浄します。剥離のソリューションを使用してセルを分離 (材料の表を参照してください)。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 細胞ペレットを洗浄し、1 x 10 の5セル/mL の PBS で細胞を再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンプルのスライドの準備 注:紫外光誘起細胞の損傷を避けるために低光の条件の下で次の手順を実行します。<ol>
<li>細胞懸濁液のアガロース溶液の 90 μ L ミックス 10 μ L (1:10 の比率) 管内。Agarose が凝固するを防ぐために 37 ° C の水浴にチューブを置きます。</li>
		<li>気泡を導入することがなくソリューションをミックスし、ピペットをプレコート彗星スライド 70 μ/スポット。ピペット チップを使用すると、拡散、薄膜層を形成する細胞 agarose 混合物。4 ° C、15 分にスライドを配置します。</li>
		<li>コンテナー内冷換散バッファーのスライドが完全に水没します。4 ° C 1 時間の暗闇に容器を置きます。</li>
		<li>換散バッファーを冷アルカリ溶液に置き換えます。スライドが完全に水中に沈むかどうかを確認します。30 分間、4 ° C で暗闇の中、コンテナーを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
電気泳動
	<ol>
<li>水平電気泳動槽にスライドを配置します。スライドが完全に水中に沈むまで冷たいアルカリ電気泳動バッファーでタンクを満たします。15 〜 30 分の 1 V/cm の電圧を適用します。 注:合計電圧 = x 1 V 電極間距離</li>
		<li>コンテナーで完全に水没、冷たい・ ディ ・ H2o. のスライド2 分後・ ディ ・ H2O を削除し、新鮮な・ ディ ・ H2O を繰り返しこの手順を追加します。</li>
		<li>冷たい 70% エタノール ・ ディ ・ H2O に置き換えます。ゆっくり 5 分を待つスライドを削除はない、それを傾けるし、それ風乾します。</li>
		<li>一度乾燥、各スポットに 100 μ L の DNA 色素の希釈を追加します。室温で 15 分を待機します。落射蛍光顕微鏡で FITC フィルターを使用して、サンプルごとに合計で 50 に 100 の彗星の画像を取る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
画像解析と結果の計算
	<ol>
<li>彗星をスコアリングのため、国立衛生研究 (所 NIH) を使用して、彗星アッセイ プラグインで ImageJ (ImageJ をここでダウンロード: プラグインをダウンロードして https://imagej.nih.gov/ij/download.html;: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/)。 注:プラグインは、解析を実行するすべての詳細を含む PDF 命令が付属します。また、彗星の分析のスクリーン ショットは、図 2 a ~ Cに表示されます。コントロールとドキソルビシン (Doxo) の代表的な彗星画像-扱われた iPS 細胞と彗星の定量化図 3A-Cに表示されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA 損傷応答
<ol><li>サンプルと試薬の調製
	<ol>
<li>CM iPS 細胞培養、文化 iPS CM材料表を基底膜マトリックス コート (を参照) の confluency に達するまで RPMI 培 B-27 (CMM) とで培養皿をセルします。 注:ヒト iPS 細胞由来心筋細胞は、このプロトコルで使用されました。心筋細胞 iPS 細胞分化のためのプロトコルは、私たち研究グループ12,13,21からの最近の記事で見つけることができます。</li>
		<li>商工会議所のスライドで iPS CMs をシードします。<ol>
<li>IPS CM 井戸から培養液を破棄します。3 回 PBS のセルを洗浄します。</li>
			<li>ウェルあたり 0.25% トリプシンの 1 mL を加えて 5 分チェック細胞の剥離を顕微鏡下でプレートの 37 ° C で孵化させなさい。トリプシンを停止する CMM の 1 mL を追加します。</li>
			<li>細胞懸濁液が、15 mL チューブと 4 ° C、200 x gで 5 分間遠心します。培地を除去 CMM の 1 つの mL を追加し、細胞を再懸濁します。セルをカウントし、CMM の 1.6 mL で 20 x 10 の5セルを取得するセルの数を調整します。</li>
			<li>種子も 8 も商工会議所のあたりの細胞懸濁液 200 μ L スライド (材料の表を参照してください)。井戸周りの細胞を拡散し 37 ° c. で孵化させなさい優しくスライドをタップします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>IPS CM ドキソルビシン治療のため iPS CM 井戸から培養液を破棄します。PBS のセルを洗浄します。1 μ M のドキソルビシンと細胞を治療して PBS のセルを洗浄して 4 h の CMM 培地を吸引します。</li>
		<li>ブロック バッファーの準備 3 %bsa および 0.05% を含むウシ血清アルブミン (BSA) 溶液 10 mL トリトン X-100。10 mL のブロック バッファーを準備するには、準備された BSA 溶液 9 mL に通常ロバ血清 1 mL を追加します。</li>
		<li>一次抗体溶液 1 μ L 抗家兎リン酸化ヒストン H2A を追加します。200 μ L のブロック バッファー (Ser139) 抗体 x。</li>
		<li>二次抗体ミックス ブロック バッファーの 200 μ L に 1 μ L 各蛍光色素標識された抗家兎の二次抗体、DAPI、蛍光色素標識されたファロイジンを追加します。</li>
	</ol></li>
	<li>反応
	<ol>
<li>3 回 PBS のセルを洗浄して、作りたての 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 200 μ L を各ウェルに追加します。部屋の温度で暗闇の中 20 分のセルを修正します。PBS のセルを洗浄します。</li>
		<li>PBS を削除し、室温で加湿チャンバー内でも、30 分のブロックごとにブロック バッファーの 200 μ L を追加します。ブロック バッファーを削除し、一次抗体溶液 200 μ L を追加します。常温で暗い、加湿チャンバー内で 45 分間インキュベートします。その後、PBS で 3 回洗浄します。</li>
		<li>PBS を削除し、二次抗体の組合せの 200 μ L を追加します。常温で暗い、加湿チャンバー内で 45 分間インキュベートします。その後、PBS で 3 回洗浄します。・ ディ ・ H2O antifade でそれらをマウントする前に洗います。Coverglass を置き、4 ° C で暗闇の中でスライドを保存</li>
		<li>落射蛍光顕微鏡を使用すると、図 4 aに示すように、1 サンプルあたりのランダム フィールドの 3 ~ 5 画像を撮影し、画像解析に進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>DDR 巣のカウント
	<ol>
<li>ダウンロードして CellProfiler24 (http://cellprofiler.org) をインストールします。</li>
		<li>
注:本研究における画像処理は、CellProfiler バージョン 2.1.1 を用いて行われた.他の所で使用された CellProfiler のためのチュートリアルを見つけることが (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & リスト = PL7CC87670239B4D10)。CellProfiler の新しいバージョンを使用している場合、パイプラインはマイナーな適応を必要があります。</li>
		<li>パイプラインのpunctae_gH2AX.cpipeをダウンロードします。ファイルを選択 >インポート>パイプラインファイルから、 punctae_gH2AX.cpipeを選択します。</li>
		<li>分析 (図 5 a) は、入力モジュール/画像セクションのファイル一覧ウィンドウに γH2A.X の巣の得られたイメージを含むフォルダーにドラッグ アンド ドロップします。次に、図 5 a Lで示すように、指示に従います。</li>
		<li>画像の次のパラメーターを設定します。<ol>
<li>ファイルの一覧に分析目的のイメージをドラッグします。入力モジュール、下の画像を選択 (図 5 aをモジュールの設定を参照)。入力モジュールのメタデータを選択します (図 5 bをモジュールの設定を参照)。入力モジュールでNamesAndTypesを選択 (モジュールの設定の図 5を参照)。</li>
			<li>グループは、なしを選択します。分析モジュールでColorToGrayを選択 (モジュールの設定の図 5を参照)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>分析モジュール、滑らかな選択 (図 5Eをモジュールの設定を参照)。 注:この値は、画像の解像度によって最適化する必要があります。</li>
		<li>分析モジュールでIdentifyPrimaryObjectsを選択 (図 5 階をモジュールの設定を参照)。 注:全体の核が選択されていることを確認するこれらの値を最適化します。この手順の後、コンピューターは遅れることがあります。</li>
		<li>分析モジュール、滑らかな選択 (モジュールの設定の図 5を参照)。 注:この値は、画像の解像度によって最適化する必要があります。</li>
		<li>分析モジュールでEnhanceOrSuppressFeaturesを選択 (図 5 Hをモジュールの設定を参照)。</li>
		<li>分析モジュールでIdentifyPrimaryObjectsを選択 (図 5Iをモジュールの設定を参照)。 注:Punctae が選択されていることを確認するこれらの値を最適化します。この手順の後、コンピューターは再度遅れることがあります。<ol>
<li>分析モジュールでRelateObjectsを選択 (図 5 jをモジュールの設定を参照)。分析モジュールでClassifyObjectsを選択 (図 5 Kをモジュールの設定を参照)。分析モジュールでExportToSpreadsheetを選択 (図 5 Lをモジュールの設定を参照)。</li>
			<li>画像解析を実行する左下のパネルに画像の分析をクリックします。分析が正常に完了にいくつかの画像が生成されます (図 6A-F)。 注:今後の参考のためにこれらの画像を保存してください。</li>
			<li>詳細な分析は生成され、コンピューター上の適切な場所に保存されている定量的データを含む .csv ファイルに注意してください。MyExpt_Imageと呼ばれるスプレッドシート、列 B および D はそれぞれ 5 およびより多くの punctae している核の数があります。核の合計数を取得するには、B と D の列を追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2.3.3 - 2.3.8 (すべての分析の前にMyExpt_のファイル名を変更) すべてのイメージのためのステップを繰り返します。プロットは図 4に示すように、DNA の完全性を評価するため可能です。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
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<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
<li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li>
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<li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleation+of+cardiomyocytes%3A+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

DNA の完全性は、細胞の完全性を描いています。損傷 DNA と細胞ストレスが多いし、最終的にその整合性を失います。幹と幹細胞由来の細胞が移植を目的として伝達されているの整合性は、その目的の機能を実行するセルのプリンシパルです。損傷 DNA と細胞移植生着不全率と細胞8,20のパフォーマンスになります。したがって、細胞移植前に DNA の検査、必要な品質制御プロトコルです。ここで 2 つの費用効果が大きいアプローチ、すなわち、彗星アッセイと γH2A.X 蛍光 DNA 損傷と幹と幹細胞由来細胞の質を評価するためにラベル付けについて述べる.
細胞の老化の主な原因は、細胞の DNA 損傷の蓄積と考えられています。コメット ・ アッセイを使用して、アリ ・ ベイカーらは22若いや老齢のひと皮膚繊維芽細胞における DNA 損傷を分析しました。以前は、我々 の DNA は、ダメージ フリー心臓移植を示されている前駆細胞の p53...

実験的ならびに臨床的細胞移植することができます心1,2,3,4,5 を失敗して左心室収縮性能を改善して適度に示します ,6,7,8,9。最近の進歩は、心血管の再生のための機会をさらに魅力的な開いています。体細胞に多能性を誘導し、異なる心臓系統、重要な心筋細胞 (CM)10、にこれらの誘導多能性幹細胞 (iPSC) を区別するためにリプログラミング因子の強制発現が含まれます11,12,13。 人工的に生成された Ips と iPSC 由来 CM (iPS CM)、などを含むすべてのセルの遺伝性材料の DNA です。DNA に格納されている遺伝命令は、成長、開発、および細胞、組織、器官、生物の機能を決定します。DNA ではない不活性です。細胞の代謝、活性酸素、カルボニル、窒素種などとアルキル化剤は原因 DNA の in vitro および in vivo で14,15,16,17を傷つけることができます。重要なは、重要な頻度のすべてのセルで直感的に DNA 損傷が発生します。これらの損傷が修正されていない場合それは DNA の突然変異、細胞の老化、DNA ・細胞の整合性、および多分、生命を脅かす癌を含む疾患の損失に します。したがって、DNA の整合性を維持する任意のセル、特にクリニックの巨大な潜在性を持つ Ips に不可欠です。
数量やゲノムの DNA の分離の整合性を評価する高価な機器は市場で利用できます。ただし、セルを孤立させることがなく細胞内 DNA の整合性を評価するためにシンプルでコスト効率の良い方法もありません。さらに、ユーザーによる DNA 分解 DNA の隔離は、これらのメソッドを使用して主な欠点の 1 つです。単細胞ゲル電気泳動 (コメット試験法として知られている)18,19と γH2A.X 反応8テクニックは、DNA 損傷を評価するための研究所の根本的なアプローチ。これらの 2 つの方法では、高価な機器や DNA 整合性8,20,21を分析するゲノム DNA の分離は必要ありません。全体のセル; これらの技術で実行されましたので、サンプル準備の間に DNA、RNA、タンパク質分解のユーザー誘導は、これらのプロトコルには影響を与えません。ここでは、DNA 損傷と幹と幹細胞由来細胞における DNA 損傷応答を査定する、彗星法と γH2A.X 反応の両方を実行するステップバイ ステップのプロトコルを提供します。また、これらの 2 つのアプローチを組み合わせて、移植細胞の適合性を評価するために使用できます素朴な評価を提案します。
コメットアッセイ、または単一セルの電気泳動のゲル、細胞での DNA 切断を測定します。低融点アガロースに埋め込まれた細胞は、スーパー コイル DNA を含むフォーム ユーグレナグラシリスに分離します。彼らの巨大なサイズとマトリックス蛋白質とその活用のため、そのまま DNA は制限された移行を持っているに対し電気泳動に断片化された DNA と壊れた dna の小さな断片はアガロースゲル細孔に移行します。蛍光顕微鏡下でステンド グラスの DNA のパターンは、彗星を模倣します。彗星の頭にそのままな DNA が含まれていると尾を断片で構成され、壊れた dna。DNA 損傷の割合は、そのまま DNA (彗星頭部) 強度を基準にして損傷した DNA (彗星の尾) の蛍光強度が測定できます。図 1に示すように、パラメーター テール モーメントを計算できます。
DNA 損傷は、ヒストン H2A のリン酸化を誘導します。DNA PK、ATR、ATM キナーゼ (γH2A.X) を Ser139 で X。リン酸化と H2A の募集。DNA 鎖切断に X は、DNA 損傷応答 (DDR) と呼び、DNA が破損している後急速に起こる。次のこのプロセス、細胞周期のチェックポイントを介した逮捕、DNA 修復プロセスが開始されます。DNA の修復が正常に完了した後、γH2A.X は脱燐酸化し、脱燐酸化酵素による不活化します。長時間、複数の DNA 鎖切断は、dna γH2A.X 巣の蓄積に 。これは、DNA 損傷と DNA の完全性の損失を修復する細胞のできないことを示します。DNA のこれらの γH2A.X の巣によって識別できます、セクション 2 のプロトコルを使用して DDR 巣の数を数えることができます。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン</td><td>コーニング</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>8 ウェルチャンバースライド</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>細胞剥離液</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson</td><td>Immuno Research Laboratories</td><td>711-165-152 (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,Gibco</td><td></td> <td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel growth factor reduced</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>PhalloidinA488</td><td>Life Technology</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>リン酸化ヒストン H2A.X (Ser139) Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp;グリーンI核酸ゲル染色剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 低融点</td><td>Agarose Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>退色防止</td></tr></tbody></table>剤

心臓の細胞治療幹細胞 dna の完全性を評価します。

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

幹と幹細胞由来細胞様々 な変性疾患の再生治療として大きな可能性があります。DNA は、幹細胞を含むすべてのセル内の遺伝データの倉庫との整合性はその再生能力の基本。幹細胞移植のための必要な数を達成するためにラボでの急速な伝播を受けます。加速された細胞の成長は活性酸素、カルボニル、アルキル化剤など、蓄積した代謝物による DNA の完全性の損失につながります。これらの細胞を移植生着不全と悪化の器官の再生になります。また、突然変異、dna、細胞老化細胞の DNA 損傷リードを移植とおそらく、生命を脅かすがんなどの病気。したがって、移植細胞の適合性を評価するための品質管理法のための即時の必要性があります。ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価手順のプロトコルを提供します。

ひと誘導多能性幹細胞の培養や DNA の完全性の測定として使用された DNA 損傷とテール モーメント コメットアッセイによって分析されました。iPS 細胞は、低融点アガロースに埋め込まれているされ、ガラス スライド上に配置。セルは、スーパー コイル DNA を取得する、アルカリ溶液に続いての換散バッファーと扱われた。ユーグレナグラシリス、electrophoresed し、彗星が DNA 色素 (図 1 a~ D) によって想像されたもの。彗星は、彗星アッセイ プラグイン (図 2 a・ C) を使用して、ImageJ で分析した。
ヒト iPS 細胞は、DNA 損傷を誘発して肯定的な制御として使用する Doxo と扱われました。<strong class="xfi...

ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価分析のため実験のセットアップの詳細な説明を提供します。

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

心筋症などの新生児疾患では、人工多能性幹細胞由来細胞を用いた再生療法は、大きな可能性を秘めています。しかし、インビトロでの細胞増殖の加速は、活性酸素種などの蓄積代謝産物によるDNA損傷をもたらす。これらのDNA損傷細胞を移植すると、臓器の生着と再生が悪くなります。移植前に、細胞の品質を評価する必要があります。ここでは、幹細胞のDNA損傷を評価するための2つのステップバイステッププロトコルを提供します。手順を実証するには、研究者のジェシカ・ミラー、研究者のニヒル・マルデカール、ラボ技術者のヴァサンティ・ラジャセカランが行われます。まず、500ミリグラムの低融解アガロースを100ミリリットルのDNA-RNAフリー水に入れます。アガロースが溶けるまで電子レンジでボトルを加熱します。その後、必要になるまでボトルを摂氏37度の水浴に入れます。あらかじめコーティングされた彗星スライドを準備するには、ガラススライドに0.5%アガロースの数滴を置きます。すぐにアガロースを広げ、カバースリップを使用してアガロースコーティングの薄い層を形成する。紫外線による細胞損傷を避けるために低光条件下で働き、10マイクロリットルの細胞懸濁液と90マイクロリットルのアガロース溶液をチューブに混ぜます。アガロースが固化するのを防ぐために、チューブを摂氏37度の水浴に入れます。気泡を導入せずに溶液を混合し、ピペット70マイクロリットルをスポット当たり、プレコーティングされた彗星スライドに入れる。ピペットチップを用いて、細胞アガロース混合物を広げて薄い層を形成する。スライドを摂氏4度に15分間置きます。容器内で、スライドを冷溶液バッファーに完全に沈めます。容器を暗闇の中に4度摂氏1時間置きます。溶解バッファーを冷アルカリ溶液に交換してください。スライドが完全に統合されていることを確認します。さらに30分間、4°Cで容器を暗闇の中に残した後、水平電気泳動タンクにスライドを置きます。スライドが完全に沈むまで冷アルカリ電気泳動バッファーでタンクを充填します。15~30分間、1ボルト/センチメートルで電圧を印加します。容器に、冷たい脱イオン水でスライドを完全に水に浸す。2分後、脱イオン水を取り出し、新鮮な脱イオン水を加え、このステップをもう一度繰り返します。次に、脱イオン水を冷70%エタノールに交換する。5分後、スライドを傾けずにそっと取り出し、空気を乾燥させます。乾燥したら、各スポットに100マイクロリットルの希釈DNA染料を加え、室温で15分待ちます。FITCフィルターを使用して、蛍光顕微鏡で、サンプルあたり合計50~100個の彗星の画像を撮影します。テキストプロトコルに記載されている培養iPS由来心筋細胞。iPS由来の心筋細胞をチャンバースライドで見るために、まず培養培地をウェルから捨て、PBSで細胞を3回洗浄する。ウェルあたり0.25%トリプシンの1ミリリットルを追加し、5分間摂氏37度でインキュベートします。細胞剥離のために顕微鏡の下でプレートを確認してください。その後、トリプシンを停止するためにCMMの1ミリリットルを追加します。セル懸濁液を15ミリリットルチューブに入れ、遠心分離機を摂氏4度と200倍のgで5分間置きます。培地を捨て、CMMを1ミリリットル加え、細胞を再中断します。セルを数え、CMMの1.6ミリリットルで200万個の細胞を得るために細胞数を調整します。今8ウェルチャンバースライドの井戸ごとに細胞懸濁液の200マイクロリットルをシード。スライドを軽くタップすると、ウェルの周りに細胞が広がります。37°Cで細胞をインキュベートします。iPS由来の心筋細胞ドキソルビシン処理では、iPS由来の心筋細胞のウェルから培養培地を捨て、PBSで細胞を洗浄します。1マイクロモルドキソルビシンで細胞を摂氏37度で4時間治療します。培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄する。免疫標識を行うために、PBSで細胞を3回洗浄し、各ウェルに200マイクロリットルの新しく調製した4%パラホルムアルデヒドを加えます。室温で暗い中で20分間細胞を固定します。PBSで細胞を洗浄した後、ウェルあたり200マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、室温で加湿したチャンバーに30分間ブロックします。ブロッキングバッファーを取り外し、200マイクロリットルの一次抗体溶液を添加します。室温で暗い加湿室で45分間インキュベートした後、PBSでウェルを3回洗浄します。PBSを取り除き、2次抗体ミックスの200マイクロリットルを追加します。室温で暗い加湿チャンバーで45分間インキュベートします。その後、PBSで井戸を3回洗います。アンチフェードでスライドを取り付ける前に、脱イオン水で洗います。カバーグラスを置き、スライドを暗闇の中で摂氏4度で保管します。共焦点顕微鏡を使用して、サンプルごとにランダムフィールドの画像を3~5枚撮影し、画像解析に進みます。次に、テキスト プロトコルに示されている手順に従います。画像のパラメータを設定するには、解析対象の画像をファイル リストにドラッグします。入力モジュールで、画像を選択します。また、入力モジュールでメタデータを選択し、名前と型を選択します。グループの場合は、[いいえ] を選択します。分析モジュールで作業し、色をグレーに選択します。次に、[スムーズ]を選択し、プライマリ オブジェクトを特定して、もう一度スムーズを選択します。次に、[フィーチャの拡張または抑制] を選択し、[プライマリ オブジェクトの識別] を選択します。解析モジュールで作業を続け、リレート オブジェクトを選択し、オブジェクトを分類して、最後にスプレッドシートにエクスポートを選択します。左下のパネルで[画像を解析]をクリックして、画像解析を実行します。解析が正常に完了すると、複数の画像が生成されます。CSV ファイルが生成され、コンピューター上の適切な場所に保存されます。このファイルには、さらなる分析のための定量的データが含まれています。私の実験画像と呼ばれるスプレッドシートでは、列Bは最大5つの切妻を持つ核の数を持ち、列Dは5以上の切り球を持つ核の数を持つことになります。列 B と D を追加して、核の総数を取得します。すべての画像に対してこれらの手順を繰り返し、すべての分析の前に私の実験ファイル名を変更します。ドキスト処理および非処理iPS細胞からの彗星の代表的な顕微鏡写真をここに示す。iPS細胞にはDNA損傷の基底量が見られ、DNA損傷と尾の瞬間のほんの一部として表された。しかし、このドキソ処理はiPS細胞のDNA損傷を期待通り増加させ、多能性幹細胞におけるDNA完全性を評価するために彗星アッセイを使用できることを示している。ガンマH2AX免疫標識の代表的な顕微鏡写真は、より低い倍率で、より高い倍率でここに示されている。対照iPS由来心筋細胞では、細胞の90%以上が1核当たり5未満のDDR病巣を有していた。そして、細胞の合計10%未満は、核あたり6以上のDDR病巣を有していた。6ヶ月間培養したiPS由来の心筋細胞の場合、細胞の90%未満は核あたり最大5つのDDR病巣を有し、合計13%以上の細胞が核1核当たり6つ以上のDDR病巣を有していた。一方、ドキソ処理されたiPS由来の心筋細胞では、80%未満の細胞が核あたり最大5つのDDR病巣を有していた。そして、細胞の合計約24%が核あたり6以上のDDR病巣を有していた。このデータは、長期にわたるiPS由来の心筋細胞培養およびドキソ治療が著しいDNA損傷を引き起こしたことを示しており、細胞移植には不向きである。これは電気泳動に影響を与える可能性があるため、細胞懸濁液を混合しながら変数を避けることは非常に重要です。この手順に従って、様々なタイプの細胞を用いて彗星アッセイおよび免疫標識手順を行うことができる。これらの技術は、細胞移植研究に使用される前に、様々な種類の細胞がDNA損傷を評価することを可能にする。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

心臓核密度沈降を介して分離し、フローサイトメトリーにより心筋細胞核を識別し、ソートするための中心体周辺物質1（PCM-1）に対する抗体で免疫標識されています。...

事後組織から心筋細胞核の分離

ここでは、LacIリトランスジェニックマウスモデルを用いて精製した造血細胞の数が少ないため、生体内突然変異誘発アッセイを説明します。 lacI遺伝子は、DNA突然変異の頻度、場所、タイプ、自然に生じまたは遺伝毒性物質への曝露後を決定するために単離することができる。...

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。...

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

心筋細胞の代謝回転の定量化は困難です。ここで説明するプロトコルは、新心筋細胞の核生成と核倍数性の正確で高感度な定量を可能にすることにより、この課題に重要な貢献をします。...

心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。...

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

この原稿は、レトロウイルスが媒介するGata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5の送達を使用して、多様な再プログラムされた心臓サブタイプの生成と定量化のための段階的なプロトコルを説明しています。...

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

ここでは、機能、契約、心筋細胞のような細胞を生成するために若いヒト間葉系幹細胞源の心臓微分の潜在性を効率的に活用する方法を提案するの in vitro...

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

この記事の全体的な目標は、分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞 (CSCs) の分化のためのプロトコルを標準化することです。ここでは、マウス CSCs を分離する密度勾配遠心法と心筋細胞への分化、増殖、文化 CSC...

分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞の分化

このプロトコルでは、ヒト誘導多能性幹細胞を心筋細胞の分化および精製に使用する方法をデモンストレーションし、さらに、Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤による移植効率を改善する方法について説明します。マウス心筋梗塞モデルにおける前処理。...

Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

本研究では、2次元ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)単層をフレキシブル基板上にめっきし、ビデオベースの顕微鏡と組み合わせて、非侵襲的心臓医療機器の収縮性評価方法を実証する。このツールは、心臓電気生理学デバイスの収縮特性の in vitro...

2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

ここでは、細胞核の調製を説明するプロトコルを提示します。心臓組織のマイクロ解剖および酵素的解離の後、前駆細胞を凍結し、続いて純粋な生細胞を単離し、単一核RNAシーケンシングおよびハイスループットシーケンシング分析によるトランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンの単一核アッセイに使用しました。...

シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)

学ぶ心臓細胞治療におけるiPS細胞由来細胞のDNA損傷評価プロトコル。コメットアッセイとγ-H2AX免疫染色法を用いて移植前の細胞品質を確認し、再生医療の成功率向上に貢献します。

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

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