Name: Post-larval 表現型解析およびホール マウント免疫組織化学のためメキシコ テトラアステュアナクス メキシコの調達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学ぶメキシコテトラAstyanax mexicanusの飼育と幼生飼育、および後期幼生のホールマウント免疫組織化学法。河川型と洞窟型の表現型比較により、発生生物学と神経科学の研究に有用な手法を確立する。

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この作品は、国立衛生研究所 [HD089934, DK108495] からの補助金によって支えられました。

このプロトコルで説明されている手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ハーバード衛生学校によって承認されています。
1. 繁殖
注: この手順でまた使用できる15,16,17,20を繁殖のためいくつかの公開メソッドがあります。10:14: 明暗サイクルの 23 ° c、ペレット飼料で繁殖、以前に成魚が保持されます (を参照してください材料表) 1 日 1 回。魚は、機械的なろ過と紫外線殺菌循環システムで飼育することができます。静的 (非循環) タンクで繁殖を行うこともできますが、魚ままにしてはならない静的タンクで 3 日以上、水質が急速に低下します。
<ol><li>魚用の水 5 ガロン タンクを埋める (塩素水に調整: pH = 2、伝導率 ± 7.1 ± 150 μ 秒、温度 900 = = 23 ° C)。</li>
	<li>プラスチックを置く (参照資料) をタンクの底にメッシュします。静的な水槽で飼育する場合は、タンクの側面に水ヒーターを貼付します。循環システムで飼育する場合に、システム排水給湯します。 注意: プラスチック製のメッシュの卵を消費するから大人を防ぐ。</li>
	<li>1 つの場所の女性と 2 つ男性A. メキシコタンクに 1 歳を超える魚します。30 分の適応する魚ができます。</li>
	<li>ヒーターの温度を 24 ° C (または開始温度より暖かい 1 ° C) に設定します。</li>
	<li>24 h 後 1 ° c の温度を増加します。</li>
	<li>24 h 後 1 ° c の温度を増加します。タンクの底に懐中電灯を照らすことによって毎日卵のタンクを確認してください。この 3 日間の期間中に食品から魚を差し控えます。</li>
	<li>3 日後に産卵を誘導されていないが場合、は、ヒーターを切り、魚を自分の元のタンクに移動する前に室温 (RT) に戻るには水を許可します。</li>
</ol>2. 孵化受精卵
<ol><li>卵は飼育槽で識別される、大人とプラスチック製のメッシュを削除し、ビーカーやコップを使用した 10 cm の深さまで水を減らします。 注: 産卵の時間を見積もるには、するには、シャーレにいくつかの卵を置き、ステージ14を決定し、受精の時間を推定する実体顕微鏡でそれらを表示する転送ピペットを使用します。</li>
	<li>便利な作業面にタンクを移動し、不透明な卵や糞便、タンクで半透明、肥沃な卵だけを残して削除します。 注: この時点で受精卵の数を記録できます。</li>
	<li>塗りつぶし魚準備ができたとタンク (手順 1.1 参照) を水し、水が一杯になる水槽にメチレン ブルーの 6-7 滴を追加します。 メモ: 最終的なメチレン ブルー濃度は約 1.5 ppm です。</li>
	<li>タンクにヒーターと水槽バブラー (レギュレータの空気ポンプに接続されている) を追加します。</li>
	<li>24 ° C にヒーターを設定し、泡の穏やかな流れを生成するエアストリーム レギュレータを調整します。</li>
	<li>水の温度を維持するためにタンクにカバーを配置します。 注: 卵は産卵時刻の 24 時間以内の孵化を開始する必要があります。</li>
</ol>3. 保育所のコンテナーに孵化した幼虫の転送
<ol><li>塩 20 g を追加 (参照資料) 魚用の 8 L 水 (手順 1.1 参照) と溶解するまで攪拌します。各保育所の 1.5 L コンテナーを埋める (参照資料) 準備された水の 1 l。</li>
	<li>転送ピペットを使用すると、コンテナーあたり 20 魚の密度で準備された保育所コンテナーに孵化した幼虫を移動します。 注: ヘッドランプことができますを検索し、孵化した幼虫を転送します。</li>
	<li>目に見えるすべての孵化幼虫が取り除かれた後、攪拌、および/またはエッジやピペットを使用してタンクのコーナーにウォーター ジェットを吹いているタンク内の水を揺り動かしなさい。 注: このパスを最初に失敗した幼虫を明らかにするのに役立ちます。</li>
	<li>未使用幼虫研究所福祉事務所 (OLAW) のガイドラインを使用してこの段階で処分します。6.15% の最終的な集中を達成するためにタンクに次亜塩素酸ナトリウムを加えます。シンクの下を注ぐ前に少なくとも 5 分を待ちます。</li>
	<li>ラベルの日付と受精の時間各保育所のコンテナー。毎日保育所コンテナーを表示し、任意の死んだ幼虫の削除を続行します。</li>
</ol>4. 魚のワムシ ベースの食品の準備
<ol><li>ワムシを取得については、材料表を参照してください。設定、保守、およびワムシ22を収穫する参照先のプロトコルに従ってください。</li>
	<li>魚を準備藻類混合の 3 mL を追加することによって食品 (材料の表を参照してください) 収穫されたワムシの 1 L にします。この混合物は、食品の供給として保育所コンテナーに直接追加されます。</li>
</ol>5. 後仔魚の餌
<ol><li>魚が 5 日後に受精 (dpf)、魚料理 (4.2 の手順で準備) の 3 mL を各保育所のコンテナーに追加します。最適密度でワムシはコンテナーの中心に、育苗容器のコーナーで密集したグループで表示されより少なく明白にする必要があります。適切な密度に達するまで追加ワムシの混合物を追加します。</li>
	<li>ワムシの存在のために毎日コンテナーを確認し、枯渇の濃度を取得する場合追加。任意の死んだ幼虫の削除を続行します。</li>
	<li>魚に達する 14 dpf と、5 魚/L の水の密度で循環システムと合うタンクに移動します。 注: この時点で後仔魚の生存数を記録できます。</li>
</ol>6 後仔魚のホール マウント免疫組織染色
<ol><li>ナイロンを通して魚を含んでいる保育所のコンテナーを注ぐことによって 24 時間食べ物から必要な段階の削除後稚魚メッシュのストレーナーと魚-準備ができてきれいな水を容器にこし器を配置すること (手順 1.1 参照)。 注: それは食品のすべてを削除することが欠かせません。腸内で食べ物を少量でも自動蛍光、画像に影響を与えます。</li>
	<li>収集し、魚を安楽死させます。 注: 安楽死プロトコル OLAW ガイドラインに従う必要があり、制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されます。我々 は、単独で tricaine に後稚魚が安楽死させるないと魚が魚が氷の上も保管されていない場合、tricaine から定着へ転送時の移動を開始を指摘しています。<ol>
<li>Tricaine-S の 0.4 g と炭酸水素ナトリウム 0.8 g を脱イオン水 1 リットルに追加してビーカーに tricaine ソリューションを準備し、氷の上に置きます。</li>
		<li>魚を収集するためにナイロン メッシュのストレーナを介して魚を含む水を注ぐ。優しく冷たい Tricaine ソリューションでストレーナーが水没、氷上で 10 分おきます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanized 魚を修正します。<ol>
<li>カットの先端の円錐管に魚を転送するのに転送ピペットを使用します。</li>
		<li>転送ピペットと Tricaine ソリューションを削除し、固定液に置き換えます。ロッキングで孵化させなさい。 注: 固定と固定時間は、使用抗体に基づいて決定する必要があります。4 ° C で一晩 10% ホルマリン溶液 (4% のホルムアルデヒド、資料を参照してください) は、材料の表に記載されている抗体に適しています。 注意: ホルマリンは有毒、可燃性です。個人用保護具 (手袋、白衣、スプラッシュ ゴーグル) を着用し、フードは化学処理します。ホルマリンを含む溶液有害廃棄物として廃棄してください。</li>
		<li>転送ピペットを使用して、魚を乱すことがなく、定着剤を慎重に取り外します。リン酸の 3 mL 緩衝生理食塩水-トリトン ソリューションを追加 [0.1 で PBS % トリトン (pbst;)、表示材料] ロッキング常温 15 分間インキュベートし、。</li>
		<li>Pbst; を削除し新鮮な PBST に置き換えて、孵化の 15 分 1 つの追加の時間を「洗濯」この手順を繰り返します。 注: 魚は数週間の 4 ° C では、0.02% アジ化ナトリウムを含む PBS に格納できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ホール マウント免疫染色を行います。<ol>
<li>ソリューション [PB-0.5% トリトン X、0.2% ウシ血清アルブミン (BSA)、1% ジメチルスルホキシド (DMSO)、アジ化ナトリウム 0.02%、5% ロバ血清] ブロックの 50 mL を準備します。 注意: アジ化ナトリウム、DMSO、有毒です。処理する際は、個人保護具 (手袋、白衣、スプラッシュ ゴーグル) してください。すべてのソリューションは、有害廃棄物として破棄されなければなりません。</li>
		<li>スクリュー トップ キャップと 4 mL バイアルに魚を転送するのに転送ピペットを使用します。転送ピペットを使用して、pbst; を削除し、ソリューションをブロック 3 mL を加えます。ロッキング RT で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>転送ピペットを使用して、ブロッキング ソリューションを削除し、ソリューションをブロックで希釈した一次抗体を追加します。撹拌で室温で一晩インキュベートします。 注: たとえば、追加 1: 250 反-フク/HuD 神経蛋白質モノクローナル抗体の希釈 ( A. メキシコで正常に使用されている抗体のリストの材料表を参照してください)。魚の追加なしの一次抗体のセットは、この手順に含まれているべきです。抗体の量は魚をカバーでき、撹拌のために十分なはずです。</li>
		<li>6.3.4 の手順の説明に従って PBST で 3 回魚を洗います。ソリューションをブロックで希釈した二次抗体と PBST を交換し、撹拌で RT 一晩インキュベートします。 注: 最適な一次および二次抗体濃度、培養時間、培養温度各抗体で決定する必要があります。RT で一晩は材料の表に記載されている抗体のために効果的であった。</li>
		<li>6.3.4 の手順で説明するように 15 分を持続させる各洗浄 PBST で 3 回魚を洗います。</li>
		<li>解離性大、進む前に短期的なストレージのため PBS に魚を転送マウント、または魚を断面します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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A. メキシコ表面と洞窟の遺伝子活動を比較する注意深く制御環境パラメーターと研究所にわたってレプリケートすることができますメソッドが必要です。A. メキシコを上げるため我々 のプロトコルは、後期幼生の開発中に一貫した栄養コンテンツを提供します。この餌の政権では、次の遺伝子の機能を提案する堅牢な免疫プロトコルを使用しての集団間自信を持って比較できます。ここでは、このメソッドの制限、将来アプリケーション.の意義を議論します。
密度一致の成長を達成するために後仔魚できますワムシのダイエットで 1.5 L 容器で 2 週間水を再循環することがなく発生することがわかった。このプロトコルは循環システムで魚を育てるのにも使えますただし、タンク流出によって失われたものを補うワムシを毎日追加する必要があります。孵化アルテミア給餌、養殖業、食料源として使われませんがワムシを使用してあるなど、かなりの利点であることがわかった: より良い水質 (下記参照)、一貫した栄養改善バイオ セキュリティ価格を削減します。
まず、消耗品の毎週のコストは、ワムシ、アルテミアの 14 ドルと比較しての 4 ドルです。野生からと微生物の自然変動の収集、アルテミア中制御された条件下で研究室でワムシが発生、バイオ セキュリティに関する病原体内容23か。また、アルテミアノープリウスの栄養成分も環境に決定され、したがって矛盾。給餌は孵化; 後エネルギー店舗繁栄します。彼らはすぐに彼らの開発し、いくつかの時間内の魚に最適な供給必要があります栄養値を失います。アルテミア孵化後、栄養濃縮することができる; 最初の時刻を表す 12 ハウスに給餌を開始します。ただし、この段階では彼らは消費する 5 つの dpf 魚に対して大きすぎるなっています。比較では、ワムシは継続的にワムシを収穫するときに関係なく高い栄養成分で、その結果海洋微細藻類を食べる。ワムシはArtmeia給餌 (160対400 ミクロン)、キャプチャし、ツバメ魚の容易なよりはるかに小さい。後期幼生表層魚群と血脈は、好みやワムシ10をキャプチャする機能に違いがないことを示すような数量でワムシを消費します。
最後に、アルテミアノープリウスは新鮮な水で導入された後数時間を死ぬを開始します。給餌の食べ残しが崩壊し、彼らは手動で削除されていない場合に水質を急激に減少します。死んだアルテミアを削除するは、時間がかかり、アルテミアよりもはるかに大きいではなく、可能性があります誤って削除または負傷後仔魚のために危ないです。ワムシは、育苗容器で無期限に住むし、水質を与えずに魚にすべての回で食品を提供できます。
一方、食料源ワムシ株、藻類を維持するために、かなりの利益があり、ワムシを使用する必要がありますに追加する文化システム毎日。これはワムシ培養容器に液体の藻類を必要としない自動送り装置で実現できます (材料の表を参照してください)。ワムシ必要がありますも収穫するこのセットアップから 24-48 時間ごと文化の健康を維持します。被嚢胚はいつでも孵化することができますので、非常にまれ (かつては、例のための年) の魚を飼育し、後期幼生段階で個体群間の比較を行うと心配しない研究者は食糧源としてアルテミアを好むかもしれません。
孵化し、生き残った幼虫孵化と成長の成功を監視するための数の追跡をお勧めします。胚や幼虫のほとんどが死んでしまうと、細菌や真菌の汚染のためあります。魚用の水の水質を監視し、70% エタノールですべての機器を消毒することをお勧めします。後に洗浄、殺菌、育苗容器を再使用できます。病気のリスクを最小限に抑えるために育苗容器から死んだ魚でもを取り外して、魚を食べ始める場合 5 dpf の前にワムシを追加が重要ですも。
A. メキシコ約 1 歳で性的に成熟します。これに比べて動脈分布(ゼブラフィッシュ) 10-12 週24で繁殖することができる遺伝子組換えA. メキシコを生成するための制限です。免疫組織染色 (IHC) は、遺伝子の発現と蛋白質のローカリゼーションを調査する代替方法です。ここで説明されているプロトコルは、各ステップで適応し、興味のあらゆるティッシュの抗原を検出するために使用できます。しかし、いくつかの組織比較研究の解釈に影響を及ぼす可能性があります (無着色血脈の存在しない障壁) の色素沈着による表層魚群で視覚化するより困難であることに注意することが重要です。この潜在的な問題に対処するため 3% 過酸化水素を使用して固定後表層魚群の色素を漂白することができます。
IHC には、成功したティッシュの固定、ブロック、および抗体の浸透が必要です。それぞれの方法は、組織や興味の蛋白質によって異なります。固定と固定時間は、抗原エピトープを維持しながら細胞を保存しなければなりません。このプロトコルは、架橋固定液 (パラホルムアルデヒド) を使用し、変性液 (メタノール、アセトンなど) を省略します。アセトンで潜伏減少神経細胞および膵マーカーの抗体の信号であることがわかった。結合組織中の非標的蛋白質に抗体を防ぐには、ブロッキングが欠かせません。このメソッドは、ブロックのソリューションで通常血清 (5%) と BSA (0.2%) の組み合わせを使用します。ブロック ソリューションでは、第一次および二次抗体の非特異的結合を減少、体内のタンパク質の反応サイトに結合する蛋白質および抗体も含まれています。
抗体の侵入を達成するために組織を permeabilized する必要があります。これは、洗剤または溶剤変性と達成することができますが、抗原エピトープを維持するために最適化する必要があります。我々 のプロトコルは、トリトン ジメチルスルホキシド (DMSO) の組み合わせを使用します。トリトン、DMSO 含まれて 0.5% と 1% の濃度でブロックと抗体培養段階でそれぞれ。この濃度を使用して、我々 は観察した脳、膵臓、腸、筋肉、染色すべてのティッシュの侵入の可能性が効果的であることを示唆しています。魚のサイズは浸透に影響を与える可能性があります。このプロトコルは、14 日以内 (長さ約 7 mm) より大きい魚にテストされていません。染色のトラブルシューティングを行うには、固定、妨害、および抗体の侵入手順を変更することをお勧めします。また、利用可能なゲノム25を使用して興味のA. メキシコ蛋白質で、免疫のシーケンスの保全を調べることが重要です。
A. メキシコは劇的に異なる環境で進化している同じ種の個体数を実験室で直接比較できるよう進化を調査する優秀なモデルです。標準飼育プロトコル、および研究所間では表面の魚や毒の生物的違いを理解することに不可欠です。私たちの記事は、開発と一貫性のある成長パラメーターにさらされた後稚魚の遺伝子活動を検証するメソッドを提供します。

メキシコのテトラアステュアナクス メキシコは川に住む個体群 (表面魚) として存在する魚の単一種と多数の洞窟住居人口 (血脈) 彼らが生息する洞窟の名前 (すなわちTinaja、モリノ、Pachón)。行動1,2,3,4, 代謝5,6 の遺伝的・発達的基盤を調査するA. メキシコを使用している成長している研究者数 ,7,8と形態学的進化9,10,11。A. メキシコの研究のための利用可能なリソースは、シーケンス化された注釈ゲノム12;トランスクリプトーム13;発達ステージング表14;15,16,17, 繁殖用作成遺伝子組み換え18、および遺伝子19を編集する方法。追加のツールと更新された標準プロトコルの普及は血脈研究コミュニティの成長を加速する (このメソッド コレクション20を参照)。
私たちの目標は、遺伝子活動の in situ研究所間で同等の方法で、後期幼生A. メキシコで評価するための堅牢なメソッドを提供するツールの既存のレパートリーに追加することです。この目標を達成するために 2 つの課題があります。まず、ふ化用の標準化された体制の必要性がある、研究所間に魚を引き上げ、給餌密度などのパラメーターの違いとして影響の成長と成熟、遺伝子活性に影響を与えます。第二に、後海産仔稚魚の遺伝子活動のパターンを調べるための標準化はまだ適応方法の必要性があります。後期幼生段階に魚を上げるとa. メキシコにおける遺伝子発現を評価するための堅牢なホール マウント免疫組織染色 (IHC) プロトコルを導入するための標準的なプラクティスを確立するここでは、これらの問題に取り組みます。
まず自然産卵を魚を繁殖し、受精卵を識別する方法を示します。次に説明は、受精卵 (幼虫) を孵化し、整備されている場所コンテナーあたり 20 魚の密度で 2 週間の循環や、水を変更することがなく保育園コンテナーに転送する方法です。5 日ポスト受精で魚 (卵黄供給することは、もはや) 後期幼生の段階に開発し、毎日補充を必要としない栄養豊富な食料源として藻類飼育シオミズツボワムシ複相単性(ワムシ) を提供されています。このメソッドは、幼虫と後幼虫の開発のための一貫性のある成長パラメーターを提供します。
遺伝子の機能を評価するために保育所コンテナーから魚を外し、全体マウント IHC を実行する方法を示します。提示 IHC 法は動脈分布21で使用するために開発されたプロトコルから適応され、 A. メキシコ組織をすべてテスト、脳、腸、膵臓などの抗原を調べることに効果的です。IHC は遺伝子発現と蛋白質のローカリゼーションの検査のためのトランスジェニック動物を生成する代わりに高速です。このプロトコルは、 A. メキシコを成長し、後期幼生の段階で表面の魚と血脈の表現型を比較することを目的とした研究の役に立つでしょう。

<table><tbody><tr><td>メチレンブルー</td><td>コルドン</td><td>B016CBHZUS</td><td>抗真菌</td></tr><tr><td>ヒーター</td><td>Finnex</td><td>4711457836017</td><td>100W デジタル コントロール ヒーター</td></tr><tr><td>エアストーン</td><td>リーズ アクアリウム &ペット製品</td><td>10838125202</td><td>使い捨て エアストーン</td></tr><tr><td>ソルト</td><td>インスタントオーシャン</td><td>51378014021</td><td>シーソル</td></tr><tr><td>ト 保育園コンテナ</td><td>IPC</td><td>21545-002</td><td>40 オンスまたは 1.5 L クリアコンテナ</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>VWR</td><td>414004-002</td><td>プラスチックバルブピペット</td></tr><tr><td>コンパクトカルチャーシステム (CCS) スターターキット Brachionus plicatilis (L型) ワムシ</td><td>リード マリカルチャー</td><td>na</td><td>魚の食品</td></tr><tr><td>RGcomplete</td><td>APBreed</td><td>817656016572</td><td>ワムシの食品の32オンスのボトル</td></tr><tr><td>プログラム可能な自動投与ポンプDP-4</td><td>Jebao</td><td>DP-4</td><td>ワムシのための自動フィーダー</td></tr><tr><td>トリケーン-S</td><td>ウエスタンケミカル</td><td>MS 222魚</td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td>トリカン溶液</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ用ストレーナー</td><td>HIC (Harold Import Co.)</td><td>735343476235</td>直径 <td>3 インチの</td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>緩衝液、蒸留水を使用して 1X に希釈</td></tr><tr><td>Triton-x 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>界面活性剤</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>抗菌剤</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>ブロッキング試薬</td></tr><tr><td>ガラスバイアル、スクリュートップキャップ付き 4mL</td><td>ウィートン</td><td>224742</td><td>染色バイアル</td></tr><tr><td>繁殖タンク用プラスチックメッシュスクリーン</td><td>ペンテア</td><td>N1670</td><td>繁殖タンクの底の寸法よりもすべての端が6mm大きい長方形にカットします。長方形の各角から6mmの正方形を切り取ります。画面の端を 4 つの端すべてに沿って曲げます。6mmのビニールコーティングされたディスクマグネットのペアを、メッシュの各コーナーの両側(上部と下部)に配置します。画面は、タンクの側面にできるだけぴったりと収まるようにする必要があります。スクリーンは金属製の魚網でタンクから取り外すことができます。</td></tr><tr><td>ビニールコーティングされたディスク磁石</td><td>Kjmagnets</td><td>D84PC-AST</td><td></td></tr><tr><td>New Life Spectrum Thera-A ペレット魚料理</td><td>New Life International</td><td>na</td><td>大人の魚料理。この製品の小売業者のリストは、会社のウェブサイトで入手できます</td></tr><tr><td>抗体</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モルモットからのインスリン抗体</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>羊からの1:200</td></tr><tr><td>グルカゴン抗体</td><td></td><td>Abcam ab36215</td><td>マウスからの1:200</td></tr><tr><td>アセチル化チューブリン抗体</td><td>シグマ</td><td>T6793</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HuD / HuC抗体マウス</td><td>Life Technologies</td><td>A-21271</td><td>1:500</td></tr><tr><td>一酸化窒素合成酵素(nNOS)抗体ウサギAbcam</td><td></td><td>ab106417</td><td>5&mu;g/mL</td></tr><tr><td>コリンアセチルトランスフェラーゼ (ChAT) ウサギ由来</td><td>Abcam</td><td>ab178850</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>セラトニン (5HT) ウサギ由来</td><td>Immunostar</td><td>20080</td><td>1:500</td></tr></tbody></table>

post-larval 表現型解析およびホール マウント免疫組織化学のためメキシコ テトラアステュアナクス メキシコの調達

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

川とアステュアナクス メキシコの洞窟に適応した個体群は、形態学、生理学、動作の違いを示しています。大人のフォームの比較に焦点を当てた研究は、これらの違いのいくつかの遺伝的な根拠を明らかにしました。以下は人口が (初回の摂餌) の後期幼生の段階で異なる方法について知られています。このような研究は彼らの自然環境における成人期までの血脈の生き残る方法への洞察力にあります。研究室で後幼虫の発育を比較するためのメソッドには、標準化された養殖と供給体制が必要です。ここで我々 は 2 週間ポスト受精までの非循環水に栄養豊富なワムシの食事に魚を上げる方法を説明します。この保育園のシステムから後仔魚を収集し、全取り付ける染色を実行する方法を示します。免疫染色は、開発とA. メキシコで遺伝子の機能を調べるための遺伝子発現解析に魅力的な代替手段です。保育メソッドは、大人への成長の確立密度一致集団の標準的なプロトコルとしても使用できます。

表 1は、繁殖面魚と静的な繁殖水槽で Tinaja、モリノ、および Pachón の血脈の 1 年間に成功を示します。表面および常に生成される受精卵と Pachón たか孵化幼虫、モリノと Tinaja 成功しなかったいくつかの時間の間 (2/6、2/18 のイベントを産卵孵化した幼虫は、それぞれ生成されませんでした)。親魚の年齢に起因する表示されていないクラッチ サイズのばらつきがあります。表 2は、孵化した幼虫が産卵イベントの一部と親魚の年齢に起因の合計数を示します。一般、表面の魚が産卵幼虫の最大数を生成することがわかりました (1,550 ± 894、n の平均 = 5) Pachón 続いて、(平均 879 ± 680、n = 6)、Tinaja (平均 570 ± 373、n = 11) とモリノ (386 ± 276、n の平均 = 3)。幼虫数は通常より大人に成長、1 つのテストが必要です。我々 は通常 6-18 保育所コンテナー (120-360 幼虫) を設定し、残りの魚を安楽死させます。
保育園プロトコルの成功を測定するには、孵化幼虫、産卵成功したイベントから存続後稚魚の数を記録しました。表 3は、循環タンクで繁殖の 1 ヶ月のデータを示しています, 14 dpf に生き残った保育園コンテナーに転送幼虫の数が含まれています。今月中に生存率は 41 81%、65 293 魚実験や大人への成長のための人口あたりの結果からであった。
ホール マウント免疫染色に成功した場合を決定する、一次抗体二次抗体のみを培養すると培養サンプルの蛍光性を比較しました。蛍光シグナルは、一次抗体の孵化魚に表示されますのみ。我々 は正常に両方の表面で 12.5 dpf までの段階でのニューロン10 (図 1) と膵細胞6にラベルを付けると、型の洞窟このプロトコルを使用しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58972/58972fig1.jpg"> 図 1: ニューロンのラベルします。ホール マウント免疫染色のA. メキシコ。12.5 dpf 表層魚群 (、) および Pachón の血脈 (b) のイメージ。[孵化した黄色の輪郭線に示す (a) と] に (b) の中間体領域の画像面魚 (c) と Pachón の血脈 (d) に染まったパン神経抗体 (Hu)。表面魚腸示す腸溶性ニューロン (Hu) と彼らの予測 (アセチル化チューブリン) の領域の (e) 共焦点画像。このイメージの腸管を切開し、核を染色 DAPI を含有する培地にマウントされています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58972/58972fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>人口</td>
			<td>試み</td>
			<td>イベントを産卵</td>
			<td>クラッチ</td>
		</tr>
<tr>
<td>表面</td>
			<td>94</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>モリノ</td>
			<td>110</td>
			<td>6</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>167</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>242</td>
			<td>18</td>
			<td>16</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 繁殖の 1 年間からのデータの概要A. メキシコ静的タンクにします。繁殖回数、産卵のイベント結果と生成イベントを産卵数孵化幼虫。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>人口</td>
			<td>親の年齢</td>
			<td>孵化した幼虫</td>
		</tr>
<tr>
<td>表面</td>
			<td>1 年間</td>
			<td>989</td>
		</tr>
<tr>
<td>表面</td>
			<td>1 年間</td>
			<td>1050</td>
		</tr>
<tr>
<td>表面</td>
			<td>3 年間</td>
			<td>2214</td>
		</tr>
<tr>
<td>表面</td>
			<td>3 年間</td>
			<td>432</td>
		</tr>
<tr>
<td>表面</td>
			<td>3 年間</td>
			<td>1768</td>
		</tr>
<tr>
<td>表面</td>
			<td>4 年間</td>
			<td>2852</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>1 年間</td>
			<td>1194</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>1 年間</td>
			<td>1933</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>1.5 年</td>
			<td>371</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>3 年間</td>
			<td>480</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4 年間</td>
			<td>1190</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4 年間</td>
			<td>110</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>9 ヶ月</td>
			<td>259</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>9 ヶ月</td>
			<td>253</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>10 ヶ月</td>
			<td>1100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>11 ヶ月</td>
			<td>857</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1 年間</td>
			<td>713</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1 年間</td>
			<td>853</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1 年間</td>
			<td>542</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1.5 年</td>
			<td>360</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1.5 年</td>
			<td>58</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1.5 年</td>
			<td>1100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>4 年間</td>
			<td>185</td>
		</tr>
<tr>
<td>モリノ</td>
			<td>2.5 年</td>
			<td>460</td>
		</tr>
<tr>
<td>モリノ</td>
			<td>2.5 年</td>
			<td>619</td>
		</tr>
<tr>
<td>モリノ</td>
			<td>3 年間</td>
			<td>81</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 近似女性年齢とふ化幼虫数の示された人口からの個々 の産卵イベントから A. メキシコ。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>人口</td>
			<td>試み</td>
			<td>イベントを産卵</td>
			<td>クラッチ</td>
			<td>クラッチ サイズ</td>
			<td>保育園カップに幼虫転送</td>
			<td>14dpf で後仔魚</td>
			<td>生存率 (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>表面</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>576 &amp; 1728</td>
			<td>360</td>
			<td>174</td>
			<td>48</td>
		</tr>
<tr>
<td>モリノ</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>228</td>
			<td>159</td>
			<td>65</td>
			<td>41</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1952</td>
			<td>175</td>
			<td>93</td>
			<td>53</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1696</td>
			<td>360</td>
			<td>293</td>
			<td>81</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3: システムを再循環と幼虫を調達でA. メキシコを繁殖の 1 ヶ月からのデータのサマリーです。試み、その結果を繁殖数は産卵イベント、孵化幼虫、幼虫保育所コンテナー、および稚魚後 14 日後保育園のコンテナー内に存在する転送クラッチあたりの幼虫の平均数を生成するクラッチします。

このプロトコル我々 はアステュアナクス メキシコ大人を繁殖、幼虫を上げる手順をデモンストレーションし、表面の表現型を比較し、型の洞窟後仔魚にホール マウント免疫組織染色を実行します。

Post-larval 表現型解析およびホール マウント免疫組織化学のためメキシコ テトラアステュアナクス メキシコの調達

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

ここでは、メキシコのテトラ・アスティアナックス・メキシカーヌスを飼育し、幼虫を育て、幼虫後の魚に全型免疫組織化学を行い、川と洞窟適応魚の表現型を比較する方法を示します。私たちは、ロチファーの栄養豊富な食事に同じ密度で魚を育てます。この技術は一貫した成長を保障し、費用、バイオセキュリティおよび水質の利点を提供する。まず、5 ガロンタンクの底にプラスチックメッシュを配置します。その後、魚の準備水でタンクを埋めます。タンクの側面に給湯器を貼ります。1歳以上の雌と2匹のオスのアスティアナックス・メキシカンス魚をタンクに加えます。給湯器の温度を摂氏24度に設定します。24時間後、温度を1度上げます。卵をチェックするために毎日タンクの底に懐中電灯を照らします。繁殖タンクで卵が特定されたら、成魚とプラスチックメッシュを取り除きます。ビーカーを使用して水深を10cmに減らします。受精時間を推定するには、トランスファーピペットを使用していくつかの卵をシャーレに入れ、ステレオ顕微鏡で見てステージを決定します。不透明な卵や便を取り除きます。その後、魚の準備水でタンクを満たし、水にメチレンブルーの7滴を追加します。この後、タンクにヒーターとアクアリウムバブラーを追加します。ヒーターを摂氏24度に設定し、気泡の穏やかな流れを作り出すために気流レギュレータを調整します。その後、水温を維持するためにタンクをカバーします。魚の準備水の8リットルに塩20グラムを加え、溶けるまでかき混ぜます。次に、各託児容器に1リットルの水を加えます。次に、移管ピペットを使用して、孵化した幼虫の20を各保育園の容器に移動させます。大きなタンクの水を攪拌して、すべての幼虫が取り除かれていることを確認します。魚の食べ物を準備するには、収穫されたロティファーの1リットルに藻類混合物の3 mlを追加します。受精後5日間で、各保育園の容器に3mlの魚の食べ物を加えます。ロティファーは、中央付近に表示されない限り、コンテナの隅に密集したグループで表示される必要があります。毎日のローティファーの容器をチェックし、濃度が枯渇した場合は、より多くの食品を追加します。死んだ幼虫を取り除く。まず、食品内容物の消化管をクリアし、ナイロンメッシュストレーナーを介して所望の年齢の魚と共に保育園の容器を注ぐ。きれいな魚の準備水で容器にストレーナーを置き、24時間食べ物を差し控えます。魚を安楽死させた後、制度的ガイドラインに従って、魚を円錐管に移すために移管を使用する。安楽死溶液を固定液に置き換えます。そして、摂氏4度で一晩揺れるチューブをインキュベートします。この後、固定剤を取り除き、PBSTに置き換えます。さらに15分間、ロッキングでチューブをインキュベートします。そして、もう一度洗浄プロセスを繰り返します。次に、転送ピペットを使用して、スクリュートップキャップ付きの4mlガラスバイアルに魚を移動させます。バイアルからPBSTを取り出し、3mlのブロッキング溶液を加えます。ロッキングで1時間室温でバイアルをインキュベートします。この後、ブロック溶液を除去するために移管ピペットを使用し、ブロッキング溶液中で希釈された一次抗体と交換してください。攪拌で室温で一晩バイアルをインキュベートします。次に、先に述べたように、PBSTで魚を3回洗う。PBSTをブロッキング溶液で希釈した二次抗体に置き換えます。そして、攪拌で室温で一晩バイアルをインキュベートします。最後に、PBSTで15分間魚を3回洗います。このプロトコルを使用して、表面魚ティナジャ、モリーノとパチョン洞窟魚は、静的繁殖タンクで飼育されました。表面とパチョンスポーンは、受精胚で、常に孵化した幼虫を産生した。モリーノとティナジャは失敗したが、時間の一部。一般に、表面魚は産卵あたり最も多くの幼虫を生産し、次いでパション、ティナジャ、モリーノが続いた。全型免疫染色技術は、受精後12.5日までの段階でニューロンおよび膵臓細胞に標識するのに成功した。幼虫を上げ、生き残った魚の数を記録する際に、死んだ魚を取り除く必要があります。多くの魚が死ぬ場合は、細菌や真菌の汚染が原因である可能性があります。タンクは、使用前に70%エタノールで滅菌する必要があります。我々が述べた免疫染色技術は、材料表に記載されている抗体に対して正常に使用されている。免疫染色後、魚は、目的の任意の組織を見るために全体を取り付けたり、切除することができます。組み合わせて、飼育、孵化および免疫染色手順は、実験室間で同等の方法で遺伝子活性NC2を評価するための堅牢な方法を提供する。

raising-mexican-tetra-astyanax-mexicanus-for-analysis-post-larval

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

遺伝子標的化突然変異誘発は、ゲノム編集の技術を使用して、生物の幅広いことが可能です。ここで、我々はアステュアナクスmexicanus、表面の魚や洞窟魚が含まれて魚の種におけるエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）などの転写活性化因子を用いて標的遺伝子の突然変異誘発のためのプロトコルを示しています。...

ゲノム編集中<em&gt;アステュアナクスmexicanus</em&gt;使用して転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。...

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

ここでは、他の組織に広く適用される、ゼブラフィッシュ脳の発達における微小管の異なる集団を分析するメソッドについて反応について説明します。最初のプロトコルでは、反応の安定性と動的微小管の最適化手法について説明します。第二議定書は、画像し、初期微小管を具体的に数値化する方法を提供します。...

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos...

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ここでは、行動と生体染色、メカノセンシング メキシコの血脈のシリーズの高スループット研究の手法を提示します。これらのメソッドは、動作研究実用的かつコスト効果の高い方法を提供するフリー ソフトウェアとカスタム...

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体外受精は、ラボ集団を維持し、下流アプリケーション用に同期胚を生成するために、様々なモデル生物と一般的に使用される技術です。ここでは、メキシコのテトラ魚、アスティアナックスメキシコの異なる集団のためにこの技術を実装するプロトコルを提示します。...

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木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発

学ぶメキシコテトラAstyanax mexicanusの飼育と幼生飼育、および後期幼生のホールマウント免疫組織化学法。河川型と洞窟型の表現型比較により、発生生物学と神経科学の研究に有用な手法を確立する。

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