Name: ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学ぶヒト多能性幹細胞からの肝細胞分化法。血清フリー培地で18日間で高純度の肝芽前駆細胞と肝細胞様細胞を効率的に誘導する技術。再生医療や肝疾患研究への応用が期待されます。

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我々は、Bingリムに対する議論と、インフラ支援のための幹細胞生物学&再生医療スタンフォード研究所に感謝します。この研究は、カリフォルニア再生医療研究所(DISC2-10679)とスタンフォードUCバークレーシーベル幹細胞研究所(L.T.A.およびK.M.L.)とスタンフォードベックマン分子遺伝医学センターと匿名によって支援されました。バクスターとディジェノバの家族(K.M.L.へ)。

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著者は何も開示していない。

この方法は、hPSCから肝臓芽前駆体、および続いて肝細胞様細胞の濃縮集団の生成を可能にする。ヒト肝細胞の濃縮集団を生成する能力は、このような細胞の実用的な利用のために重要である。hPSCから肝細胞を生成する以前の方法は、げっ歯類への移植時に、肝臓組織15に加えて骨および軟骨を得た肝臓および非肝細胞の両方を含む不純な細胞集団を得た。したがって、非肝臓分化の明示的な抑制は、様々なアプリケーションに適している可能性のある豊かな肝臓集団を生成するために重要です。
特に、最初のステップでhPSCの制御されためっきは、効率的な下流の差別化のために不可欠です。分化のために一定の密度でhPSCを正確にプレートし、めっきの過程でこれらのhPSCをウェルまたはプレートに均等に分配することが重要です。たとえば、12ウェルプレートの各ウェルについて、1ウェル当たり160,000~250,000 hPSCをシードします。全体的に、細胞種分密度をツチレートし、最終的に各細胞株に適した細胞密度をテストすることが不可欠です(...

このプロトコルの目的は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を肝臓芽前駆体および肝細胞様細胞2の濃縮集団に効率的に分化することである。ヒト肝前駆体および肝細胞様細胞の準備が整った供給へのアクセスは、肝機能および疾患を調査する努力を加速し、肝不全のための新しい細胞移植療法を可能にする3、4、 5.hPSC(胚性および誘導多能性幹細胞を含む)は、人体のすべての細胞型に分化することができるので、これは過去に困難であることが証明されています。その結果、肝細胞6のような単一細胞型の純粋な集団に排他的に区別することは困難であった。
hPSCを肝細胞に正確に区別するには、まず肝細胞がどのように指定されているのかだけでなく、非肝細胞型がどのように発達するかを理解することが重要です。非肝細胞がどのように発達するかについての知識は、分化中の非肝系統の形成を論理的に抑制するために重要であり、それによって排他的に肝運命2に向かってhPSCを導く。第二に、hPSCが肝臓の運命に向かって区別する複数の発達ステップを記述することが不可欠です。hPSCは、肝細胞様細胞(HEP)を形成する前に、原始的な筋(APS)、決定的内皮(DE)、後前駆体(PFG)および肝芽前駆体(LB)として知られている複数の細胞型に順次分化することが知られている。以前の研究では、肝臓の運命を指定するシグナルと、各発達系統選択2における代替非肝細胞型(胃、膵臓、腸前駆体を含む)の形成を抑制するシグナルを明らかにした。7,8.
これらの洞察は、これらの洞察は、原始的な筋、決定的な内因性、後頭蓋、肝臓芽前駆体、および最後に、肝細胞様細胞2に向かってhPSCを区別する血清フリー、単層法を生み出した。全体的に、この方法は、適切な密度で単層におけるhPSCの播種を含み、6つの分化媒体(様々な発達シグナル伝達経路を調節する成長因子および低分子を含む)を調製し、およびこれらのメディアを順次追加して、18日間にわたって差別化を誘導します。プロセス中に、細胞の通過は必要ありません。なお、この方法は非肝細胞型の形成を抑制するシグナルを明示的に含んでいるため、この分化アプローチ1は、現存する細胞と比較して肝前駆細胞および肝細胞様細胞をより効率的に生成する。分化方法2,9,10,11,12.さらに、このテキストに記載されているプロトコルは、最終的に他のプロトコル9、10によって生成されるものよりも高いレベルの肝転写因子および酵素を発現する肝細胞のより速い生成を可能にする,11歳,12.
ここで説明するプロトコルは、現在の差別化プロトコルに対して一定の利点があります。第1に、hPSCの単層分化を伴い、これは、胚体13に依存するもののような3次元分化方法と比較して技術的に単純である。第二に、この方法は、決定的な内皮細胞(肝細胞の早期前駆体)がhPSC分化2、7の2日以内に効率的かつ迅速に生成することができるという最近の進歩を利用し、その後のことが可能になる。増加した純度を有する肝細胞の産生。第三に、並べて比較すると、この方法2によって産生される肝細胞様細胞は、より多くのALBUMINを産生し、他の方法で産生される肝細胞と比較して肝転写因子および酵素のより高いレベルを発現する10、 11、12.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;Geltrex</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>1:1 DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>0.2&nbsp;&mu;m孔膜</td><td>フィルターMillipore</td><td>GTTP02500</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td>幹<td>細胞技術</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>チアゾビビン</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3845</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Accutase</td><td>GibcoまたはMillipore&nbsp;</td><td>Gibco A11105、ミリポア&nbsp;SCR005</td><td></td></tr><tr><td>IMDM、GlutaMAX&trade;サプリメント</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>ハムのF-12栄養素ミックス、GlutaMAX&trade;サプリメント</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>KOSR、ノックアウト セラム 代替品</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(ビニルアルコール)</td><td>シグマ-アルドリッチ&nbsp;&nbsp;</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーリン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td>10652202001</tr><tr><td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin</td><td>R&D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99201</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PI103</td><td>Tocris</td><td>2930/1</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF2</td><td>R&D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>DM3189</td><td>トクリス</td><td>6053/10</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>トクリス</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>ヒューマン BMP4</td><td>R&D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>C59</td><td>トクリス</td><td>5148</td><td></td></tr><tr><td>TTNPB</td><td>トクリス</td><td>0761/10</td><td></td></tr><tr><td>フォルスコリン</td><td>トクリス</td><td>1099/10</td><td></td></tr><tr><td>オンコスタチン M</td><td>R&D</td><td>295-OM</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>トクリス</td><td>1126</td><td></td></tr><tr><td>Ro4929097</td><td>セレック ケム</td><td>S1575</td><td></td></tr><tr><td>AA2P</td><td>ケイマン ケミカル</td><td>ズ16457</td><td></td></tr><tr><td>ヒト組換えインスリン</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;&nbsp;</td><td>11061-68-0</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

肝臓は有害物質を破壊し、重要なタンパク質を分泌し、重要な代謝活動を実行し、生命を維持します。その結果、慢性アルコール摂取、肝炎、急性中毒、またはその他の侮辱によって引き起こされる肝不全は、出血、黄疸、昏睡、そして最終的に死亡する可能性のある重篤な状態である。しかし、肝不全を治療するアプローチは、肝機能や疾患の研究と同様に、ヒト肝細胞の豊富な供給の欠如によって部分的にスタイミクされています。この目的のために、このプロトコルは、肝細胞様細胞へのヒト多能性幹細胞(hPSC)の効率的な分化を詳細に説明し、6つの連続した分化ステップにわたって肝臓の運命がどのように指定されるかを説明する発達ロードマップによって導かれる。発達シグナル伝達経路を操作して肝臓分化を促進し、望ましくない細胞の形成を明示的に抑制することにより、この方法は6日目までにヒト肝芽前駆体および肝細胞様細胞の集団を効率的に生成する。PSC分化の18とそれぞれ。これは、血清フリー培養培地における低分子および成長因子によって発揮される発達シグナル伝達経路の時間的に正確な制御を通じて達成される。このシステムの分化は単層で起こり、特徴的な肝細胞酵素を発現し、慢性肝不全のマウスモデルを生着させる能力を有する肝細胞様細胞を生み出す。インビトロで多数のヒト肝細胞を効率的に生成する能力は、肝不全の治療、薬物スクリーニング、肝疾患の機械的研究に影響を及ぼす。

APS分化の24時間後、コロニーは一般的にhPSCコロニーを囲む明るい境界線の喪失と伴う未分化コロニーとは異なる形態を採用する。形態学的に、原始的な筋細胞は一般的に不規則な境界線を有し、hPSCよりも広がり、よりコンパクトで低い-これは多能性エピブラスト細胞が分化し、原始に入るように上皮間葉転移の刺激である生体内のストリーク。分化前のhPSCのコロニーサイズが大きすぎると、未分化細胞を含むあからに発生した中心が存在します。このような大きな塊を含む培養物は、これらの未分化コロニーセンターが後続の分化を混乱させるので、廃棄する必要があります。正しいサイズと密度の塊がめっきされた場合、APS分化は非常に再現性が高く均一であり、99.3±0.1%MIXL1-Gfp+原始ストリーク集団を生成する(MIXL1は原始的な筋マーカーである)7。APS分化の24時間後に一部の細胞死が観察される。
分化の2...

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から肝細胞様細胞を18日間で効率的に生成する単層、血清フリー法を詳細に述べている。これは、hPSCが肝細胞様細胞を形成する前に、原始的な筋、決定的な内因性内因性、後部前腸および肝芽前駆体のような中間細胞型に順次分化するように6つのステップを伴う。

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

この方法は、高純度のヒト肝芽前駆細胞および肝細胞様細胞の多数の生成を可能にする。これらの肝細胞を生成する能力は、再生医療や他の分野のために重要である可能性があります。.この方法は、肝臓の分化を促進し、望ましくない細胞タイプの形成を抑制するための発達シグナル伝達経路を制御することにより、ヒト肝芽前駆細胞および肝細胞様細胞を6日および18日分化することによって効率的に生成することを可能にする。この技術の主な利点は、生成されたヒト肝細胞の高純度である。この手順であることに、 50 ミリリットル IMDM を攪拌棒を含む円錐形フラスコに加えます。培地を摂氏50度に加熱し、0.5グラムのPVAを加え、連続的に攪拌しながら、1ミリリットル当たり10ミリグラムの濃度でPVAストックを調製します。この後、加熱パッドからPVA溶液を取り出し、室温まで冷却します。溶液が冷却されたら、滅菌、0.2マイクロメートルのフィルターを通してそれをフィルタリングします。テキストプロトコルの表1に示すように、フィルタされたPVAと他の試薬を組み合わせてCDM2とCDM3を準備します。滅菌、0.2マイクロメートルのフィルターを使用して、すべての媒体をフィルタリングします。次に、テキストプロトコルの表1に概説されているように、残りのベースメディアであるCDM4とCDM5を準備します。分化培地を調製するために、まず凍結した小分子や成長因子を室温で解凍する。アリコートは、必要量の塩基媒質を出し、適切な濃度で塩基培地に指定された小分子および成長因子を加える。使用前日に、4°Cでマトリックスを解凍します。翌日、500マイクロリットルのマトリックスを50ミリリットルの冷たいDMEMに加えて1~100の比率でマトリックスを希釈します。希釈マトリックスを必要な数のウェルにピペット化し、十分な量の溶液を使用してウェルの表面を覆います。マトリックスコーティングされたプレートを摂氏37度のインキュベーターに少なくとも60分間移します。播種の直前に、コーティングされたウェルから残りのマトリックス溶液を吸引する。次に、大部分のコンフルエントhPSC培養プレートから培地を吸引し、商業的に購入した解離剤を添加し、細胞が成長している表面を覆うのに十分な量を使用することを確認する。解離剤中のhPSCを摂氏37度で5分間、または一部のコロニーが剥離し始めるまでインキュベートする。次にDMEMとF-12を加え、解離剤を希釈する。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、井戸の表面からすべての細胞を洗い流すために何度も何度もピペットを軽くピペットします。再懸濁した単一細胞を50ミリリットルの円錐管に集め、必要に応じてDMEMとF-12で希釈します。このチューブを350倍gで、摂氏4度で細胞をペレット化する遠心分離器を採取した。遠心分離を待っている間に、hPSCが播種されるプレートからマトリックスを吸引する。それらをカバーするために受取人の井戸に十分な量のmTeSRメディアを追加します。遠心分離が完了したら、上清を慎重に吸引し、ペレット化したhPSCを円錐管の底部に残す。mTeSR中の細胞ペレットを再懸濁し、市販のチアゾビビンの1つのマイクロモルを補充する。P1000ピペットを使用し、2〜3回穏やかにトリチュレートし、細胞ペレットを単一の細胞懸濁液に均等に再懸濁させる。直ちに10マイクロリットルの細胞懸濁液をヘモサイトメーターにピペットし、細胞数をカウントする。チアゾビビン補充mTeSRで再懸濁されたhPSCの体積を調整して、メッキに対する所望の細胞濃度を達成します。次に、プレートを十字型で数回振って、細胞が均等に分布していることを確認します。hPSCが少なくとも24時間めっきされた後、位取りhPSCコロニーの直径に特に重点を置いて細胞の形態を確認するために位相対数顕微鏡を使用する。次に、テキストプロトコルの表2に示すように、1日目のAPS分化媒体を準備します。播種した翌日、メッキされたhPSCからチアゾビビン補充mTeSRを吸引し、IMDM培地で短時間洗浄する。この後、hPSC に 1 日目のメディアを追加します。時間を記録し、セルを摂氏37度でインキュベーターに戻します。必要な分化培地を調製し、同じ時間の分化の各日に細胞に追加することによって、その後の分化ステップを続けます。本研究では、肝臓芽前駆細胞の濃縮集団とその後の肝細胞様細胞がhPSCから生成される。分化の2日目までに、原始的なストリーク細胞は2日目の決定的な内胚葉細胞に分化した。これらの細胞の大部分はSOX17およびFOXA2を発現する。分化の3日目までに、内胚葉細胞は形で多角形に見える前駆細胞に分化した。その後、6日目までに、前駆者は肝芽前駆物質に分化した。これらの肝芽前駆物質は、AFP、TPX3、およびHNF4αを発現する。3つのhPSCラインにわたって、この方法は、約89%の効率で6日目のAFP陽性肝前駆細胞を生成し、最後に、hPSCからの肝臓分化の18日後に、アルブミン陽性肝細胞様細胞が現れる。形態学的には、これらの細胞は上皮に現れ、胆汁カナリクリを連想させる明るい境界を形成する。この段階では、18日目の細胞質は、核よりも暗く見える。ヒト多能性幹細胞を播種して分化する場合、適切な密度で播種し、プレートを振って井戸全体に分配することが不可欠です。ヒト肝細胞を体外で産生する能力は、科学者が肝臓開発の基礎となるメカニズムを調査することを可能にする技術です。この方法は、肝機能と病気を調査し、最終的に肝不全のための新しい治療法を可能にするために使用することができ、インビトロでヒト肝細胞の多数を生成します。

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