サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

部位特異的変異生成は、RNA-RNA、RNAタンパク質相互作用などの分子相互作用を研究するのに有用です。このプロトコルは、2つまたは3段階のPCRアプローチでサイト指向変異誘発を行う方法を説明します。この方法の主な利点は、組み込むことができる異なる突然変異の多様性と、それを行うための相対的な容易さとコストです。

まず、野生型DNAテンプレートとプライマーペア2、1、2、3、またはプライマーペア3、1、および3、4、PCR産物1を得るために使用します。アガロースゲル電気泳動によるPCR産物を検証するには、電子レンジを使用して1X TAEバッファーの100ミリリットルに2グラムのアガロースを溶解して2%アガロースゲルを作ります。1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの最終濃度で臭化エチジウムを添加します。

その後、アガロースゲルをキャストします。固化したら、電気泳動ユニットに入れる。既知のサイズのDNAラダーをロードし、PCRサンプルをDNAローディング染料と混合して井戸に積み込みます。

75ボルトでサンプルを45分間実行します。また、UVトランイルミエータまたはゲルイメージングシステムでバンドを可視化します。次に、メーカーのプロトコルに従ってゲル抽出キットでPCR製品を精製し、分光光度計で精製されたDNAの濃度を測定します。

次に、精製したDNAをマイナス20°CでTEバッファーに保存します。2ステップPCRで部位特異的変異を開始するには、まず野生型DNAテンプレートを使用し、次にプライマーペア2、1および2、2、5プライマー突然変異、またはプライマーペア2、2、および2のプライマーペアを使用して、3つのプライマー突然変異に対してPCR産物2を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。

次いで、野生型DNA鋳型とPCR産物2をプライマーとして使用し、プライマー2と共に、5つのプライマー突然変異に対して3つ、またはプライマー2、3つのプライマー突然変異に対して1つ、PCR産物3を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。次に、精製したDNAをマイナス20°CでTEバッファーに保存します。

3ステップPCRで部位特異的突然変異誘発を開始するには、まず野生型DNAテンプレートとプライマーペア3、1、および3、2を使用してPCR産物2を得ます。野生型DNAテンプレートとプライマーの組を3、3、および3、4を使用して、PCR産物3を得る。野生型DNAテンプレートとプライマーの組を3、3、4、4で、PCR産物3を得る。

ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。最後に、2~5ナノグラムのPCR産物をテンプレートとして用い、プライマーペア3、1、3、4を用いてPCR製品4を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。

精製したDNAをマイナス20°CでTEバッファーに保存します。本研究では、CsgDの転写後調節に関するRNA相互作用を調べるには、2段階および3段階の部位特異的変異誘発を用いた。野生型のCsgDをPCR増幅してPCR産物IAを生成し、野生型mcaSをPCR増幅してPCR産物IBを生成した。3段階PCR戦略を用いて、最初の2つのステップでPCR産物IIAとIIIAを合成し、第3ステップではIVAをCsgDに変異を導入した。

同様に、MCASでは、最初の2つのステップでIIB、IIIB、および3番目のステップでIVBを得るために、無料の部位指向突然変異が導入されました。ウェスタンブロット分析は、野生型mcaSの発現は野生型CsgDの翻訳を妨げるが、mcaSまたはCsgDのいずれかの突然変異が観察された抑圧を緩和することを示した。しかし、CsgDとmcaSの両方の突然変異は、CsgDの翻訳を妨げる。

2ステップPCR戦略を用いて、PCR産物IIC、IID、IIE、IIF、およびIIGを第1ステップで合成し、第2ステップでは、CSgD DNA全体に変異を導入する第2のステップで、IIIC、IIID、IIIE、IIIF、およびIIIGをPCR産物としました。インビトロに転写されたCSgD野生型および変異型RNAへのHFQ結合のEMSAの結果は、PCR産物IIIC、IIID、IIIE、IIIF、およびIIIGを用いて合成し、変異型対立遺伝子のKD値の増加を示した。これは、HFQが突然変異体にあまり効率的に結合できることを証明した。

さらにHFQは、CsgD上にいくつかの結合部位を有し、これは野生型RNAについて観察された3つのシフトによって示される。しかし、異なる変異型RNAに対して観察されるのは2つの結合部位のみである。したがって、サイト指向の突然変異アプローチは、HFQの完全結合に重要なCsgD mRNAの一次および二次構造を特定する。

ここで説明する部位特異的突然変異誘発法はPCRに依存する。適切な PCR プラクティスは、この方法にとって非常に重要であり、最適化を成功させるために必要な場合があります。部位特異的突然変異誘発は、EMSAおよびウェスタンブロッティングのような3つの方法すべてにおいてのみ強力である。

他の方法としては、例えば、種々の構造アッセイおよびいくつかの活性アッセイ、および翻訳後修飾研究が含まれる。