バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

このプロトコルは、研究者がサルコロナウイルスやほとんどのコロナウイルスなどの高病原性ウイルスのウイルス侵入事象を研究するために安全に使用できる疑似型ウイルスを生成することを可能にする。この多目的な技術は容易なセットアップの一時的なトランスフェクションに基づいている。このシステムは、コロナウイルスSだけでなく、他のウイルスの融合タンパク質と擬似タイプの粒子を生成するために適用することができます。

この手順を実証するには、ティファニー・タンとラクシュミ・ネイサンが行われます。私の研究室の大学院生。まず、HEK293T細胞を摂氏37度の10ミリリットル、事前に温めたDPBSを2回慎重に洗います。

次に、上清を吸引し、摂氏37度で予熱した25%トリプシン溶液の1ミリリットルの細胞を取り付ける。より、細胞のフラスコを5%の二酸化炭素環境で3〜5分間、細胞が剥離し始めるまで3〜5分間培養する。完全なDMEMの4ミリリットルを追加して、トリプシン溶液を非アクティブ化します。

そして、細胞計数スライドと光顕微鏡を使用して細胞を数えます。完全なDMEMで1ミリリットル当たり500,000細胞に細胞を希釈する。次に、6ウェル組織培養プレート中の細胞溶液のウェル当たり2ミリリットルの種子を作る。

そして、プレートを前後左右にそっと動かして細胞を均等に分配します。細胞が均等に分配されていることを確認した後、一晩または16〜18時間摂氏37度と5%の二酸化炭素環境でプレートをインキュベートします。プラスミドコトランスフェクションを3個前形にするために、まず、マイクロ遠心チューブ中のプラスミドと減らされた血清細胞培養培地の量を混合した。

混合物を室温で5分間インキュベートする。次に、脂質系トランスフェクション試薬のウェル当たり3マイクロリットルを、減少した血清細胞培養培地のウェル当たり47マイクロリットルに加える。混合物を室温で5分間インキュベートする。

次に、マイクロ遠心管に、パイプの上下に向かってトランスフェクション試薬とプラスミド溶液の量を等しく混ぜ合わせる。混合物を室温で20分間インキュベートする。細胞板を一晩インキュベーションした後、反転光顕微鏡を使用して、細胞の形態と密度を調べます。

次に、細胞の使用済み培地を吸引し、各ウェルに予温した還元血清細胞培養培地のウェル当たり1ミリリットルを軽く加える。次に、100マイクロリットルのトランスフェクション溶液を各ウェルドロップワイズに加えます。そして、5〜6時間の5%の二酸化炭素で摂氏37度で細胞をインキュベートします。

インキュベーションの終わりに、各ウェルに摂氏37度で、事前に温められた抗生物質の無料トランスフェクションDMEMの1ミリリットルを追加します。そして、48時間の5%の二酸化炭素で摂氏37度で細胞をインキュベートします。擬似型粒子の収集を開始するには、逆光顕微鏡を使用して、細胞の形態と一般的な状態を調べてください。

媒体の色は薄いピンクまたはわずかにオレンジ色でなければなりません。次いで、トランスフェクトされた細胞の上清を50ミリリットル円錐形遠心分離管に移す。細胞の破片を取り除くために7分間、重力の290倍の重力でチューブを遠心分離します。

次に、フィルターは、無菌0.45ミクロンの細孔サイズフィルターを介して上清を明示した。クライオバイアルで疑似型ウイルス溶液の少量アリコートを作る。そして、マイナス80°Cでそれらを保存します。

擬似粒子感染を行うために、まず、光学顕微鏡下で細胞を検査し、細胞のコンフルエント絨毯があることを確認した。その後、37°Cで予温DPBSの0.5ミリリットルで細胞を3回洗浄します。次に、細胞の上清を吸引し、解凍擬形粒子溶液の200マイクロリットルで細胞を接種する。

5%の二酸化炭素で37°Cで細胞を1〜2時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、摂氏37度で事前に温めたDMEMcの300マイクロリットルを加えます。そして、感染した細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で72時間インキュベートする。

最後に感染細胞の上清を吸引する。そして、ルシファーゼレポーターアッセイに先行する。疑似型粒子の感染性を定量化するために、まずマイナス80°Cで保存されたルシフェリン基質を解凍し、5回にマイナス20°Cで保存されたルシファーゼアッセイライシスバッファーを室温まで定量する。

次いで、ルシファーゼアッセイのライシスバッファーを滅菌水で1倍の濃度に希釈する。次に、希釈したバッファーの 100 マイクロリットルを各ウェルに加えます。そして、15分間ロッカーの室温でインキュベートします。

ルシファーゼ活性測定を行うために、一度に1つのウェル、まずマイクロ遠心管に20マイクロリットルのルシフェリン基質を加える。次いで、10マイクロリットルのライセートをチューブに加えます。チューブを軽くフリックして内容物を混ぜます。

そして、管をルミノメーター装置に入れた。蓋を閉じ、チューブの発光値を測定します。相対光単位の測定を記録し、データ分析の前に置きます。

SARS-SppおよびMERS-Sppの感染アッセイは、感受性の高い宿主細胞において、期待される陽性対照粒子と比較して、強い平均感染性を示した。非感染コントロールおよびウイルスエンベロープ糖タンパク質を欠く陰性対照粒子。またルシファーゼ活性アッセイは、SARS-SppおよびMERS-Spp感染性の濃度依存性を示した。

低い寛容な標的細胞におけるSARS-SppまたはMERS-Spp感染能の増加は、SARS-SppのACE2受容体、またはMERS-SppのDPP4受容体を発現するためにトランスフェクトされ、偽ウイルスの付着および侵入を媒介するためのNATOウイルスの受容体使用法と類似していることを確認する。このステップを実行する前に、二重チェック計算を行います。そして、ステップ中にすべてのソリューションがうまく混在していることを確認します。

ウェスタンブロットアッセイは、S糖タンパク質を擬似ビリオンに組み込む評価を行うために、濃縮擬似型粒子に対して行うことができる。ここで説明する擬似タイプド粒子はNATOウイルスよりも安全な代理であるが、依然としてバイオセーフティレベル2の予防措置が必要である。