Name: 細胞ベースのアッセイによるひと血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン G の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 学ぶ細胞ベースアッセイによる抗AQP4 IgG検出法。視神経脊髄炎スペクトラム障害の診断に有用で、高感度・高特異性を持つ臨床検査技術です。血清サンプルとバイオチップスライドを用いた標準的な検査手順を解説します。

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著者は国立科学財団の中国 (第 31600820)、健康と家族計画の吉林省委員会 (ナンバー 2016Q036) と科学と技術計画プロジェクトの吉林省号からの助成金からのサポートに感謝20180520110JH)。

この手順は、最初病院の吉林大学の倫理委員会によって承認された、約 1500 のテーマで行われました。
1. 患者登録や血液検体の採取
<ol><li>以下にクリニック患者主訴や症状に抗 AQP4 IgG 血清の研究室検出を適用します。同様の物理的な検査を実行します。 視神経炎: 視野の損失や視力の低下などの視覚障害を持つ患者は苦しみます。 急性脊髄炎: 患者は麻痺、感覚障害、自律神経機能障害を呈することがあります。 エリア後野症候群: 患者が原因不明のしゃっくり、吐き気や嘔吐の症状があります。 急性脳幹症候群: 脳幹部病変は、さまざまな症状と病変の位置によっては身体的な徴候にされる可能性があります。 症候性ナルコレプシーや間脳 MRI 病変 NMOSD 典型的な急性の間脳臨床症候群。 NMOSD 典型的な脳の病変を有する症候性脳症候群。 注:NMOSD5の国際コンセンサス診断基準によると患者は血清抗 AQP4 場合 NMOSD の診断は行うことが IgG 陽性はコアの臨床的特徴の少なくとも 1 つは上記記載されています。ただし、視神経炎だけ患者における抗 AQP4 IgG のテストはお勧めできません。</li>
	<li>
血液検体の採取 注:患者が絶食する必要はありません。<ol>
<li>4 mL 真空の血のコレクションの管に 2-3 mL の静脈血を描画します。</li>
		<li>30 分間室温 (RT) の凝固する血清を許可します。 注:長期にわたる凝固血小板からの漏出による血清レベルを増やすことができます。</li>
		<li>2100 x gで 5 分間遠心は慎重に新しい管へ血清を転送します。</li>
		<li>すぐに血清または因数を分析し、-20、保管または-80 ° C 注:-20 ° C でストレージは、-80 ° C は保管年数ヶ月の貯蔵のためです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 抗 AQP4 抗体の検出
注意:患者検体と試薬使用キットは伝染性材料を考慮されなければなりません。ナトリウムのアジ化物を含む試薬キットには有毒です。プロトコルのフロー チャートは、図 1で提供しています。
<ol><li>
準備
	<ol>
<li>使用する前に RT にキットを持って来る。 注: ストア 2-8 ° C でキット</li>
		<li>少なくとも 200 ml 0.2% を含む PBS 洗浄バッファーのトゥイーン 20。洗浄バッファーの 100 mL を 500 mL ビーカーに注ぎ。</li>
		<li>血清サンプル洗浄バッファーで 10 倍希釈。ディストリビューターの指示に従って正と負のコントロールを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンプル インキュベーション
	<ol>
<li>試薬トレイ (図 2) の反応場に 30 μ L の希釈サンプル、肯定的な制御または否定的なコントロールを追加します。 注:空気の泡を避けるため。</li>
		<li>バイオチップのスライドで保護カバーを取り外します。 注:剥離と固定セルの汚染を避けるためにバイオチップを触れないでください。カバーを取り外す前に、スライドに並べてを保持します。</li>
		<li>バイオチップ スライドを試薬トレイ (図 2) に適用します。室温 30 分インキュベーションを開始します。 注:すべてのサンプルは、他の液滴混合することがなく対応するバイオチップに接続されている個々 の液滴をする必要があります。</li>
		<li>洗浄バッファーで一度バイオチップ スライドを軽くすすいでください。少なくとも 5 分位できればシェーカーのビーカーの洗浄バッファーの 100 mL で 500 mL のビーカーにバイオチップ スライドを浸します。</li>
		<li>洗浄バッファーからバイオチップ スライドを取る。ペーパー タオルで反応場の外の残留洗浄バッファーを丁寧にぬぐいます。蒸発反応場の残留洗浄バッファーに 1-2 分のオープンエアのバイオチップのスライドを公開します。 注:反応場を乾燥しないでください。ペーパー タオルでバイオチップを触れないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
二次抗体の孵化
	<ol>
<li>ディストリビューターの指示に従って二次抗体溶液を準備します。</li>
		<li>きれいな試薬トレイの反応場に二次抗体を蛍光の 25 μ L を追加します。</li>
		<li>二次抗体と試薬カセットにバイオチップのスライドを適用します。室温 30 分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
取付
	<ol>
<li>使用される洗浄バッファーを注ぐし、ビーカーに 100 mL の新鮮な洗浄バッファーを追加します。2.2.4 と 2.2.5 の手順で説明するように洗浄を繰り返します。</li>
		<li>慎重にバイオチップ スライド (反応フィールドごとに 1 つのドロップ) を反応場に埋め込む媒体を追加します。カバーのガラスの 1 枚でバイオチップ スライドをシールします。空気の泡を避けるため。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蛍光検出
	<ol>
<li>顕微鏡と予熱 15 分選択フィルターの 488 nm の蛍光ランプをオンにします。</li>
		<li>オープン写真ソフトウェア。異なる倍率ですべて反応場の transfected 融合領域から写真を撮る。まず、概要については、4 倍の倍率で 1 つの写真を撮るし、10 x、20 x の倍率でより多くの写真を撮る。 注:詳細なプロトコルを表 1に示します。結果の解釈は、代表的な結果のセクションで説明します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 患者の診断
<ol><li>患者は血清抗 AQP4 場合 IgG 陽性、NMOSD のコア臨床特性の少なくとも 1 つを示しています (ディスカッション セクションを参照)、NMSOD5症例を診断。しかし、患者は抗 AQP4 場合、IgG 陰性、NMOSD の診断は除外されません可能性があります。</li>
</ol>

<ol><li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22in+vitro.Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311(2016).</li>
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<li>Wingerchuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+consensus+diagnostic+criteria+for+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).</li>
<li>Ruiz-Gaviria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+aquaporin+4+antibody+detection+tests+in+patients+with+neuromyelitis+optica%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).</li>
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<li>Fryer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP4+autoantibody+assay+performance+in+clinical+laboratory+service%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11(2014).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+in+neuromyelitis+optica%3A+re-testing+study+in+a+large+population+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China.</a> The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).</li>
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<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li>
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</ol>

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ひと血清中 igg 抗 AQP4 抗体を検出する広くアクセス可能なメソッドを説明しました。NMOSD、密接に関連 IgG 抗 AQP4 と信頼性の高い抗 AQP4 igg 抗体検出法の確立 NMOSD の臨床診断のため非常に重要です。まず、IgG 抗 AQP4 は、NMOSD の特定です。多発性硬化症は中枢神経系の免疫介在性疾患ではまた、NMOSD12と多くの類似点を共有します。ただし、抗 AQP4 IgG のみ陽性 NMOSD13でです。第二に、IgG 抗 AQP4 は NMOSD 患者の間で一般的です。NMOSD 患者の約 3 分の 2 は、血清抗 AQP4 IgG 陽性4です。第三に、最も最近の診断基準血清抗 AQP4 に基づいて NMOSD IgG 検査5。一緒に取られて、血清抗 AQP4 の igg 抗体の検出は、NMOSD の臨床診断を促進できます。
様々 な抗 AQP4 igg ...

血中 AQP4 IgG は視神経脊髄炎オプティカ スペクトラム障害 (NMOSD)1のコア診断バイオ マーカーです。細胞に基づく試金 (CBA) は、高い感度と特異性で広く使用されている抗 AQP4 igg 抗体検出法です。ここでは、CBA のための詳しいプロトコルを導入します。
AQP4、水チャネル蛋白質が膜貫通の六つのユニットと周囲の水溶液のいずれか 2 つのヘリカル ドメイン間隙2。IgG 抗 AQP4 は、目標3アストロ サイト終足に主にある AQP4 へのバインディングを介して NMOSD の病因に関与しています。それは抗 AQP4 IgG が陽性 NMOSD 患者4の約 3 分の 2 で示されています。最新国際診断基準 NMOSD のため、IgG 抗 AQP4 は、5コア診断バイオ マーカーと見なされます。この点では、それはひと血清を検出するための信頼性の高いプロトコルを確立する重要な抗 AQP4 IgG と NMOSD の臨床診断を容易にします。
現在、様々 な抗 AQP4 IgG の検出方法は、CBA、組織ベースのアッセイ、酵素抗体法、流れ cytometry6,7など、使用できます。CBA は抗 AQP4 IgG をキャプチャする、人間の AQP4 が発現する EU90 細胞を採用しています。キャプチャされた抗 AQP4 IgG は二次抗体を蛍光で検出され、顕微鏡による可視化しました。証拠の蓄積は CBA はより敏感なよりその他抗 AQP4 IgG の検出の方法6,7特定を示しています。メタ分析によると感度と特異度 CBA の 76% と 99% で、組織ベースよりも高かったことが示された、試金の酵素免疫6。さらに、igg 抗 AQP4 抗体の診断アッセイの多施設比較は実施7だった。193 研究被験者 15 ヨーロッパ診断センターからの合計では、7が在籍しています。7血清抗 AQP4 の igg 抗体を検出する方法は 4 種類活かされています。CBA がより敏感より他の方法7特定だったことを示した。AQP4 は 2 つの主要なアイソ フォーム (AQP4 M1 と AQP4 M23) として表した、抗 AQP4 IgG キャプチャ セルは AQP4 M1 または AQP4 M23 をトランスフェクトしました。ただし、キャプチャ セルのタイプは良いまま論争です。1 つの調査は AQP4 M1 ベースをサポートして CBA8、他人は AQP4 M23 基づく CBA であることが示されている間は良い7,9,10。ただし、AQP4 ベース M23 CBA は、非特異的 IgG 結合8のための偽肯定的な結果をもたらす可能性があります。会堂 et al.11は、AQP4 M1 と AQP4 ベース M23 CBAs 間抗 AQP4 igg 抗体検出率に有意差はなかったことを報告しました。
要約すると、血清抗 AQP4 の IgG は NMOSD コア マーカー。CBA は、高い特異性と他の抗 AQP4 の igg 抗体の検出法よりも感度をが。それは残る AQP4 M1 または AQP4 M23-ベース CBA が良いかどうか物議を醸す。この記事では AQP4 ベース M1 CBA のための詳しいプロトコルは説明した、NMOSD の臨床診断学に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>抗アクアポリン-4 IIFT</td><td>Euroimmun</td><td>FA 1128-2005-50</td><td>AQP4-M1トランスフェクトおよび非トランスフェクトのEU 90細胞、フルオレセイン標識抗ヒトIgG、ポジティブコントロールとしての抗AQP4抗体、抗体陰性サンプル、PBS pH 7.2、Tween 20および包埋培地の塩でコーティングされたバイオチップスライドが含まれています。</td></tr><tr><td>CellSens Dimension</td><td>OLYMPUS</td><td>N/A</td><td>写真ソフト</td></tr><tr><td>ゲル&血栓活性化チューブ</td><td>医療</td><td>623040202</td>の向上 <td>中国現地企業より</td></tr></tbody></table>

細胞ベースのアッセイによるひと血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン g の検出

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

アンチ-アクアポリン-4 (AQP4) 免疫グロブリン G (IgG) は視神経脊髄炎オプティカ スペクトラム障害 (NMOSD) のコアの診断バイオ マーカーです。細胞に基づく試金 (CBA) は、高い感度と特異性を持つひと血清中 igg 抗 AQP4 抗体を検出するため広く使用されている方法です。簡単に、血清 IgG 抗 AQP4 は、バイオチップに固定し、フルオレセイン標識二次抗体で検出された AQP4 を発現させた細胞によってキャプチャされます。蛍光顕微鏡を利用して、蛍光を可視化するし、少なくとも 2 つの経験豊富な臨床医によって蛍光の強度を評価します。NMOSD の最終的な診断は、抗 AQP4 IgG の検出結果、臨床症状および画像所見の組み合わせに基づいて行うことが。以前の研究によると CBA はより敏感でありその他抗 AQP4 IgG の検出法よりも特定と臨床診断と NMOSD の研究に適用することができます。メソッドには制限があります。たとえば、血清 IgG 抗体は抗 AQP4 を評価する国際的な規模はまだ欠けています。ここでは、CBA を用いたひと血清抗 AQP4 igg 抗体検出のための詳しいプロトコルを説明します。

ここで説明する手順を使用して、特定の抗 AQP4 血清中 IgG は検出です。中には、希釈サンプル、陽性対照および陰性対照が transfected と融合領域 (図 2) を含む反応のフィールドに追加されました。Transfected 領域で負の制御の蛍光は主にバイオチップ (図 3) に transfected セルに二次抗体の非特異的結合を示されました。均一弱い蛍光が表示されます (図 3)。肯定的な制御は抗 AQP4 抗体は反応場に追加されました。強い蛍光が transfected セル (図 4) の AQP4 m1 抗 AQP4 IgG の特定の結合を示した transfected 領域で観察されました。蛍光融合領域で肯定的な制御のバイオチップ (図 4) 固定セル...

細胞に基づく試金は広く使用されている血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン g. を検出方法です。このメソッドは、臨床診断や視神経脊髄炎光スペクトラム障害の科学的研究に適用でした。

細胞ベースのアッセイによるひと血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン G の検出

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

神経髄炎の光学スペクトル障害に関する最近の国際的な診断基準によると、抗AQP4 IgGは、コア診断バイオマーカーであると考えられている。細胞ベースのアッセイによる抗AQP4 IgG検出は、臨床診断を容易にすることができる。したがって、細胞ベースのアッセイは、他の検出方法よりも感度が高く、特異的です。そして、それは臨床診断と科学的研究の両方に適用することができます。まず、患者の血清サンプル、バイオチップスライド、PBS粉末、およびTWEEN 20を冷蔵された細胞ベースのアッセイキットから室温に持ち込む。次いで、各バイオチップスライドに対して0.2%のTWEEN 20を含むPBS洗浄バッファーを200ミリリットル以上調製した。洗浄バッファーを使用して、各血清サンプルの 10 倍の連続希釈液を作ります。メーカーの指示に従って、正と負のコントロールを準備します。試薬トレイ上の5つの個々の反応フィールドに、サンプルの10倍の連続希釈液、陽性対照、および陰性対照の30マイクロリットルを加えます。バイオチップスライドをスライドで保持し、反応フィールドに触れることなく保護カバーを取り外します。試薬トレイの上にスライドを置き、30分間室温でセットアップをインキュベートします。洗浄バッファーで、バイオチップスライドをそっと洗い流します。その後、洗浄バッファーの100ミリリットルで満たされた500ミリリットルのビーカーに浸し、室温で10分間放置します。洗浄バッファーからバイオチップスライドを取り出します。ペーパータオルを使用して、残りのバッファーを反応フィールドの外側から慎重に拭き取ります。スライドを1~2分間空気乾燥させます。暗室では、試薬トレイの各反応フィールドに25マイクロリットルの蛍光二次抗体を加えます。試薬トレイの上にスライドを置き、30分間室温でセットアップをインキュベートします。洗浄バッファーで、バイオチップスライドをそっと洗い流します。その後、新鮮な洗浄バッファーの100ミリリットルで満たされた500ミリリットルのビーカーに浸し、室温で10分間放置します。洗浄バッファーからバイオチップスライドを取り出します。ペーパータオルを使用して、残りのバッファーを反応フィールドの外側から慎重に拭き取ります。スライドを1~2分間空気乾燥させます。バイオチップスライドの各反応フィールドに、埋め込み培地を1滴慎重に追加します。最後に、気泡を避けながらカバーガラスでバイオチップスライドをシールし、イメージングを進めます。感染領域で観察された陰性対照の弱い蛍光強度は、二次抗体の非特異的結合を示す。感染した領域と感染していない領域における陽性対照の検出された蛍光強度の比較は、感染細胞におけるAQP4 IgGとAQP4M1の特異的結合を示す。抗AQP4 IgG陰性血清は、感染した領域と感染していない領域の両方で陰性対照と同様の結合パターンを示す。陽性血清は、感染した領域と感染していない領域の両方で陽性対照と同様の結合パターンを示す。サンプルは、感染領域で蛍光が不均一に増加すると、抗AQP4 IgG陽性と見なされます。蛍光強度は、血清中の抗AQP4 IgG価に相関する。サンプルは、トランスフェクション領域内の少数の細胞のみが検出可能な蛍光強度を示す場合に、おそらく陽性と考えられる。感染領域の強度が感染していない領域よりも均質に強い場合、サンプルは抗AQP4 IgG陰性とみなされるべきです。気泡を避けることは非常に重要で困難です。気泡を除去するには、まずピペットを使用して、液滴中の気泡を避けてください。第2に、試薬トレイにバイオチップスライドを施しながら、まずスライドの片側を液滴に触らせ、次にゆっくりとスライドをレベル付けする。また、実験中は反応場に触れないでください。

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免疫学と感染症

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