Name: マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶマウス皮膚創傷とStaphylococcus aureus感染に対する生得免疫応答のリアルタイムモニタリング法。LysM-EGFPマウスを用いて好中球動態を可視化し、感染メカニズムと治療戦略の理解を深める。

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この作品は、国立機関の健康補助金 R01 AI129302 (S.I.S.) と薬理学のトレーニング プログラムによって支持された: に枕元にはカリフォルニア大学デービス校でベンチから (NIH T32 GM099608 L.S.A に)。分子・ ゲノム イメージング (CMGI) カリフォルニア大学デービス校では、優れた技術サポートを提供しました。

すべてのマウスの研究を行った機関動物ケアとカリフォルニア大学デービス校で利用委員会によって承認され、動物福祉法と健康の研究延長行為のガイドラインに従って行われました。必ず動物を操作するときは、滅菌手袋を使用してください。
1. マウスのソースと住宅
<ol><li>派生する LysM eGFP マウス c57bl/6 j の遺伝的背景に12を前述のよう。LysM EGFP × MyD88-/-マウスで横断する LysM EGFP マウス c57bl/6 j 背景に MyD88-/-マウスを派生します。</li>
	<li>家のマウス飼育箱で。これらの研究は、カリフォルニア大学デイビスと単一の建物次の外科の前にグループの動物で収容されました。10-16 週間の年齢間のマウスを使用します。</li>
</ol>2. 細菌の準備と定量化
<ol><li>削除、発光から-80 ° C の記憶域の氷の融解の興味の黄色ブドウ球菌のひずみ。5% ウシ血液寒天培地プレート上で止めた。縞板 37 ° C 一晩 (16 h) で加湿のインキュベーターで孵化させなさい。 注: このプロトコル ALC2906 SH1000 ひずみが使用されました。この株には、 luxABCDE記者カセットPhotohabdus luminescens18から融合したペニシリン結合蛋白質 2 のプロモーターとのシャトル プラスミド pSK236 が含まれています。</li>
	<li>TSB 粉末、純粋な水とオートクレーブ滅菌に TSB の mL あたり 0.03 g を混合することによってトリプシン大豆スープ (TSB) を準備します。冷却、生殖不能の技術を使用して、必要に応じて抗生物質を追加します。このプロトコルでは生物発光 luxABCDE カセットが含まれています pSK236 シャトル プラスミドの表現の選択に TSB にクロラムフェニ コール18の 10 μ G/ml を追加します。</li>
	<li>一晩かけて培養を開始する 10 μ G/ml のクロラムフェニ コールと TSB に黄色ブドウ球菌プレートから 3-4 独立したコロニーを拾います。37 ° C 一晩 (16 h) でインキュベーター シェーカーで細菌を孵化させなさい。</li>
	<li>TSB に 10 μ g/mL クロラムフェニ コールで、サンプル 1:50 を薄めて一晩文化から新しい細菌の培養を開始します。200 rpm および 37 ° C でインキュベーター シェーカーの文化</li>
	<li>黄色ブドウ球菌を分割した後 2 時間監視光学密度 600 nm (外径600) 分光光度計に。外径600半ば対数相成長を見つけるために時間対を観察します。ALC2906 SH1000 株 0.5 の外径600は中旬対数であり、1 × 108 CFU/mL (図 1) の濃度に対応します。</li>
	<li>外径600が 0.5 と、冷たい DPBS と 1:1 細菌を洗浄します。遠心分離機 3,000 x gと 4 ° C で 10 分間の細菌慎重に上清をデカントし、追加チルド DPBS と渦を徹底的に追加します。もう一度 3,000 x gと 4 ° C で 10 分間遠心</li>
	<li>上清をデカント慎重に。必要な濃度で細菌のペレットを再懸濁します。これらの研究の ALC2906 SH1000 3 mL を収集し、1.5 mL の PBS、約 2 × 108 CFU/mL の細菌濃度に相関関係で再懸濁します。使用するまで氷の上の細菌を保ちます。</li>
	<li>細菌濃度を確認の細菌サンプル 1: 10,000、1: 100,000 の PBS 100 μ L を希釈します。寒天プレート 20 μ 因数。総検査で 37 ° c 16 h. カウント CFUs の加湿インキュベーターで孵化し、細菌濃度の次の日を計算します。</li>
</ol>3. 切除皮膚傷害と黄色ブドウ球菌の接種
<ol><li>0.03 mg/mL ブプレノルフィン塩酸塩 (~0.2 mg/kg) の 100 μ L を各腹腔内投与によるマウスに管理します。</li>
	<li>20 分後注入、2-4% イソフルランと 2-3 LPM 酸素と商工会議所の場所 2-4 マウス。マウスは完全に麻酔が、かつては、2-3 LPM 2-4% イソフルランと酸素に鼻の円錐形を一度に 1 つずつ接続してマウスを転送します。マウスは完全に各後部足の親指と人差し指の間をしっかりとつまんで麻酔確認してください。動物がピンチに応答しない場合は、次の手順に進みます。</li>
	<li>マウスの背面に 2 インチのセクションで 1 インチを電気バリカンで剃るし、きれいなワイプやガーゼを使用して毛皮切り抜き領域をクリアします。過剰な炎症を引き起こす可能性があります脱毛ローションを使用しないでください。</li>
	<li>きれいなマウスの戻る最初 10% ポビドン ヨードを浸したガーゼとし、70% エタノールを浸したガーゼ。外科領域の中心から外側へ移動、螺旋状の部分をきれいに。手術前に乾燥する外科の領域の約 1 分を待ちます。</li>
	<li>
2 本の指の間に緩くマウス裏剃毛押しながらしっかりと準備の外科領域の中心に滅菌 6 mm のパンチ生検。ピンと張った皮膚が引っ張らないででした。
	<ol>
<li>アウトラインの少なくとも 1 つのセクションで皮膚を完全にカットのある皮膚に円形のアウトラインを作成するパンチ生検をねじる。基になる筋膜や組織を切らないように注意してください。</li>
		<li>表皮と真皮パンチ生検によって捺印円形パターンをカットする滅菌はさみとピンセットを使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. s.球菌接種
<ol><li>目的の生物発光の乳酸菌で 28 G インスリン注射器を満たしなさい。本研究では 1 × 108 CFU/mL の濃度を管理 (50 μ L)。以上 100 μ L のボリュームを管理しないでください。</li>
	<li>
筋膜とで、マウスの背中に傷の中心組織と乳酸菌の 50 μ L を注入します。乳酸菌が漏れを最小限または分散で傷の中心に気泡を形成することを確認します。
	<ol>
<li>側に真皮をプル、注射器を組織にほぼ平行に持ち、筋膜の穿孔を示す抵抗の急激な減少が感じられるまで、組織に注射器をゆっくりとプッシュします。慎重に傷の中心に注射器をリードし、ゆっくりと乳酸菌を分配します。動物からゆっくりと注射器を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>上記のように感染していない動物の傷に滅菌 PBS の同じボリュームを挿入します。</li>
	<li>動物を檻に戻ります。熱ランプの下でまたは加熱パッドの上にケージを置き、麻酔から回復まで動物を監視します。</li>
</ol>5、Vivo バリと FLI
<ol><li>計測器のソフトウェアを介して全体の動物の撮像素子を初期化します。2-3 LPM 2-4% イソフルランと酸素を受けて商工会議所でマウスを麻酔します。撮像素子の内部 nosecones に麻酔を提供します。</li>
	<li>
撮像素子に負傷者や感染したマウスを配置します。傷ができるだけ平らになるようにマウスを配置します。以下のシーケンス設定を使用して、マウスをイメージします。
	<ol>
<li>画像のモードとして発光し、写真を選択します。露出時間は 1 分小さなビニングし F/ストップ 1 (発光) と F/停止 8 (写真)。排出フィルターはオープンです。画像を記録するには、取得をクリックします。</li>
		<li>画像のモードとして蛍光と写真を選択します。露出時間は 1 s で小さなビニングと F/停止 1 (蛍光) と F/停止 8 (写真) 465/30 の励起波長 nm と高いランプの強度と発光波長 520/20 nm。画像を記録するには、取得をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>動物を麻酔から回復までのケージとモニターに戻します。</li>
	<li>イメージとしてのマウス毎日説明上記。</li>
</ol>6. 画像解析
<ol><li>開いている画像を定量化します。</li>
	<li>利益 (率 ROI) の大きな円形の領域を画像でそれぞれのマウスの皮膚を含めて全体の創傷部にかぶせます。好中球生体内信号の FLI EGFP と体内のバリ黄色ブドウ球菌信号の数日後傷の端を越えて拡張 (図 2 aおよび2 b) これらの研究に含まれていた。測定の投資収益率と各マウス乱流熱フラックスのレコードの値をクリックします。各信号 (p/s)対時間の乱流熱フラックスをプロットします。</li>
	<li>
好中球や傷に黄色ブドウ球菌の絶対数が必要な場合は、次の実験を行います。
	<ol>
<li>体内の FLI EGFP 信号に好中球数を関連付ける、前述のように、c57bl/6 j マウスを傷し、LysM EGFP または LysM EGFPxMyD88-/-ドナーから骨髄由来の好中球 (1 x 1075 5 x 10) の範囲を転送直接上にさまざまな傷。イメージとして記載されている上記と相関体内 FLI EGFP は好中球の既知量に通知します。</li>
		<li>体内のバリ信号黄色ブドウ球菌CFU を関連付ける、傷し、上記のマウスに感染します。1 日目感染後レコード生体内でバリの信号にマウスから、すぐに安楽死させる、死体を冷やしなさい。傷を切除、組織を均質化し、一晩インキュベートの寒天培地に細菌希釈液をプレートします。次の日、傷口あたり CFU の決定にコロニーをカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>傷のエッジと傷 (cm2) の測定領域を創傷治癒フィット円形 ROI を測定し、対時間 (図 2) のベースラインから分数変化をプロットします。</li>
</ol>7. 統計
注:すべてのデータが表示されますを意味 ±SEM p < 0.05 は、統計的に有意と考えられていた。
<ol><li>ホルム Sidak メソッドを使用して 1 日に 2 つのグループ間の違いを決定する、α = 0.05、および一貫性のある SD を仮定しない時間の各ポイントを個別に分析</li>
	<li>テューキーの多重比較, 事後に一方向の分散分析によって同じ日に複数のグループ間の違いを比較します。マントルピース コックスによる実験群間の生存率を調べた。</li>
</ol>

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ロイド S ミラー MedImmune、ファイザー、Regeneron、およびちゃんすぐ Shiong Nanthealth 財団、報告される作業とは無関係な Noveome 伸びて、ちゃんすぐ Shiong Nanthealth 財団からコンサルティング料から助成を受けています。この稿では。他の作家が何を開示するあります。

利用する発光黄色ブドウ球菌黄色ブドウ球菌感染症モデル全体の動物インビボ光イメージング技術の高度な技術と組み合わせて蛍光好中球レポーター マウスの感染が生得の知識を高度な感染に対する免疫応答。LysM EGFP マウスを使った過去の研究はことを感染症の最初の 24 時間の上の黄色ブドウ球菌感染した傷口に 1 x 107好中球リクルートに14、および好中球の傷募集拡張その半減期 1.5 日から 5 日に示されています。黄色ブドウ球菌に対応-傷22を感染しています。マウス感染と戦うために適応生き残り戦術は TLR2/MyD88/PGE2における好中球 EGFP+殺菌し、骨の髄から感染した傷口に造血幹・前駆細胞 (HSPC) 人身売買します。依存的21。さらに、黄色ブドウ球菌を救出する好中球の必須ソース感染致死的な敗血症<sup class="xre...

黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)は、皮膚および軟部組織感染症 (SSTIs) アメリカ合衆国1の大半を占めています。発生率のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA) 感染症は、過去二十年以上2、永続化のメカニズムと新しい治療戦略の発見の研究をやる気にさせる着実に増加しました。MRSA 感染症の標準治療は全身抗生物質療法が、MRSA は時間3でますます抗生物質に耐性となっている、これらの薬は、特に否定的な健康への影響を引き起こしているホストの有益なマイクロバイを減らすことができます。子供4。前臨床研究は、MRSA 感染症5を治療するための代替戦略を検討しているが、ホスト免疫反応6を阻止する病原因子の出現のために挑戦を証明している診療所にこれらのアプローチを翻訳します。ドライブ黄色ブドウ球菌SSTIs ホスト病原体のダイナミクスを分析、我々 は非侵襲的結合と好中球数の縦のリードアウト細菌の豊かさの運動対策で傷のベッドに募集し地域を傷します。
好中球は、細菌感染症7の最初の応答と人間の最も豊富な循環白血球です。好中球は、機能的反応抗菌ペプチド、プロテアーゼ活性酸素種の生産を含む彼らの殺菌メカニズムによる黄色ブドウ球菌の感染症に対して有効なホスト応答のために必要なコンポーネント貧食能および好中球細胞外トラップ生産8,9を含みます。慢性肉芽腫症とベイジュ症候群などの好中球機能の遺伝的欠陥の人間の患者は、黄色ブドウ球菌感染に対する感受性の増加を表示します。さらに、患者 (先天性好中球減少症) など遺伝的と (化学療法の患者に見られる好中球減少症) など取得した好中球数の欠陥も非常に受けます黄色ブドウ球菌感染症10。黄色ブドウ球菌感染症をクリアするに好中球の重要性を考えると、免疫能力を高めることや、黄色ブドウ球菌の病変内で自分の番号をチューニングは、感染症を解決する効果的な戦略を証明するかもしれない。
過去 10 年間、人身売買の11,12を勉強するトランスジェニック マウスに蛍光好中球記者が開発されてきました。好中球レポーター マウスの全体の動物のイメージング技術を組み合わせて組織や臓器における好中球の時空間解析を許可します。黄色ブドウ球菌の生物発光菌株と組み合わせると、黄色ブドウ球菌の豊かさへの応答における好中球の集積を追跡することが可能だし、細菌の病原性のコンテキストで永続化および間接的要因影響を受ける組織13,14,,1516で好中球数を混乱させます。
マウスが人間よりも黄色ブドウ球菌の病原性と免疫回避機構を受けないです。野生型マウスが理想的な動物モデルの有効性を調査するためにできない場合がありますなど、慢性的な黄色ブドウ球菌の治療に治療を与えて感染。MyD88 欠損マウス (すなわち、MyD88-/-マウス)、機能的なインターロイキン 1 受容体 (IL-1 r) および Toll 様受容 (TLR) シグナリング、ショー大きい感受性と比較すると黄色ブドウ球菌の感染もない免疫不全マウス緊張野生型マウスの17と18皮膚黄色ブドウ球菌感染症のサイト売買は好中球の機能障害。MyD88-/-マウスの好中球蛍光レポーターを所有しているマウス緊張の開発は、現在好中球に比べて黄色ブドウ球菌感染症を治療する治療法の有効性を調査するための代替モデルを提供してレポーター マウス。
このプロトコルでは、免疫不全 LysM EGFP × MyD88-/-マウスで、黄色ブドウ球菌感染症の特徴し、経過と感染する LysM EGFP マウスの解像度を比較します。LysM EGFP × MyD88-/-マウスの開発が解決しない、慢性的な感染、感染 8 日後に 75% が負けます。初期好中球動員に重要な欠陥が発生する感染症の炎症期の 72 時間以上と 50 パーセントより少数の好中球は感染の後半段階で募集します。-/-マウスは、この特定 MyD88 ひずみ現在に比べて黄色ブドウ球菌感染症をターゲットと新しい治療技術の有効性を評価するための厳格な前臨床モデル LysM EGFP × の感受性の増加モデルします。野生型マウス、特に感染に対する自然免疫応答を高めることを目指し技術を活用します。

<table><tbody><tr><td>14 mL ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>6 mm ディスポーザブル生検パンチ</td><td>インテグラ ミルテックス</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>生物発光 S. aureus</td><td>ロイド・ミラー、ジョンズ・ホプキンス&nbsp;</td><td>ALC 2906 SH1000</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血液寒天培地、5%、ハーディ ダイアグノスティック</td>ス <td>VWR</td><td>10118-938</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノプリン塩酸塩注射剤</td><td>西洋医学供給</td><td>7292</td><td>0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール (結晶性粉末)</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>329461</td><td>0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software &ndash;IVIS Spectrumシリーズ、</td><td>Perkin Elmer</td><td>128113</td><td></td></tr><tr><td>LysM-eGFPマウス</td><td>、Thomas Graff、Albert Einstein College of New York&nbsp;</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>微量分光光度計</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>MyD88 KO マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>009088</td><td></td></tr><tr><td>不織布スポンジ</td><td>AMD- Ritmed Inc</td><td>A2101-CH</td><td>5 cm x 5 cm</td></tr><tr><td>Povidone ヨウ素 10% 溶液</td><td>Aplicare</td><td>697731</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>GraphPad ソフトウェア</td><td>ライセンス&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>トリプチン大豆ブロス</td><td>ベクトン、ディクソンアンドカンパニー</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) 感染症、メチシリン耐性の汚れを含む、医療システムに大きな負担です。毎年登山黄色ブドウ球菌感染症の罹患率、その病原性の付加的な研究のための要求があります。感染症の動物モデル宿主-病原体反応の理解を進めるし、効果的な治療法の開発に 。好中球は感染を壁し、細菌クリアランスの促進に膿瘍を形成することによって黄色ブドウ球菌感染症を制御する生得の免疫反応の主な役割を果たす黄色ブドウ球菌の皮膚感染症頻繁に潜入する好中球数は病気の結果と関連付けています。強化された緑色蛍光タンパク質 (EGFP) が (主に好中球によって表される) リゾチーム M (LysM) プロモーター領域に挿入を所有する LysM EGFP マウスと組み合わせて使用するとき全体の動物の in vivo 蛍光イメージング (FLI) を提供する、負傷者の肌に非侵襲的縦好中球移住を定量化を意味します。生物発光の黄色ブドウ球菌と組み合わせればひずみと逐次体内全体の動物生物発光イメージング (結合)、縦好中球動員ダイナミクスと体内細菌負荷のサイトの両方を監視することが可能です。解像度や死に感染症の発症から麻酔下マウスでの感染。マウスは、黄色ブドウ球菌によって生成される効果的な植民地化と人への感染を容易にする病原因子の数に優れています。免疫不全マウスは、永続的な黄色ブドウ球菌を調べるより敏感な動物モデルを提供する感染と自然免疫応答を向上させる治療の能力。ここで、黄色ブドウ球菌の皮膚感染を調査する野生型 LysM EGFP マウスと一緒に MyD88 欠損マウス (LysM EGFP × MyD88-/-マウス) に飼育されている LysM EGFP マウスにおける反応を特徴付けます。マルチ スペクトル同時検出体内 FLI、体内のバリを使用して細菌の負荷を使用して好中球動員ダイナミクスの研究を有効に、創傷治癒の長手方向と非侵襲的時間をかけて。

LysM EGFP × MyD88-/-マウスは LysM EGFP マウスよりも黄色ブドウ球菌感染症の影響を受けやすい
黄色ブドウ球菌における ALC290618,使用のひずみは、ライブと積極的に代謝の細菌から発光信号を作り出すルクスコンストラクトを含むプラスミドで構成しました。マウスに接種した場合、縦感染した傷内の細菌負荷を測定する体内生物発光イメージング技術の (結合) を使用できます。LysM EGFP × MyD88-/-マウスとする LysM EGFP マウスの両方が負傷し、1 x 107 CFU 傷に黄色ブドウ球菌感染症への感受性を比較する、黄色ブドウ球菌に感染しています。LysM EGFP × MyD88-/-</...

皮膚が負傷したに生得の免疫反応のリアルタイム検出とマウスの黄色ブドウ球菌感染症のためのアプローチを説明します。比較する LysM EGFP でマウス (蛍光好中球を所有) する LysM EGFP と交雑免疫不全マウス緊張、感染と戦うための方法の開発や感染症の理解を進めます。

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

細菌の負担と好中球の反応を同時に監視する技術は、ステープルオーレウス持続性のメカニズムと治療戦略の有効性に関する洞察を提供することができます。この技術の主な利点は、感染の持続期間を通じて、複数のパラメータを生きている宿主で縦方向に測定できることである。マウスのドーサムに傷をどこに置くか、皮膚を切除する方法、およびステープルアウレウスで創傷を接種する方法を示することが重要です。氷の上の負の80°Cの貯蔵から興味の生物発光ステープルアウレウス株を解凍することから始めます。5%のウシの血寒天プレートに培養物をストリークする前に。摂氏37度で一晩インキュベーションを行う場合。翌朝、ステープルアウレウスプレートからトリプティック大豆スープ(TSB)に3〜4個のコロニーを移す。37°Cで一晩揺れるインキュベーションのためのクロラムフェニコールのミリリットルあたり10マイクログラムを補う。翌朝、120マイクロリットルの培養サンプルをTSBの6ミリリットルで希釈する。クロラムフェニコール1ミリリットル当たり10マイクログラム、摂氏37度で2時間のインキュベーション、毎分200回転。600ナノメートルの光学密度が0.5に達すると、3ミリリットルの細菌懸濁液を10ミリリットルの氷冷DPBSに移します。上清を慎重にデカントした後、ペレットに冷たいDPBSを加え、再懸濁菌を徹底的に渦化させる。2回目の遠心分離後、細菌ペレットを氷上のPBSの1.5ミリリットルで再懸濁する。細菌濃度を確認するために、細菌懸濁液の100マイクロリットルを4thに1×10、5thに1x10の倍で連続的に希釈し、新鮮なPBSで。そして、個々の寒天プレートに各希釈液の20マイクロリットルをプレート。摂氏37度で一晩のインキュベーションの後、総検査でコロニー形成単位の数を数え、前日の細菌濃度を計算する。レシピエント動物の皮膚傷の切除については、マウスの背面に1つずつ2インチのセクションを剃る前に、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認する。そっと拭いて、迷子の毛を取り除きます。そして、露出した皮膚を消毒し、逐次10%ポビドネヨウ素、及び70%エタノール浸漬ガーゼ用途を用いた。スパイラルパターンで、外科的領域の中心から外側に移動する。皮膚を約1分間乾燥させた後、準備された外科領域の中心にある無菌6ミリメートルパンチ生検をしっかりと押す。パンチ生検をツイストして、皮膚に円形の輪郭を作り、皮膚組織を完全に切り裂き、輪郭の少なくとも1つの部分を作ります。根底にある筋膜や組織に切り込まないように注意してください。次いで、滅菌ハサミ、および鉗子を使用して、表皮および真皮を切断し、パンチ生検によって刻印された円形パターンに従う。ステープルアウレウス接種の場合、調製された生物発光細菌接種剤の50マイクロリットルで28ゲージのインスリン注射器を充填する。そして、指を使って負傷した動物の真皮を横に引っ張ります。組織に対してほぼ平行にシリンジを保持し、抵抗の急激な低下が感じられるまでゆっくりと組織に注射器を挿入する。筋膜のピアスを示す。針を創傷の中央に置いて、接種剤の全容をゆっくりと送達する。接種剤が傷口の中心に泡を形成し、漏れや分散を最小限に抑えて確認します。そして、動物からゆっくりと注射器を取り除きます。その後、完全な回復まで熱と監視でケージに動物を返します。創傷および感染後、そして実験中に毎日、麻酔薬を生物発光および蛍光画像体に入れ、傷をできるだけ平らにする。イメージャーソフトウェアで、イメージングモードとして発光と写真を選択します。露光時間は、小さなビン分割時に 1 分、発光の場合は F/ストップ 1、写真用の F/Stop 8、および放出フィルタ用に開く必要があります。次に、[取得] をクリックして画像を記録します。in vivo蛍光イメージングでは、蛍光を選択し、画像を撮像モードとして写真を選択します。露光時間は、小さなビンで1秒、蛍光のF/ストップ1、写真用のF/ストップ8、励起波長と発光波長を30ナノメートルで465、20ナノメートルで520、それぞれ高ランプ強度でプリセットする必要があります。次に、[取得] をクリックして画像を記録します。両方の画像を取得した後、完全に回復するまで、監視と一緒にケージに動物を返します。画像解析のために、適切な画像解析ソフトウェアプログラムで、定量化する画像を開き、周囲の皮膚を含む創傷領域全体にデフォルトの円形領域を配置します。対象の測定領域をクリックし、創傷の平均流束の値を記録して、各信号の平均フラックスを時間に対してプロットできるようにします。創傷治癒を測定するには、創傷端の上に関心のある円形領域をフィットさせ、創傷の面積をセンチメートル平方で測定し、ベースラインと時間からの小数変化をプロットできるようにする。本代表的実験では、条件付きEGFP発現骨髄異分化第一応答88、またはMyD88ノックアウトマウスは、非条件付EGFP発現動物よりも、ステープルオーレウス接種に対する感受性が大きいことを示した。感染の最初の8日間に観察された80%の致死性を有する。マウスの両方の株は、感染直後に体重の約5%を失った。しかし、マウスを発現する条件付きEGFPは、2日目までに元の体重を回復した。MyD88マウスはしませんでしたが。ステープルアウレウス感染の存在下での創傷閉鎖は、2つの株間で異ならなかった。しかしながら、無菌傷のMyD88ノックアウトマウスは、動物を発現する条件付きEGFPと比較して、創傷治癒に重大な欠陥を持っていた。全動物イメージングは、MyD88ノックアウト動物の創傷における生物発光シグナルの増加によって証明されるように、動物を発現する条件付きEGFPと比較して、より高い細菌負担を明らかにした。MyD88ノックアウト動物の未感染の創傷に対する初期好中球の人身売買の40%の減少は、動物を発現する条件付きEGFPと比較しても観察された。1 x 10から第7コロニー形成ユニットのステープルオーレウスが創傷直後に導入された場合、ノックアウト動物では、条件付きEGFP発現動物と比較して好中球の密売が有意に減少した。細菌を分配する前に、注射器に気泡がなく、針の位置が創傷の中央に正しく配置されていることを確認してください。動物組織は、目的のタンパク質の発現および創傷からの細菌の播種を測定するために終点で収穫することができる。黄色ブドウ球菌は人間に感染する。そのため、細菌を取り扱う際には個人保護具を着用し、病原体を含む注射器を取り扱う際には注意が必要です。この技術は、感染に対する宿主の自然免疫応答を高めるステープル・アウレウス感染症に対する生物学的治療の使用を探求するのに役立った。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

マウスの皮膚および軟部組織感染症のモデルは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）およびホストの免疫応答の病原性の機能を評価するために利用されている。ここで、我々は、皮膚および軟部組織感染症のための皮下感染モデルを発表した。...

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の皮下感染

Source: Zhang, C., et al., Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)The video demonstrates the isolation of kidneys containing Staphylococcus aureus-infected macrophages, followed by tissue homogenization to release intracellular bacteria. It quantifies bacterial persistence within macrophages in control and antibiotic-treated groups by counting colony-forming units.

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

このビデオは、GFP発現好中球を持つ免疫不全のトランスジェニックマウスの感染部位での好中球動員ダイナミクスを研究するためのin...

マウスモデルにおける感染部位における好中球動員動態と細菌負荷のモニタリング

このビデオでは、皮膚創傷感染症のマウスモデルを生成する手法を示しています。好中球に蛍光タンパク質を発現するように操作されたマウスに、遺伝子組み換え生物発光黄色ブドウ球菌(病原菌)を感染させると。感染部位の細菌負荷と好中球動員動態は、全動物イメージングを用いて研究することができます。...

細菌性病原体に対する免疫応答を研究するためのマウス皮膚創傷感染モデル

このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

動物モデルは、慢性炎症の発展に貢献宿主および病原体特異的なメカニズムを定義する上で非常に貴重なツールであることが分かっている。ここでは、ローカルおよび全身の部位での炎症の進行を評価するために、ヒト病原体ポルフィロモナス·ジンジバリスとディテールの方法論で経口感染のマウスモデルを記述する。...

局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

本プロトコルは、新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンの物理的特性、免疫応答、および インビボ...

メチシリン耐性 黄色ブドウ球菌 (MRSA)感染に対するナノエマルジョンアジュバントワクチンの免疫応答の評価

黄色ブドウ球菌 (S. aureus)は、全身に広がる能力があり、持続性および再発性の感染症を引き起こします。これらのプロセスをよりよく理解するために、この研究では、...

黄色ブドウ球菌の細胞内感染モデルの開発と評価

本プロトコルは、インプラント関連感染症を調査するために皮下背部移植を使用するマウスモデルを記述し、病態生理学的メカニズムの包括的な調査を可能にし、標的治療戦略による診断基準の開発をサポートします。...

マウスにおけるインプラント関連感染症の動物モデル

メチシリン耐性による実験的ラットの心内膜炎モデル...

メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;（MRSA）ラットにおける

学ぶマウス皮膚創傷とStaphylococcus aureus感染に対する生得免疫応答のリアルタイムモニタリング法。LysM-EGFPマウスを用いて好中球動態を可視化し、感染メカニズムと治療戦略の理解を深める。

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

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