Name: 初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイド ホルモン産生機能の試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: 学ぶラット初代副腎皮質細胞の培養法とステロイドホルモン産生機能の試金。酵素消化による組織分散とコルチコステロン測定で、ストレス関連疾患の研究に応用可能な信頼性の高いプロトコルを解説します。

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この作品は、国家科学審議会台湾 (NSC102-2320-B-037-008-MY3) と国立チェン Kung 大学病院研究助成 (NCKUH-10102045) からの助成金によって支えられました。

動物科目を含むすべてのプロシージャは、制度的動物のケアと使用高雄医科大学委員会によって承認されています。
1. 実験手順
<ol><li>CO2安楽死によって大人 (12 週齢に 8) 女性/男性 SD ラットを犠牲に。</li>
	<li>70% エタノールを適用させ、皮膚に吸収されると、その後、ティッシュ ペーパーで拭き取る。</li>
	<li>ラットを仰臥位できれいなプラスチック プレートにつけます。</li>
	<li>正中線で「外部」カーブタイプ鉗子で皮膚を持ち上げ、鈍的切離を実行 (大腿部弓下角度をレベル) から「Y」の形を作成。<ol>
<li>はさみ 70% エタノールでリンス、切っても「Y」の形を作成する筋肉。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
胃の後ろに左副腎を見つけます。 注:右副腎は肝臓の後ろに深く見つけることができます。<ol>
<li>胃や肝臓を持ち上げて、別のカーブタイプ鉗子で副腎を分離する鉗子の 1 つのペアを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>副腎を滅菌の皿に入れて後、微細鉗子で副腎のカプセルを慎重に取り外します。</li>
	<li>少し小さな断片に副腎をカットするはさみの繊細なペアは、無血清ダルベッコのビットのイーグル培地 (DMEM)、変更された/F-12 媒体。</li>
	<li>
3 つの異なる細孔サイズ パスツール pipets を準備し、コラゲナーゼ II (~0.5–0.8 mg/mL) と媒体を含んでいる 50 mL の円錐管に副腎のすべての部分を吸引する最初のパスツール ピペットを使用します。
	<ol>
<li>そっとティッシュをカップ刻んだ個の約 10 倍。Pipets の残りの部分を使用して、すべてのピースが小さくなるまで上記の手順を繰り返します。 注: パスツール pipets の異なる細孔径は、火にそれらを加熱することによって作成できます。最初のピペットはオリジナル サイズ (約 1 mm)、2 つ目の気孔のサイズは、約 0.8 mm、3 番目のパスツール ピペットは約 0.5 mm。消化中、副腎の部分は小さくなっていきます。したがって、機械的手順を介して、副腎は完成品より消化することができます。(37 ° C) で水浴のチューブを孵化させなさい、振って 5 分毎に、合計で 4 倍。</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 分インキュベーション後、新鮮でクールな媒体 (六倍ボリューム; たとえば、組織の 5 mL + クールな DMEM/F-12 媒体の 25 mL) 含む 2.5% ウシ胎児血清 (FBS) と 5% 馬血清酵素効果を停止するを追加します。</li>
	<li>800 x gで 10 分間遠心分離によって細胞ペレットを収集します。</li>
	<li>セルを中断する媒体の適切な量を追加します。 注:各腺は約 3 〜 10 x を行うことができます5 〜 105セル × 4。</li>
	<li>培地で必要な版または皿の細胞をプレート (25 mM HEPES と 1% ペニシリンとストレプトマイシン添加 DMEM とハムの F-12 媒体の 1:1 [v/v] 混合物) で 37 ° C、95% 空気と 5% CO2の加湿環境昨夜 (0 日)。 注: コルチコステロンの試金のため 24 ウェル プレート (4 腺/プレート) で細胞をプレート私たち通常、および 35 mm 料理 (料理 1 つ腺/約 1 ~ 2) 西部のしみ分析。</li>
	<li>慎重に洗浄セル 2 無血清温かい DMEM/F-12 媒体 (1 日目) と x。新しい成長培地を交換してください。</li>
	<li>3 日目まで 95% 空気と 5% CO2の加湿環境で 37 ° C で細胞を維持します。</li>
</ol>

<ol><li>Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrith%2C+CH+%22+Endocrine+System.+Monographs+on+Pathology+of+Laboratory+Animals%22"> Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals</a>. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).</li>
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<li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+metabolism+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).</li>
<li>Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+cell+proliferation+and+steroidogenesis+in+cultured+human+fetal+adrenal+cells+chronically+exposed+to+adrenocorticotropic+hormone%3A+rationalization+of+in+vitro+and+in+vivo+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings.</a> Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).</li>
<li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins%3A+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li>
<li>Hoeflich, A., Bielohuby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+adrenal+gland+growth%3A+signal+integration+by+extracellular+signal+regulated+kinases1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).</li>
<li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+responses+to+corticotrophin+and+cyclic+AMP+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

副腎は、環境適応3で重要な役割を再生します。副腎皮質が分泌するホルモンは、規制し、生理機能と恒常性3を調整できます。生体内でのモデルには、体の本当の生理効果が反映されます。しかし、それはまだ実験で不安定な影響を引き起こしている多くの複雑な要因に影響されます。対照的に、培養細胞モデルでは利点がある動物モデルに比類のないになります。まず、環境条件は、in vitro システムでコントロールしやすいです。ホルモンは、任意の刺激の影響を受ける可能性があります。動物が苦痛になりやすいために、生体内の実験は通常非特異的な反応になります。第二に、物質は体内を監視するため容易ではないが培養システムに責任を負う。第三に、体外のシステムは、それぞれ独立した実験の差異を低減します。多くの科学的なレポート表示プロトコルがここで提示に対し 10-20% FBS12,13,14<sup...

内分泌系は生理学的な活動と恒常性1の調節を担当です。腎臓の頭蓋の極に位置する副腎、ミネラルコルチコイド、糖質コルチコイド、アンドロゲン2,3を分泌する主な内分泌器官の一つです。副腎の 2 つの部品がある: 皮質と髄質。副腎皮質は 3 層で構成されています: 外側の球状、中間皮質および内部の斑3。球状はアルドステロン、ナトリウム イオンと3腎臓の水再吸収を助ける鉱質コルチコイドの分泌元のサイトです。ゾナ副腎皮質は主に通常の生理条件3のグルココルチコイドの基底レベルを生成します。齧歯動物の副腎皮質ステロイドと人間のコルチゾール血ブドウ糖3を調節することによってストレスに対処で体を支援するために行動します。ある程度、炎症反応を抑制する、免疫システム4,5を規制できます。他の哺乳類、マウス、ラットと対照をなして副腎6、7の 17 α-ヒドロキシラーゼ式の不足のための機能的な網状を必要はありません。したがって、マウスおよびラットの副腎、副腎の C-19 ステロイド (コルチゾール、副腎男性ホルモン) の分泌を欠いています。
副腎皮質培養細胞副腎生理8を制御するメカニズムを調査するために有用であることが示されています。他のステロイド ホルモン産生組織のような各副腎ゾーンは遊離型コレステロール9からそのステロイドを合成します。刺激による副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、遊離コレステロールは内訳脂質液滴から解放され、したがって、副腎皮質、皮斑10でステロイドの産生を促進します。
多くのグループは、副腎皮質癌から安定したセルラインを確立しようとしています。ただし、いくつかの懸念には、副腎皮質細胞の生体外モデル8のように使用が限られています。細胞のステロイドの応答は通路、血清のロット番号と血清等の品質が異なる場合があります。さらに、商業の副腎細胞株 (Y1 と SW13) は副腎ステロイド生合成の8を研究することが難しく、コルチコステロンを分泌しません。前のヴィヴォ モデルは良い選択をすることができるこれらの市場からの組織は、いくつかの未知のリスクをぼやける場合がありますにもかかわらず、牛と馬の副腎を使用してください。それらに比べると、ラット副腎の管理が簡単で、ソースが比較的安定していてより病原体フリーします。一緒に取られて、ここで説明した本法は、ラット副腎皮質細胞におけるコルチコステロン合成の関連のメカニズムを調査する使用できます。

<table><tbody><tr><td>雌/雄、SD/Wistarラット(8-12週間)</td><td>BioLASCO</td><td></td><td>雄または雌ラットは実験に適しています。雌の副腎は雄のラットよりも大きいですが、雌のラットは実験に影響を与える可能性のある発情周期を所有し</td></tr>ています <tr><td>コラゲナーゼ、II型</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td>副腎細胞の単離</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12800-017</td><td>副腎細胞用粉末培地</td></tr><tr><td>ハムのF12</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21700-075</td><td>副腎細胞用粉末培地</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>JT.baker</td><td>4018</td><td>緩衝液(粉末)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>JT.baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Hyclone</td><td>16050014</td><td></td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>SAFC</td><td>12103C</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン (10,000 U)-ストレプトマイシン (10,000 ug/mL)</td><td>コーニング</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質 湾曲鉗子</td><td>BRAUN</td><td>BD343R</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>BRAUN</td><td>BD331R</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>BRAUN</td><td>BC224R</td><td>ラットの皮膚と筋肉を切る</td></tr><tr><td>デリケートなハサミ</td><td>BRAUN</td><td>BC101R</td><td>副腎を切る</td></tr><tr><td>脂肪分化関連タンパク質</td><td>Abcam</td><td>ab108323</td><td>脂質飛沫関連タンパク質</td></tr><tr><td>コルチコステロン ELISAキット</td><td>ケイマン</td><td>500655</td><td>コルチコステロン合成のアッセイ</td></tr><tr><td>倒立型光学顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT.baker</td><td>X198-07</td><td>免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG Alexa 488 蛍光二次抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11034</td> 免疫<td>蛍光染色用</td></tr><tr><td>免疫</td><td>蛍光染色用</td>抗ADFP <td>Abcam</td><td>108323</td></tr><tr>免疫<td>蛍光染色用</td><td>ProLong Gold退色防止封入剤</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td></tr></tbody></table>

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイド ホルモン産生機能の試金

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

副腎皮質が分泌するホルモンは、ストレスや病気に対して動物に不可欠です。ここで説明する方法は、初代培養ラット副腎細胞および関連機能アッセイ (コルチコステロンの分析と同様、脂質液滴表面蛋白質の蛍光抗体染色) の手順です。体内のモデルとは異なり副腎単層培養で interexperiments のバリエーションが少なく、実験条件がコントロールしやすい。その上、ラットのソースは牛のもののような他の動物よりも安定も。副腎研究で使用することができますいくつかのひと副腎細胞株 (NCI H295、NCI H295R、SW13 等) もあります。ただし、これらの行のステロイドの生産は血清のロット番号、通路番号、個別の遺伝子などの変異/損失を含む多数の要因によっては影響も。17 α-ヒドロキシラーゼを欠けているを除いてラット副腎皮質細胞の初代培養は副腎の生理学を研究のためのより良いより便利な技術です。要約すると、初代ラット副腎文化副腎システムに関心の試薬のメカニズム解明のための研究者の良い体外プラットフォームとなる可能性があります。

ここで説明する手順を使用して、(図 1 a) 位相差顕微鏡下で培養副腎細胞を識別できた。脂質を細胞質内小胞に、ことを確認、脂肪分化関連蛋白質 (ADRP) の免疫組織染色法は (図 1 b) 一日 3 文化の実施でした。セルはガラス coverslips に育った。セルは、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 回を洗浄され、4% パラホルムアルデヒドで固定します。PBS 洗浄 3 回後、細胞ブロックされたとグリセリン 0.1% と 5% の乳脂肪のトリトン X-100.一次 ADRP 抗体希釈 (1:50) は、5% の乳脂肪と一晩インキュベートしました。後 3 回 PBS 洗浄のセルを添加してヤギ抗うさぎ Alexa Fluor 488 二次抗体 (1: 100)。洗浄のステップを繰り返し後、細胞延長金 Antifade メディアをマウントがマウントされた、蛍光顕微鏡下で検討しました。また、ラット副腎細胞のホルモン産生能は、コルチコステロン アッセ...

副腎皮質から分泌されるホルモンは、ストレスや病気に対して動物に不可欠です。ここでは、プライマリのラットの文化にプロトコル副腎細胞を提案します。副腎ステロイド生合成機能と脂質生合成に興味の試薬のメカニズムを調査するための良い生体外のプラットフォームかもしれない。

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

提示されたプロトコルは非常に簡単であり、研究者が一次副腎培養を準備するのに役立ちます。これは、副腎ステロイド新生を開始するための簡単な手順を提供します.この技術は、ストレス関連疾患のスクリーニングに適用され得る、薬剤阻害された炎症反応のすべての可能性。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程の学生、ウェイ・チャン・リーです。70%エタノールを使用して安楽死SDラットを殺菌し、皮膚に吸収させることから始めます。ティッシュペーパーで皮膚を拭いた後、ラットを上皮のきれいなプラスチック板の上に置きます。次に、外部湾曲した鉗子を使用して、正中線で皮膚を持ち上げます。はさみを使用して、太もものレベルから肋後の角度までY形状を作成して皮膚の鈍い解剖を行います。70%エタノールでハサミをすすった後、筋肉を切断し、Y字も作り出す。肝臓の右後ろの胃の後ろに左副腎を見つけます.標準的な鉗子と湾曲した鉗子のペアで、胃と肝臓を持ち上げ、別の湾曲した鉗子で副腎を分離し、無菌皿に入れます。細かい鉗子を使用して、各腺から副腎カプセルを慎重に移動します。さて、組織を覆うのに十分な量の無血清DMEM F-12培地で副腎を小片にカットするために繊細なハサミを使用してください。バーナーの上にそれらを加熱することによって、3つの異なる注ぐサイズのパスツールピペットを準備します。最大の開口部を持つ最初のピペットを使用して、すべての副腎片をコラゲナーゼII.穏やかにピペットで約10回上下する培地を含む50mL円錐形チューブに移します。その後、摂氏37度の水浴でチューブを20分間インキュベートし、5分ごとに合計4回振ります。酵素消化中に組織分散を適切に行うことは非常に重要です。2番目と最小の注ぐサイズのピペットを使用して、すべての組織片が小さくなるまでピペットとインキュベーションを繰り返します。その後、酵素反応を停止するために摂氏4度の冷たい媒体でブレッシュの6倍のボリュームを追加します。その後、800倍Gで10分間セントラフジし、上清を2回とも廃棄する。適切な量の培地を追加し、セルを再中断します。湿度95%、二酸化炭素5%で摂氏37度で一晩培地で成長させた所望のプレートまたは皿に細胞を植えます。翌日、細胞を無血清で温かいDMEM F-12培地で2回丁寧に洗います。新鮮な成長培地を追加し、3日目まで摂氏37度と湿度95%と二酸化炭素5%で細胞を維持します。このプロトコルを用いて、一次培養ラット副腎細胞が得られた。3日目の副腎細胞を位相コントラスト顕微鏡で確認した。3日目培養で行った脂肪分化関連タンパク質の免疫蛍光染色は、細胞質内の小胞が脂質滴であることを確認した。ラット副腎細胞の副腎皮質刺激ホルモン刺激後、細胞のホルモン産生能はコルチコステロンアッセイによって決定され、より高いACTH濃度で

primary-culture-rat-adrenocortical-cells-assays-steroidogenic

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

副腎髄質クロマフィン細胞培養システムは、in...

マウス副腎髄質クロマフィン細胞分離

本稿では、成体ラットの心筋細胞を分離、培養に一般的な方法を説明した。コラゲナーゼとプロテアーゼは、単一の心筋細胞を消化して単離するために使用されています。心筋細胞は、ほとんどの実験の要件を満たすこのプロトコルに従って培養した。...

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