Name: 爬虫類から皮膚脂質の分離、定量、化学分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ爬虫類の皮膚脂質抽出・定量法。ヘキサン抽出、ロータリーエバポレーター濃縮、カラムクロマトグラフィー分画により、化学信号分子を分離・精製し、生態学的研究や侵入種管理への応用を可能にする。

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これらのメソッド、特に小屋皮膚脂質抽出の開発は、ジェームズ ・ マディソン大学 (作る) と米国農務省の動物の間の協力協定 (14-7412-1061-CA、15-7412-1155-CA、および 16-7412-1269-CA) 中に発生しましたおよび植物の健康点検サービス (APHIS)。M.R.P. 小屋肌メソッドの開発に次の学生の貢献を認め: s. パテル (ワシントン ・ アンド ・ リー大学 [WLU])、j. Zachry (WLU)、r. フローレス (作る)、j. ノル (作る)、s. アシュトン (作る)。

<ol><li>Mason, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+pheromones+in+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sex pheromones in snakes.</a> Science. 245 (4915), 290-292 (1989).</li>
<li>Mason, R. T., Parker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+behavior+and+pheromonal+communication+in+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%22%5BJournal%5D)">Social behavior and pheromonal communication in reptiles.</a> Journal of Comparative Physiology A. 196 (10), 729-749 (2010).</li>
<li>Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMart%C3%ADn%2C+J+%22Reproductive+Biology+and+Phylogeny+of+Lizards+and+Tuatara%22">Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara</a>. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. , CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).</li>
<li>Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+role+of+the+follicular+epidermal+gland+system+in+non-ophidian+squamates%5BTitle%5D)+AND+%22Amphibia-Reptilia%22%5BJournal%5D)">Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates.</a> Amphibia-Reptilia. 36 (3), 185-206 (2015).</li>
<li>Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+control+of+the+invasive+brown+treesnake%3A+potency+of+female+sexual+attractiveness+pheromone+varies+with+ovarian+state%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pest+Management%22%5BJournal%5D)">Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state.</a> International Journal of Pest Management. 59 (2), 141-149 (2013).</li>
<li>Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feminization+of+male+brown+treesnake+methyl+ketone+expression+via+steroid+hormone+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation.</a> Journal of Chemical Ecology. 44 (2), 189-197 (2018).</li>
<li>Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParker%2C+MR+%22Reproductive+Biology+and+Phylogeny+of+Snakes%22">Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes</a>. Sever, D., Aldridge, R. , CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).</li>
<li>Parker, M. R., Mason, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+dormancy+affects+the+quantity+and+quality+of+the+female+sexual+attractiveness+pheromone+in+red-sided+garter+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (10), 1234-1241 (2009).</li>
<li>Parker, M. R., Mason, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+sexy+snake%3A+estrogen+activation+of+female+sex+pheromone+in+male+red-sided+garter+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes.</a> Journal of Experimental Biology. 215 (5), 723-730 (2012).</li>
<li>Alberts, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constraints+on+the+design+of+chemical+communication+systems+in+terrestrial+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates.</a> American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).</li>
<li>Martín, J., Ortega, J., López, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpopulational+variations+in+sexual+chemical+signals+of+Iberian+wall+lizards+may+allow+maximizing+signal+efficiency+under+different+climatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0131492(2015).</li>
<li>Baeckens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+conditions+shape+the+chemical+signal+design+of+lizards%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards.</a> Functional Ecology. 32 (2), 566-580 (2018).</li>
<li>Greene, M. J., Mason, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+mediated+sexual+behavior+of+the+brown+tree+snake%2C+Boiga+irregularis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecoscience%22%5BJournal%5D)">Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis.</a> Ecoscience. 5 (3), 405-409 (1998).</li>
<li>Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMason%2C+RT+%22Snakes+and+Man%3A+Controlling+Pest+Species+for+Conservation+and+Human+Health%22">Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health</a>. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. , Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).</li>
<li>Pruett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+interactions+between+visual+and+chemical+signals%3A+chemosignals+compensate+for+the+loss+of+a+visual+signal+in+male+Sceloporus+lizards%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards.</a> Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1164-1174 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

爬虫類の皮膚脂質の抽出は、小屋の皮、このテクニックの実験用途の多様性を提供するだけでなく、生活や死者の皮膚に適用できます。さらに、幅広い生物学者2,13にメソッドの動的なアプリケーションを有効にする、フィールドで皮膚脂質の抽出を行うことができます。皮膚脂質の抽出は簡単です。したがって、抽出実験や設計のあたり、必要に応じて拡張する簡単だし、メソッドの実行に重要な専門知識が必要な実務家。スケール アップのための唯一の制限要因は、ヒューム フードの空席状況、きれいな、密閉式のガラス製品、溶剤ストレージ ・ スペースの豊富さです。
皮膚脂質抽出分画は研究者のニーズに合わせてすることができますそして、したがって、脂質の抽出する同じような柔軟性があります。たとえば、中性脂質を溶出し、関心の化合物の浄化、生物検定を簡素化したターゲット分数のため、破棄できます。分別は、複数の縮尺内および脂質のサンプル間で実行できます。たとえば、プロセスをより効率的に複数の列を同時に実行できます。または、総脂質抽出物の部分だけはしたがって、試薬および時間を倹約する小さい列に分別できます。分別は主に総脂質抽出物の質量と研究者に利用できる機器の精度によって制限されます。たとえば、質量、したがって研究者に 10.0 mg 精度、端数の決定とバランスがある場合ガスクロマトグラフィー質量分析のための試料の前処理の精度は大幅にいない場合は、完全に阻害します。ガラスの場合も同じです。研究者分別の大ボリューム列が分離する小さな総脂質質量場合、溶出したり、化合物の分離が進行するが、溶剤、試薬、時刻、および可能性のある、ターゲットの重要な消耗が必要になります自分自身を化合物します。
表 2で見られるように溶出スキームを決定する前に品質管理チェックを実行し、どのような分数を破棄可能性がありますを決定するをお勧めします。列必要な脂質の溶出を確認するには、ことができます実行各分画、1-15 が個別に収集され、分析され、使用する GC MS。図 3に代表的なガスクロマト トレースを見るとガーターヘビからメチル ケトンが特定の割合の列からのみ溶出します。この品質管理手順を実行すると、興味の化合物の最大収量を確保するため特定の種の変更された溶出スキームを開発できます。サプライヤーやアルミナのロットまたはジエチル エーテルの年齢など、材料の変更は品質管理テストの実行によっての制御されるべき溶出の違いで絶対になります。
説明した手法は、主に得ることができるキューの化学的性質によって制限されます。主に、これらのメソッドは、分離し、爬虫類の皮膚から長鎖脂質を分離する研究者をのみ許可します。爬虫類の多くの種、化学的な信号として空中やタンパク質の手がかりを使用して記述されているメソッドは当該合図を分離すると互換性がないです。さらに、無極性の溶媒が爬虫類の表面や豊富な化学信号を含めることができます確かにキュー沈着量 (例えばケージ水、糞便、水生基板) のソースから水性の手がかりを抽出できません。手がかりのこれらのタイプを取得するための適切な方法が (例えば固相固相マイクロ抽出 [SPME] 揮発性キューとキューの水性高性能液体クロマトグラフィー [高速液体クロマトグラフィー]) の研究者に利用できる方法のように上記で説明した、技術的な学習曲線があります。
最も重要なは、研究者に最終的な化学混合物の有用性は、使用方法を導くべきであります。例えば、研究者は、男性焦点動物男性対女性異性対象生物検定によって生成されるキューを区別できるかどうかを知りたいと、抽出は唯一の方法は、2、3を必要なです。ただし、抽出は特定の分子または分子による化学分析の1、グループ識別子を割り当てることで大きな自信を有効に浄化されるすべき場合、目的である性的に二形の化合物の同定 6,9,11。ただし、脂質ソース クロマトグラフィーを行うも、抽出を開始の重要な質量が必要、測定可能な割合の固まりを得ることができる;それ以外の場合、サンプルのプーリング追求できる、最適な14ではありません。
このプロトコルの将来の発展には活用しより爬虫類種の手順を適応するための措置が含まれます。皮膚の脂質を抽出追加非侵襲的方法も開発されています。

爬虫類は、表皮の皮膚細胞から直接、またはチームメイト評価と追跡、縄張り意識と内および種間の認識1,2 など、社会的なコミュニケーションで使用される個別の腺からの脂質を生成します。 ,3,4。これらの皮膚の脂質の分離に地球生命2,3 の進化における脂質の防水の役割を理解することに加えて、化学コミュニケーションの進化のパターンとメカニズムに焦点を当てた研究のユーティリティは、します。 ,4。さらに、多くの爬虫類、敏感な生態系に懸念の外来種であり、トラップと除去を向上させるフェロモン系ルアーの開発、継続的な5,6squamates (トカゲ, ヘビ)、特に。爬虫類皮の不浸透性脂質の化学的な信号の可能性がある強力な源の比較的純粋な抽出を取得するための抽出が容易になります。説明プロトコルで爬虫類の皮膚の脂質を定量化するための原則手順には、抽出、総脂質定量および列クロマトグラフィーによる分画1,6,7が含まれます。配偶者選択と選択、特にヘビ2についてはあまり説明生理活性物質の分離ようにメソッドを定期的に使用されています。
生きている肌、小屋の皮、または死んで全体爬虫類、非極性を使用してまたは極性有機溶媒1,7,8,9から皮膚脂質を抽出できます。それは、博物館の標本内のエタノールなどの溶剤が皮膚脂質の抽出のために最適ではない、唯一の新鮮なまたは冷凍新鮮な死体は、抽出のための可能な源として見なす必要があります注意してください。皮膚脂質いる不活性であり、安定した皮膚の表面と7を抽出しやすい。爬虫類生態学におけるシグナル伝達の役割で皮膚脂質手がかりがしばしば堆積する過酷な環境で、その堅牢な化学特性のためこのような手がかりは時間10,11の長期間にわたってその情報の価値を保持することが,12. 抽出プロセスは、-長い時間浸漬、脂質抽出7の測定可能な質量を残して、溶媒の蒸発が続く上 (例えばヘキサン、ベンゼン、トルエン) 無極性溶媒を用いた脂質を可溶性,8. 皮膚脂質が高い非極性溶媒に混和性と同様に多様なソースから幅広い炭化水素を抽出できます。
分別抽出よりもですが、特定の分数でカラム ・ クロマトグラフィ、化合物の精製と同定そこに1,を支援するために総脂質抽出を区切るために6,7,8. 総脂質抽出物、基板ベースの列にバインドされ、個々 溶出物 (「分数」) 特定のボリュームで溶剤共通がある脂質の混合物からの化合物セットを溶出する列順番に渡される極性6,7,8。脂質クロマトグラフィーにおけるいくつかの極性の分数進歩は無極性溶媒中の極性溶媒 (例えば、ジエチル エーテル) の相対量を増やすことでシーケンスを標準化 (通常パーセントとして表現される: 0%、2%、4% エーテル、など。)6,7,8。個別より混合物を集中すると互換性のあるメソッドは、薄層クロマトグラフィー (TLC) は、単純な混合物で脂質を分離する使用ことができますよう、カラム ・ クロマトグラフィはクローズド システムを使用するための優先は、制御することができます簡単です。効率化のため多重化。本稿では、爬虫類の肌脂質を抽出のいくつかの方法について説明し、従来のカラム ・ クロマトグラフィを使用して極性化合物の異なるセットを分離するための標準プロトコルを提供します。化学手掛かりの分離を含む多くの研究プロジェクトの究極の目標にこれらの手がかりにさらされる受信機に影響する変更です。全脂質を抽出または任意の生物学的活性を誘発化合物によってそこに1,2,6,7を決定する、特定の分数の生物検定で使用できます。たとえば、基礎生物学的研究で、フェロモンの精製されたソースが分離されているし、ターゲット化合物の同定方法を追求できる研究者に特定の分数を用いた生物検定が明らかに。野生動物管理の観点から識別の目的、ないかもしれないし、トラップに同種の誘致または外来生息地13,14の追跡の仲間を阻害するフィールドでの活性画分を使用できる代わりに。

<table><tbody><tr><td>パウダーフリークロロプレン手袋</td><td>Microflex</td><td>NEC-288</td><td>「1.1小屋抽出セットアップ」を参照してください(ステップ1.1.2「手袋」)</td></tr><tr><td>オーハウスアドベンチャー精密バランス</td><td>オーハウス</td><td>AX622</td>「<td>1.1小屋抽出セットアップ」を参照してください(ステップ1.1.3「バランス」)</td></tr><tr><td>フロイントコンテナボール16オンスメイソンジャー&蓋</td><td>ボール</td><td>NC9661590</td><td>「1.1シェッド抽出セットアップ」(ステップ1.1.5「メイソンジャー」)ヘ</td></tr><tr><td>キサン、異性体の混合物</td>シ<td>グマ・アルドリッチ</td><td>650544</td><td>「1.1シェッド抽出セットアップ」(ステップ1.1.6「ヘキサン」)を参照してくださいHi</td></tr><tr><td>/Lo書き込み温度テープ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>5029927</td><td>「1.1シェッド抽出セットアップ」(ステップ1.1.8「テープ」)を参照してください</td></tr><tr><td>シングルネック丸底フラスコ、容量500mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z414514</td><td>「2.抽出」(ステップ2.1.2.4「500mL」)</td></tr><tr><td>シングルネック丸底フラスコ、容量100mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z414492</td><td>「3.2分画」(ステップ3.2.4「100mL」)コル</td></tr><tr><td>クフラスコサポートリング</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z512419</td><td>「2.抜歯」(ステップ2.1.2.1「コルクサポートリング」)</td></tr><tr><td>Accu-jet Pro ピペットコントローラー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z671533</td><td>「2.抽出」(ステップ2.1.1.3「電動ピペットコントローラー」)</td></tr><tr><td>使い捨て個別包装ガラス血清ピペット、10mL</td>パイ<td>レックス</td><td>13-666-7E</td><td>「2.抽出」(ステップ2.1.1.3「10mLピペット」)</td></tr><tr><td>Rotavapor R II</td><td>Buchi</td><td>2422A0</td><td>「2.抽出」(ステップ2.1.2.1「ロータリーエバポレーター」)</td></tr><tr><td>楕円バンプトラップ</td>ケ<td>ムグラスライフサイエンス</td><td>501215241</td><td>「2.抽出」(ステップ2.1.2.1「バンプトラップ」)</td></tr><tr><td>7 mLバイアル、スクリュートップ、透明ガラス</td><td>Supelco</td><td>27151</td><td>「1.1 Shed Extraction setup-up」(ステップ1.1.11「7 mLバイアル」)7</td></tr> <tr><td>mLバイアルスクリューキャップ、PTFEライナー付きソリッドトップ</td><td>Supelco</td><td>27152</td><td>「1.1 Shed Extraction setup-up」(ステップ1.1.11「キャップ」)22</td></tr> <tr><td>mLバイアル、 スクリュートップ、透明ガラス</td><td>Supelco</td><td>27173</td><td>「1.1 Shed Extraction setup」(ステップ 1.1.11 「22 mL バイアル」)22</td></tr> <tr><td>mL バイアル スクリュー キャップ、ソリッド トップ、PTFEライナー付き</td><td>Supelco</td><td>27174-U</td><td>「1.1 Shed Extraction setup-up」(ステップ 1.1.11 「キャップ」)</td></tr><tr><td>Excellence XS Analytical Balance</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XS205DU</td><td>「2.抽出」(ステップ2.1.2.1「バランス」)</td></tr><tr><td>5 3/4インチ使い捨てガラスピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>NC0418555</td><td>「1.1シェッド抽出セットアップ」(ステップ1.1.11「ピペット」)</td></tr><tr><td>PTFEストップコックアセンブリ付きクロマトグラフィーカラム</td><td>Kimble-Chase</td><td>17810-19300</td>「<td>3.1カラムの準備」(ステップ3.1.1「小さなガラスカラム」)</td></tr><tr><td>鋳鉄製L字型ベースサポートスタンド</td><td>Fischerbrand</td><td>11474207</td><td>「3.1 コラムの準備」 (ステップ 3.1.1 「サポートスタンド」) を参照してください</td></tr> <tr><td>3 プロング デュアル アジャスト ニッケルメッキ亜鉛 クランプ</td><td>Troemner</td><td>2300203</td><td>「3.1 コラムの準備」 (ステップ 3.1.1 「クランプ」) を参照してください</td></tr> クランプ <tr><td>レギュラーホルダー</td><td>Fischerbrand</td><td>05754Q</td><td>「3.1 コラムの準備」 (ステップ 3.1.1 「クランプホルダー」) を参照してください</td></tr><tr><td>砂、洗浄および乾燥</td><td>マクロンファインケミカル</td><td>MK-7062-212</td><td>「3.1カラムの準備」(ステップ3.1.5「砂」)アルミ</td></tr><tr><td>ナ、中性</td><td>ソルブテック</td><td>15740-5</td><td>「3.1カラムの準備」(ステップ3.1.7「アルミナ」)を参照してください。 米国で唯一の既知のメーカー</td></tr><tr><td>ナローネックヘビーデューティーガラス 三角フラスコ、1000mL</td><td>パイレックス</td><td>4980-1L</td><td>「3.1 カラムの調製」を参照 (ステップ 3.1.6 「三角フラスコ」)</td></tr><tr><td>シングルネック丸底フラスコ、容量 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z100684</td><td>「3.1 カラムの準備」を参照 (ステップ 3.2.4 「250 mL 丸底フラスコ」)</td></tr>溶<tr><td>媒リザーバー付き校正済みクロマトグラフィーカラム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z560553</td><td>「3.2 カラムの準備」を参照 (ステップ 3.2.1 「大型ガラスカラム」))</td></tr><tr><td>エチルエーテル無水</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>E138500</td><td>「3.2分画」(ステップ3.2.5「エーテル」)アル</td></tr><tr><td>コノックスデターグネット</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>242985</td><td>「4.クリーニング」(ステップ4.2「アルコノックス」)</td></tr><tr><td>アセトン(ACS認証)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A18P-4</td><td>「4.クリーニング」(ステップ4.4「アセトン」)</td></tr></tbody></table>

爬虫類から皮膚脂質の分離、定量、化学分離

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

爬虫類仲間の追跡と評価を有効にするのには主に彼らの皮膚の脂質を用いた個体へ信号を送る。これらの脂質の分離では、地球生命の進化における脂質の防水の役割を理解することに加えて、化学コミュニケーションの進化のパターンとメカニズムに焦点を当てた研究ではユーティリティがあります。応用アプローチでこのような皮膚ベース手がかり野生生物の管理外来種への対処のための潜在的な使用があります。抽出、総脂質定量こと化合物精製溶出物の結果後者のプロセスを介してカラム ・ クロマトグラフィの分別などがここで提示されたプロトコルで爬虫類の肌脂質を定量化するための主な手順どちらかは化合物同定 (例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析法 [GC-MS]) を割り当てるために分析やより洗練された生物検定で直接使用可能です。皮膚の脂質は生活の皮膚から抽出することができます、無極性の有機溶剤 (例えばヘキサン、ベンゼン、トルエン) を使用して、皮膚、または死んで全体の動物を当てます。抽出の可溶性脂質、収量測定可能な脂質だけ抽出する溶媒を蒸発することができます。分別には、特定の波を介して伝統的なカラム ・ クロマトグラフィに総脂質抽出物の分離が含まれます。総脂質抽出物はまず基板ベースの列 (例えばアルミナ) 行き、個々 溶出物 (「分数」) 特定のボリュームで溶剤がの溶出が化合物脂質の混合物からのセットの列を順番に渡されます、一般的な極性に基づいています。非極性溶媒の極性溶媒 (例えば、ジエチル エーテル) の相対量を増やすことによって標準化されたシーケンスで極性の分数の進行状況。本稿では、爬虫類の肌脂質を抽出のいくつかの方法について説明し、従来のカラム ・ クロマトグラフィを使用して極性化合物の異なるセットを分離するための標準プロトコルを提供します。全脂質を抽出またはそこに化合物によって誘発される任意の生物学的活性を決定する、特定の分数の生物検定で使用できます。

次の抽出、総脂質質量がここで提示されたプロトコルを介して取得することができますデータの最初の型。ただし、総脂質質量値はいくつかの試みが得られた値を標準化することがなく決して分析する必要があります。いくつかのアプローチを使用することができます、しかし、どちらか抽出された脂質質量 (センチ) で動物の SVL または抽出された小屋の皮の固まりを標準化することをお勧めします。前者では脂質質量あたり長さの値、後者はソースの割合になります質量。標準化の理由は、彼らはよりトータル皮膚の表面積を持っているのでより大きい動物自然より多くの肌脂質を生成です。図 1 aの質量を持つ直線抽出皮膚脂質の質量スケールが抽出した肌を当てる、この協会を例示しています。合計小屋皮膚質量標準化、この線形関係は完全に削除されます (図 1 b)。
次の分別、留分 (図 2) の固まりと同じ標準化アプローチを使用できます。このサンプル データ セットに各分画はありませんを均等に抽出された脂質質量: 中性脂質 (分数 1-3) より極性脂質 (分数 4-6、7-9、10-12) の各セットと比較して質量の割合による化合物の支配的なセット。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59018/59018fig1.jpg"> 図 1: 間の関係抽出脂質質量と入力素材。(A) 爬虫類の合計小屋関係皮膚の質量と抽出された皮膚脂質質量は正の相関関係 (P 0.001 &lt;)。(B) とき抽出皮膚脂質質量の合計質量を流す標準化された (脂質小屋で割った質量質量)、この関係が存在しない (P = 0.46)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59018/59018fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59018/59018fig2.jpg"> 図 2: 次の溶出割合大衆を標準化します。カラム ・ クロマトグラフィを使用すると、皮膚脂質抽出物が化合物の極性に基づく分数に溶出することができます。分数質量、総脂質抽出物 (分数質量 [ミリグラム] で [ミリグラムで総脂質抽出物の質量で割った値) の比率で表されます、分数の間または実験の違いは、8をグループ化を決定します。バーは、手段を表します。最上位のエラーは、SEM;下部のエラーは、95% 信頼区間です。個々 のデータ ポイントは、わかりやすくするため提供されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59018/59018fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59018/59018fig3.jpg"> 図 3: メチル ケトン分数の代表的なガスクロマト グラフ。(A) 適切な溶出メチル ケトンテーブル 2から 7 画分で最も豊富な化合物、ピークの対句として見なすことができます (保存期間 = 24 34 分)。ただし、(B) 分画 6テーブル 2、のみ非標的化合物が得られます。これと同じ結果は、移動相の極性溶媒の期限が切れている場合、または列が長期間停止した場合に発生する可能性が (&gt; 1 h) 分数の間。2 つのトレース間の分子豊富の違いに注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59018/59018fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>分数</td>
			<td>ヘキサン (mL)</td>
			<td>ジエチル エーテル (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,2,3</td>
			<td>100 [30]</td>
			<td>0 [0]</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,5,6</td>
			<td>98 [29.4]</td>
			<td>2 [0.6]</td>
		</tr>
<tr>
<td>7,8,9</td>
			<td>96 [28.8]</td>
			<td>4 [1.2]</td>
		</tr>
<tr>
<td>10,11,12</td>
			<td>92 [27.6]</td>
			<td>8 [2.4]。</td>
		</tr>
<tr>
<td>13,14,15</td>
			<td>84 [25.2]</td>
			<td>16 [4.8]</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 皮膚脂質分画の標準的な溶出ボリューム。溶媒のボリュームと割合大ボリューム (例えば、250 mL) と [少量] (例えば、100 mL) ためにアルミナ (活動 III) を用いたクロマトグラフィ用カラムを与えられます。ヘキサンはキャリア溶媒;ジエチル エーテルは、モバイルのフェーズです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>分数</td>
			<td>ヘキサン (mL)</td>
			<td>ジエチル エーテル (mL)</td>
			<td>ノート</td>
		</tr>
<tr>
<td>1, 2, 3</td>
			<td>30</td>
			<td>0</td>
			<td>溶出します。収集しません</td>
		</tr>
<tr>
<td>4、5</td>
			<td>28.8</td>
			<td>1.2</td>
			<td>溶出します。収集しません</td>
		</tr>
<tr>
<td>6、7、8</td>
			<td>28.8</td>
			<td>1.2</td>
			<td>個別に収集します。メチル ケトンの大半質量割合 7; になります6 と 8、ケトンの適切な溶出を確保するために GC MS 品質管理チェックを実行します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: ガータースネーク メチル ケトンの変更された溶出スキーム。これらのボリュームは、使用少量のカラムと現在入手可能なアルミナのブランド。メチル ケトン陽性溶出画分は、求愛男性ガーターヘビ1、7野生のフィールド試金の強い生物活性。メチル経由でGC さん行い 1 mg/mL に希釈することができますターゲット分数、サンプル中のケトンの存在を確認するには、は、図 3は、正と負の結果を次の溶出の代表的なクロマト グラムを示します。

爬虫類、同種他個体から皮膚脂質は性的信号、外来種の管理で潜在的な使用のために重要であります。ここでは、小屋の皮または全体の動物から皮膚脂質の抽出のためのプロトコルについて述べる決定、総脂質量の分析とカラムクロマトグラフィーで分画を用いた脂質を分離します。

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

当社のプロトコルにより、研究者は化学通信で爬虫類が使用する生理活性シグナル伝達分子を分離することができます。追加のテスト、あるいは同定のためにこれらの化合物の分離および精製と同様。この方法を使用すると、研究者は化学信号の供給源を取得し、それらを抽出して定量化またはバイオアッセイを単独で使用することができます。今日の手順を実証するのは、私の研究室の優等研究生であるホリー・ラッカーです。5センチメートルの正方形の部分をヘキサン互換の蓋付きの密封可能なガラス容器に入れ、容器を密封する前に小屋の皮片を完全に水没させるのに十分なヘキサンを容器に加えることによって始めます。翌日、きれいな金属鉗子を使用して小屋の破片を取り除き、容器内の残りのヘキサンを保持するために捕獲された破片を振ります。抽出した脂質を測定するために抽出物を予め計量し、底フラスコを丸くし、真空源をロータリーエバポレーターに回し、真空圧が凝縮器の首にフラスコを保持するのに十分であることを確認する。コンデンサーの端にある通気孔を開き、フラスコをコンデンサーの首にスライドさせ、ベントを閉じてシステムを密封します。フラスコが解放されたときにフラスコが凝縮器から切り離すことができないことを確認した後。フラスコの底部10%だけが浴中の水に触れるまでフラスコを下げ、中速で回転を開始します。真空、速度、凝縮器流れ、および浴温度が最適である場合、フラスコを離れる溶媒蒸気はコイルに凝縮し、回収フラスコに滴り落ちます。直径1センチ未満の液体ビーズがフラスコの底に見えるまで、真空下でサンプルを蒸発させます。その後、回転と真空をオフにし、お風呂からフラスコを上げます。真空シールが解放されるとフラスコの首を持ち、コンデンサーからフラスコを横に向けます。抽出液中のビーズは、ヘキサンが蒸発するにつれて固化する。ビーズが室温で5分程度乾燥した後、脂質はフラスコに半透明の白色から黄色のワックスを形成する。フラスコを秤量して最終的な質量を得て、ヘキサンの記録された体積の脂質を可溶化し、ヘキサンの1ミリリットル当たり1ミリグラム以上の脂質を得る。クロマトグラフィーカラムを作成するには、木製のダボロッドを使用し、柱よりも長く、ガラスクロマトグラフィーカラムの下部に折りたたまれたグラスグラスの4〜4センチメートルの正方形を配置します。ヒュームフードのカラムを標準のリングスタンドに固定し、ストップコックを開きます。次に、約3センチメートルの砂がグラスファイバーの上に置かれるまで、洗浄して乾燥した砂をカラムに注ぎます。次に、暗い紙を列の下に置き、軽くタップします。さて、柱の下に500ミリリットルのビーカーを置き、約25ミリリットルのヘキサンでゆっくりと砂を濡らし、砂の上に約0.5センチメートルのヘキサンがある場合にストップコックを閉じます。中性のイルミナを活性化するために、ピペットは、イルミナ全体の滴で6%のイルミナ質量に等しい体積の水を脱イオン化した。そして活性化されたイルミナのフラスコを覆い、電荷を均等に分散させる溶液を激しく渦巻く。目に見えるイルミナの塊が残っていない場合は、イルミナが約0.5センチメートルのヘキサンで完全に覆われるまでヘキサンを加えます。フラスコを旋回してスラリーを形成し、柱の下に新しい500ミリリットルのガラスビーカーを置きます。ストップコックを開き、再びイルミナを渦巻き、柱の貯水池に保持されている通気漏斗にイルミナを着実に注ぐ前に、イルミナが柱の中に均等に落ち着き、大きな泡や亀裂が形成されないように注意してください。このカラムは、イルミナの上部が安定し、貯水池の底部にある柱の首より約4センチメートル下に形成されます。次に、ピペットを使用して残留照度のためにヘキサンで貯水池の内部をすすい、ミルミナの上に2番目の砂の層を穏やかに加えて、貯水池の約1センチメートル下に加えます。脂質抽出物の分画については、長いガラスピペットを使用して脂質サンプルをカラムに移し、ゆっくりとピペット抽出液をピペットして砂の層を乱さないようにします。抽出物を5ミリリットルのヘキサンですすいで、洗浄物をカラムに移します。すべての抽出物が追加されたら、ストップコックを開き、サンプルを列にロードします。サンプルを加えたら、カラムは溶媒で飽和状態を保たなければなりません。カラムが枯渇すると、サンプルは失われます。最初の分数を収集するために、事前に計量され、ラベル付けされた丸い底フラスコを柱の下に置きます。そして、ベントガラス漏斗を使用して、砂の層を乱さないように貯水池の側面に100%ヘキサンを注ぎます。次に、ストップコックを開けて溶出を開始し、約3ミリリットルのヘキサンが列の上部の砂の上に残っているときにストップコックを閉じます。大きな動物は、その大きな皮膚表面積のために自然により多くの皮膚脂質を産生するので、抽出された脂質質量を動物のスナッストベント長に標準化することが重要である。一旦全流皮膚質量に標準化されると、抽出された皮膚の質量と抽出された皮膚の質量との抽出された皮膚脂質塊の直線的な関係が完全に除去される。分別後、同じ標準化アプローチを個々の分数の質量と共に使用できます。例えば、ここで各画分は、抽出された脂質質量の総量に等しく寄与しておらず、中性脂質が質量割合で化合物の支配的な集合となるように、より多くの極性脂質の各セットと比較する。化合物の同定が最終的な目標である場合は、クリーンなガラス製品を使用し、サンプルの汚染を防ぐためにプラスチックを避ける必要があります。化合物同定のために、液体またはガスクロマトグラフィー、質量分析と結合して、サンプルが収集された後に追求することができる。あるいは、バイオアッセイを行って、サンプルの生物活性を解明することができる。

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Research

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環境

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学ぶ爬虫類の皮膚脂質抽出・定量法。ヘキサン抽出、ロータリーエバポレーター濃縮、カラムクロマトグラフィー分画により、化学信号分子を分離・精製し、生態学的研究や侵入種管理への応用を可能にする。

爬虫類から皮膚脂質の分離、定量、化学分離

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