Name: 高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶU937細胞の細胞質・ミトコンドリア・細胞膜の分別法。高速遠心分離を用いず、免疫ブロッティングによるタンパク質局在解析が可能な、細胞生物学研究に有用な手法です。

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仕事に NIH-1R15HL135675-01 ティモシー j. ラロッカに支えられ

1. バッファーおよび試薬
注: は、テーブル 1を参照してください。
<ol><li>バッファー A、B の換散バッファー、サンプル バッファーおよびジギトニンのソリューションを準備します。<ol>
<li>バッファー A を準備するには、NaCl の 8.77 g と 900 mL の脱イオン水 50 mL HEPES (1 M、pH 7.4) の調整を脱イオン水 1 L に最終巻を追加します。 注: 最終濃度は、150 mM の NaCl と 50 mM HEPES。</li>
		<li>換散バッファー B を準備するには、追加の HEPES (1 M、pH 7.4) の 20 mL KCl、MgCl2、エチレンジアミン四酢酸 (0.5 M の EDTA)、2 mL の 0.19 g の 0.75 g 2 mL エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N'、N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸 0.5 M)、38.26 g マンニトールと 900 mL の脱イオン水にショ糖 23.96 g 調整脱イオン水で 1 L に最終巻。 メモ: 最終的な濃度は、20 mM HEPES、10 mM KCl、MgCl22 mM、1 mM EDTA、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、210 mM マンニトール 70 mM ショ糖です。</li>
		<li>最終濃度 0.1 %sds のドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 0.01 g を追加することによって含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 10 mL にサンプル バッファーを準備します。</li>
		<li>ジギトニンの 25 mg を 100 mL の脱イオン水 (最終濃度は 250 μ g/mL) に追加することによってジギトニンの原液を準備します。</li>
		<li>試験開始まで 4 ° C ですべての緩衝溶液と-20 ° C でジギトニンを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞に添加する前にバッファー ソリューションに追加するホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤の新鮮なソリューションを準備します。<ol>
<li>100% エタノール 1 mL に 17.4 mg PMSF を追加することによって phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) の原液を準備 (最終濃度は 100 mM)。 注意: は、PMSF を処理するとき、適切な保護具と注意を着用します。PMSF は摂取した場合危険物や皮膚への接触 (刺激)、アイ ・ コンタクト (刺激) や吸入; の場合少し危険目と皮膚に腐食性です。</li>
		<li>製造元の指示に従って市販プロテアーゼ阻害剤カクテル (100 ×) を準備 (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>SOV の 92 mg を 1 mL の脱イオン水 (最終濃度は 500 mM) に追加することによってナトリウム バナジン (SOV) の原液を準備します。 注意: 適切な保護具を着用し、処理するときに注意を使用します。SOV はアイ ・ コンタクト (刺激)、摂取または吸入の場合危険です。深刻な露出過度は、死に至ることができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PBS 洗浄
<ol><li>集中し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 分別前の細胞を洗ってください。<ol>
<li>ペレットを作成する適切な速度で細胞を懸濁液を遠心します。たとえば、400 × g 10 分間で U937 細胞の懸濁液を遠心分離機します。</li>
		<li>上澄みを除去、4 × 106セル/mL と塊を破るに優しくピペットの最終濃度で室温 PBS で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>400 × g細胞のペレットを 10 分間で細胞懸濁液を遠心します。</li>
		<li>上澄みを除去し、, 最終濃度 2 × 107セル/mL の氷冷バッファー A で細胞ペレットを再懸濁します。 注: これ以降の手順4 ° Cで行われるべきまたは氷とすべてのバッファーの前の冷蔵をする必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ゾル性細胞質蛋白質の隔離
<ol><li>洗剤ジギトニンと孵化によって細胞質蛋白質を抽出します。<ol>
<li>直前のセル (ステップ 3.1.3) の株式 PMSF (100 mM)、プロテアーゼ阻害剤の 10 μ L の 10 μ L を追加 (100 ×)、2 μ L 在庫 SOV (500 mM) のバッファー A の 878 μ L にストック ジギトニン (250 μ g/mL) の 100 μ L (最終濃度 1 mM PMSF は、、1 × 1 mM SOV と 25 μ G/ml ジギトニン; プロテアーゼ阻害剤使用されているセルの数に従って最終的な音量を調整)。細胞ペレットに加えまで氷の上のソリューションを保持します。</li>
		<li>400 × g 10 分間に細胞懸濁液を遠心分離し、上清を削除します。</li>
		<li>阻害剤と 2 × 107セル/mL、塊を破るに優しくピペットの最終的な集中でジギトニン (3.1.1 の手順で準備) を含むバッファー A 溶液中の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>4 ° C、20 分でエンド オーバー エンド回転子に細胞懸濁液を孵化させなさい。</li>
		<li>上澄み 400 × gで 10 分間収集に細胞懸濁液を遠心分離し、きれいな遠心管。</li>
		<li>細胞デブリに 20 分間、18,000 × gで収集した上清を遠心します。</li>
		<li>きれいな遠心チューブに上清を転送します。</li>
		<li>3.1.5 と 3.1.6 の手順を繰り返して、遠心分離後餌が得られない。</li>
		<li>ゾル性細胞質蛋白質を含む上清を収集して保存する (短期) の 4 ° C または-20 ° C (長期)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離によって過剰ジギトニンとゾル性細胞質蛋白質を削除します。<ol>
<li>4 × 106セル/mL と塊を破るに優しくピペットの最終濃度バッファー A に (ステップ 3.1.5) からジギトニン グリセリン細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>400 × g 10 分間ジギトニン グリセリン細胞懸濁液を遠心分離し、上清を削除します。 注: 余分なゾル性細胞質の汚染物質を除去するバッファー A に繰り返し洗浄を実行できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. セルの均質化
<ol><li>細胞換散バッファー B に氷の上をインキュベートし、機械的手段によってそれらを溶解します。<ol>
<li>直前のセル (ステップ 4.1.2) の換散バッファー B 988 μ に株式 PMSF (100 mM) の 10 μ L と株式 SOV (500 mM) の 2 μ L を追加 (最終濃度 1 mM PMSF、1 mM SOV; 分離されているセルの数を合わせて最終的な音量を調整) し、ラブ細胞ペレットに加えまで氷のグローバリゼ-ション。</li>
		<li>4 × 106セル/mL の最終的な集中で PMSF と SOV (4.1.1 の手順で準備) を含む氷冷換散バッファー B 溶液中 (からステップ 3.2.2) 細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>30 分間氷の上細胞懸濁液を孵化させなさい。</li>
		<li>氷の上 (とタイトなフィッティング B 杵) 中古冷蔵 Dounce ホモジナイザーに細胞懸濁液を転送し、遅いもストロークを使用してホモジナイザー杵と 40 パスを実行します。 注: またディスカッション セクションで詳細として機械セル換散の他の手段を利用します。</li>
		<li>磨砕液を収集し、きれいな遠心管にそれを転送します。</li>
		<li>ホモジナイザー杵と少量 (1 ~ 2 mL) 換散バッファー B の管を洗って、磨砕液を追加します。</li>
		<li>10 分間 400 × g (または餌の切れ目のない細胞に必要な最小速度) でホモジネートを遠心します。</li>
		<li>きれいな遠心チューブに上清を転送します。 注: 重要な餌まま手順として分数の収穫を増加する 4.1.6 を通じて 4.1.4 の場合ディスカッション セクションで詳しく説明します。プロトコルをここでは、一時停止できるし、磨砕液は短期 (24 h) の 4 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 差動遠心分離
<ol><li>細胞の残骸、分離ミトコンドリア膜の一部分を削除する速度を増加させる、ホモジネートを遠心します。<ol>
<li>上清を 500 × g 10 分転送上澄みで (ステップ 4.1.8) からきれいな遠心チューブを遠心分離し、ペレットを破棄します。</li>
		<li>きれいな遠心チューブに上清 (ステップ 5.1.1) から 1,000 × gで 10 分間転送で上清を遠心し、ペレットを破棄します。</li>
		<li>上清を 2,000 × gで 10 分間転送上澄みで (ステップ 5.1.2) からきれいな遠心チューブを遠心分離し、ペレットを破棄します。</li>
		<li>遠心上清を 4,000 × gで 15 分転送上澄みで (ステップ 5.1.3) からきれいな遠心管、ミトコンドリアを含む維持ペレット。</li>
		<li>B. の換散バッファーの少量 (0.5\u20121 mL) でミトコンドリアのペレットを再懸濁します</li>
		<li>4,000 × gで 15 分間削除で中断されたペレットを遠心上清と再懸濁します、ミトコンドリアのサンプル バッファー (例えば250 を 500 μ L、ペレットのサイズによって異なり、必要な目的の最終巻のペレット濃度)。</li>
		<li>15 分間遠心する (ステップ 5.1.4) から 4,000 × gで上清は、きれいな遠心管に上清を転送します。この手順を繰り返して、遠心分離後餌が得られない。</li>
		<li>3 時間 18,000 × gで上清をスピンします。</li>
		<li>膜蛋白質を含んでいるペレットをして、上清を除去します。少量で膜ペレットを再懸濁します (0.5 – 1 mL) の換散バッファー b.</li>
		<li>1 時間 18,000 × gで中断されたペレットを遠心します。</li>
		<li>上澄みを除去し、サンプル バッファー (250 を 500 μ L、ペレットと望ましい集中のサイズによって) の必要な最終巻で膜ペレットを再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 サンプル ペレットを超音波照射 5 のパワー設定で氷浴で s (20 kHz で 125 W の最大電力の 50% は、材料表を参照してください)。</li>
	<li>(短期) の 4 ° C または-20 ° C (長期) のサンプルを格納します。</li>
	<li>セルの細胞質やミトコンドリア膜コンパートメント内で見つかったタンパク質マーカーに対する抗体を用いたウエスタンブロットを実行することによって分別の純度のためのサンプルを調べる (代表的な結果を参照してください)。</li>
</ol>

<ol><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Hwang, S. II, Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers%3A+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li>
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<li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum%2C+Mitochondria%2C+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).</li>
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<li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55(2018).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenization+of+Mammalian+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

このプロトコルの開発は、ミトコンドリアを分離することができないと膜サンプル、市販キットを用いたネクロトーシス14中タンパク質の局在の解析から生まれた。既成のキットの主な制限は、サンプルとサンプルを処理することの限られた数、単価、各研究者のニーズに適応する無力です。ここで紹介した方法は、高価な試薬を使用せず、高価な機器の必要性なしに実行できます。このメソッドは、任意の数のセルに対応することができ、研究者のニーズに合わせて変更することが可能です。これにより、メソッドの実行で増加する各画分の収量、行われている研究の手順の仕立てと柔軟性。研究者は、最終的な試料中のタンパク質のリン酸化状態を検査していません場合ナトリウム バナジン バッファーの追加は省略できます。SDS の最後のバッファーに含めることは、研究者がさらに密度勾配遠心によるサンプルを浄化する場合に同様に省略できます。正常に非付着性単球細胞株 U937 細胞を分画するこのメソッドのみ使用しておりプロシージャは複数の細胞や組織、軽微な変更で動作するはず。細胞懸濁液の成長は、U937 細胞付着性のセルラインにこのプロトコルを...

蛋白質のローカリゼーションの確実な同定は、真核細胞の分子経路を調べてみる必要があります。内分を取得する方法は、興味の細胞成分を調べる研究者によって活用されます。
既存のセル分別方法の大半は一般に洗剤ベース1,2および遠心ベース3,4、5、することができます 2 つの広範なカテゴリに分類します。スピード ・精度・ コストによって区別されます。洗剤ベース プロトコルはセルの異なるコンポーネントを可溶化する洗剤の高強度化をバッファーの使用に頼る。これはサンプルを処理するための迅速かつ便利な方法で、数とサンプルのサイズが小さい場合は費用対効果にすることができます。細胞質膜/オルガネラ (混合割合)、細胞から核分画を分離するため洗剤ベース キットを購入できます。しかし、これらのキットに関連付けられているいくつかの欠点は、研究者への有用性を制限します。彼らは、簡単にセルの 1 つまたは 2 つのコンポーネントを分離するために設計されていますが、同時にサンプルからすべての画分を分離することができません。洗剤の使用を意味する血しょう膜、膜で囲まれた細胞内小器官が均等に溶こと、したがって、お互いから分離することができません。その他の合併症は、これらのキットは研究者が特定のアプリケーションのための条件を変更するを防止する独自のコンポーネントから発生します。最後に、彼らは、使用回数に制限が、非常に大きい実大施工実験高価かもしれません。非洗剤ベース キットは、ミトコンドリアの分離、膜を分離する設計されていませんし、サンプルの利回りは大幅密度遠心分離からのそれより小さいベース分離のプロトコル6,7.
分画遠心を利用する方法はより時間がかかるが、しばしば洗剤ベース キットよりも純粋な分数の結果。最初可 (膜小器官による汚染の結果) それらのない細胞から膜を分離するには、必要があります細胞コンポーネントを介して差動の分離に続いて非洗剤法による分離遠心分離、膜分離を達成する 100,000 × gの速度を必要とします。多くの場合、差動遠心分離細胞一部分または汚染物質の除去のさらに分離のための密度密度勾配遠心による従わなければなりません。これらのメソッドは、徹底的に、変更可能なコスト、時間消費、および分数とさらに浄化経由で密度勾配遠心分離用超遠心機の必要性の欠点が含まれます。ほとんど高速遠心分離機は、個々 の調査官とはしばしば共有、教育機関の機器のコアは、法外なコストです。したがって、超遠心機可用性はこのような状況で禁止になります。
この分別のプロトコルでは、内分可洗剤を使用せず、高速遠心分離なしの分離を示しています。このメソッドは、細胞膜、ミトコンドリアと分数の間の雑菌と真核細胞の細胞質成分を隔離して研究者になります。

<table><tbody><tr><td>細胞質抽出用</td><td>ジジトニン</td><td>TCIケミカル</td><td>ズD0540</td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M4125</td>溶解<td>バッファー用B</td></tr><tr><td>オンスホモジナイ</td><td>ザーVWR</td><td>22877-282</td> ホ<td>モジナイ</td>ザー</tr>用<tr><td>エンドオーバーエンドローテーター</td><td>バーンステッド</td><td>N / A</td>細胞<td>質抽出用</td></tr><tr><td>エチレングリコールビス(&beta;-アミノエチルエーテル)-N,N,N'、N'-四酢酸 (EGTA)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>J61721</td><td>溶解バッファー B</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>溶解バッファー B</td></tr><tr><td>GAPDH (14C10)</td> <td>Cell Signalling Technologies</td><td>2118</td><td>ウェスタンブロット上の細胞質画分の検出、dilution: 1:10000</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848</td><td>溶解バッファー A および B 用</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>溶解バッファー B</td></tr><tr><td>MgCl2</sub</td><td>>Alfa Aesar</td><td>12315</td><td>溶解バッファー B</td></tr><tr><td>Na、K-ATPase a1 (D4Y7E)</td> <td>Cell Signalling Technologies</td><td>23565</td><td>ウェスタンブロット上の原形質膜画分の検出、dilution: 1:1000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>溶解バッファー A 用</td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)</td><td>VWR</td><td>M145</td><td>細胞質抽出および均質化</td></tr><tr><td>バッファープローブ超音波処理機</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td>最終サンプル用</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル、一般用途</td><td>VWR</td><td>M221-1ML</td><td>細胞質抽出用</td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>VWR</td><td>227</td><td>サンプルバッファー用</td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム (SOV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450243</td><td>溶解バッファー A および B</td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>溶解バッファー B</td></tr><tr><td>トリスバッファー生理食塩水 (TBS)</td> <td>VWR</td><td>788</td><td>サンプルバッファー</td></tr><tr><td>用 VDAC (D73D12)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>4661</td><td>ウェスタンブロット上のミトコンドリア画分の検出、dilution: 1:1000</td></tr></tbody></table>

高速遠心分離のない状態で u937 細胞のセル分別

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

このプロトコル細胞遠心や無差別な洗剤を使用せず U937 細胞画分を取得する方法を詳しく説明します。このメソッドは、細胞質、ミトコンドリア、細胞膜を分離する差動遠心分離機械換散、ジギトニン低張性バッファーを利用します。プロセスは、研究者のニーズに対応することができます、安価で簡単です。このメソッドは、セル特殊な遠心分離機とどちらが極端に高くなることができる市販のキットの使用なしで蛋白質のローカリゼーションを決定する研究者になります。このゾル性細胞質の分離方法、細胞膜、ミトコンドリア蛋白質は、正常にひと単球細胞 u937 で利用させていただきました。

未分化 U937 細胞懸濁液で栽培の成功の分別は、上記の詳細し、図 1に示したプロトコルを使用して達成されました。この方法で得られた試料は、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に濡れた転送法を用いた西部しみが付く9に服従しました。膜はその後に対する抗体をプローブ細胞質、ミトコンドリア膜局在蛋白質のマーカー (図 2図 3図 4) とします。細胞質蛋白質を正しく抽出は、通常細胞の細胞質に局在ゾル性細胞質蛋白質のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ10 (GAPDH) に対する抗体としみを調査によって確認できます。(図 2; 下...

ここでは、細胞膜、細胞質、高速遠心分離を使用せず U937 細胞のミトコンドリアを分離するためのプロトコルを提案する.この手法は、蛋白質のローカリゼーションを介して免疫ブロットの後続受験内分を浄化するために使用できます。

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

このプロトコルは、専門の装置、高価な試薬や複雑な技術を使用せずに細胞の明確な分画を得ることができます。このプロトコルの主な利点は、変更可能で実行しやすい手法のシンプルさです。手順を実証するには、マット・デラゴン、ロブ・ハルスカ、アレクサ・ホッジスです。ペレットを作成するために調製した細胞懸濁液を遠心分離を開始する。上清を取り除き、室温PBSでペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を400xgで10分間遠心分離する。その後、上清を取り除き、氷の冷たい緩衝液中の細胞ペレットを再中断します。バッファを準備する テキスト プロトコルに従ってソリューションを準備します。細胞懸濁液を400 xgで10分間遠心し、上清を取り除く。バッファー内のペレットを再中断する溶液は、1ml当たり2億個の細胞の最終濃度に溶液し、ピペットを穏やかに分解して塊を分解する。この後、4でエンドオーバー回転器のエンド上の細胞懸濁液をインキュベート

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、白血病細胞から細胞内画分と核分画を生成する方法である白血病細胞からの細胞内画分の調製について説明しています。核画分と細胞質画分は、さらに下流の分析に使用できます。...

白血病細胞からの細胞内画分の調製:白血病細胞から細胞画分および核画分を生成する方法

このビデオでは、コラゲナーゼEを用いた酵素消化とシリカベースの密度分離培地勾配分離によるマウスの結腸組織からの固有層単核細胞の単離を実演します。単離された単核細胞は、その後の下流分析に使用できます。...

Lamina propria単核細胞単離:マウス結腸から単核細胞を得るためのシリカベースの密度勾配遠心分離技術

このビデオは、機械的解離と酵素消化を使用して、マウスの脳から腫瘍浸潤末梢血単核細胞を分離する方法を示しています。これに続いて、密度勾配遠心分離を行い、免疫細胞を採取してさらに分析します。...

マウスの脳からの腫瘍浸潤免疫細胞の単離

このプロトコルは、さまざまな正常および悪性のヒト組織に存在するCD45+細胞（リンパ球/白血球）の定性的および定量的評価のための新鮮なヒト組織断片の迅速な非酵素的解離を説明しています。さらに、一次組織ホモジネートから得られた上清を回収し、さらなる分析や実験のために保存することができます。...

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

初期の脳の腫瘍微小環境を入力する免疫細胞の数および活性化状態に対する時間依存の定量的データをもたらす神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析のための簡単​​な方法は、ここに提示しました。...

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

このプロトコルでは、異なる細胞周期の段階に主な急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する遠心浄化の使用について説明します。...

遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

このプロトコルは、原発性慢性リンパ球性白血病細胞からの核および細胞質画分の最適化およびその後の効率的な生成を可能にする。これらのサンプルは、タンパク質の局在化と、細胞刺激および薬物治療時に核と細胞質区画の間で起こるタンパク質の密売の変化を決定するために使用されます。...

核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画

この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。...

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

この研究は、単離された脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いた全体的なヒストン修飾の定量化のためのプロトコルについて説明しています。この研究には、データ収集に使用されたミクログリア分離プロトコルも含まれています。...

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

学ぶU937細胞の細胞質・ミトコンドリア・細胞膜の分別法。高速遠心分離を用いず、免疫ブロッティングによるタンパク質局在解析が可能な、細胞生物学研究に有用な手法です。

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

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