Name: 高スループットの改善された呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 微量中和試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶ高スループットのイメージングベース微量中和試験法で、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）に対する中和抗体価を正確に測定します。A549細胞を用い、再現性が高く低コストで世界中の研究室で実施可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、関与するすべての参加者をありがとうございます。我々 は、ビクトリア朝の政府の運用インフラストラクチャ サポート プログラムを認めます。PVL は、NHMRC キャリア開発フェローシップ受領者です。

注:すべての手順は、異なる記載がない限り BSL2 フードで行います。ウイルスの滴定は、PRN アッセイ PRN 試金で使用される最適の RSV の濃度を決定する前に必要です。一度解凍および各民放連試金のために使用される少量のウイルス株の約数を勧めします。1 つの研究からのすべてのサンプルの実行すべての民放連試金のため同じウイルス株を使用することをもお勧めします。文化メディアとリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) はセル板を追加する前に 37 ° C に温めていることを確認します。
1. RSV ウイルス滴定
注:ウイルス株の数は、重複の数によっては、図 1によると、アッセイ プレート設定できます。各ウイルス株は、最高のウイルス濃度 (すなわち、1:10) から始まるアッセイ プレートを 3 通で滴定する必要があります。シリアルの滴定が通常することができます 1:10。RSV 文化プロシージャと同様、A549 細胞培養およびメンテナンスを行う標準的な手順を使用して、このプロトコルには含まれません。
<ol><li>播種板 (日 1)
	<ol>
<li>ダルベッコ イーグルスの変更培地 (DMEM) + 10% 牛胎児血清 (FCS) + 4 × 105/mL で 1000 IU ペニシリン/ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌) A549 細胞を再懸濁します。シード 96年ウェル平底滅菌板 100 μ L/ウェル 4 × 104 A459 細胞を含みます。</li>
		<li>一晩で 37 ° C、5% CO2版を孵化させなさい (ログ相成長でセルになります)。 注:23 通路の後新しい A549 細胞バイアルを使用します。新しい細胞のバイアルは、最初の 3 つの通路にまだ場合に、実験開始しなかったりそれ勧めします。</li>
	</ol></li>
	<li>ウイルス感染 (日 2)
	<ol>
<li>ウイルス シリアル希釈の準備<ol>
<li>37 ° C の水浴ほぼ完全に解凍し、すぐに氷の場所までに RSV の単一凍結バイアルを急速に解凍します。準備 3 複製各 RSV ウイルス ストック試金するし、1:10 の最初のウイルス ストック希釈を使用し 100 μ L 希釈ウイルス/ウェルの負の制御のための少なくとも 1 つの列をぜひご予約ください。 注:図 1は、トリプリケートでネガティブ コントロールを示します。</li>
			<li>1:10 96 ウェルの U 底の行 A の 3 通で希薄化後の各ウイルスの 100 μ L を追加滅菌プレート。H 行 B に DMEM + 1000 IU ペン/連鎖球菌 FCS なしの 90 μ L/ウェルを追加します。</li>
			<li>シリアル 1:10 を行う希釈下行行の上下に 5 回ピペッティング コンテンツによって B. ミックス ソリューションとそれぞれの最終的なボリュームは 90 μ L をよくされる行 H. 廃棄最終 10 μ L まで 10 倍希釈を続けるから 10 μ L を転送することによってプレート。 注:それぞれの希釈のための新しいヒントを使用することが重要です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
A549 細胞へのウイルス接種
		<ol>
<li>A549 cell plate(s) 前の日に準備を取得します。A549 細胞膜 96 ウェルのプレートの合流 ~ 80% であることを確認します。プレートを軽く反転と軽く滅菌吸水紙タオルの上にしみが付くことによってメディアを破棄します。</li>
			<li>すべての井戸を PBS 100 μ l を 2 回洗って、プレートを軽く反転して軽く各洗浄後滅菌吸水紙タオルの上にしみが付く過剰 PBS を破棄します。プレートを乾燥させるようにしてください。</li>
			<li>ウイルス滴プレート (図 1) からウイルスの希釈を転送すると、A549 細胞の版に対応する井戸。37 ° C、5% CO2で 1 h のプレートを孵化させなさい。1 時間培養後 (交差汚染を避けるため) にピペットを使用して上清をデカントします。90 μ L/ウェルを取り出します。</li>
			<li>1 x 中 199 の 100 μ L を追加 (M199、材料表を参照してください) + 1.5% カルボキシメチル セルロース ナトリウム (CMC) 低粘度 + 2% の FCS を各ウェルにペン/連鎖球菌を含みます。 注: 2 x M199 + 4% の FCS + 2% ペン/連鎖球菌と 3 %cmc は、事前に準備し、将来の使用のための 4 ° C で保存する必要があります。ソリューションは 37 ° C でプレートを追加する前にウォーム アップされていることを確認します。<ol>
<li>2 x M199 ソリューションを準備: 1 袋/500 mL 蒸留水 20 mL FCS + 10 mL ペン/連鎖球菌 (2 を構成する x MI99)。0.22 μ m のフィルター ユニットを使用して、ソリューションをフィルター処理します。</li>
				<li>3 の準備のため %cmc、蒸留水 500 mL をゆっくりと CMC の 15 g を追加。50 ° c で、準備の約 1 時間を取る金属撹拌機ヒーターを使うことで水の CMC を溶かします。ミックスに 3 %cmc とオートクレーブ ソリューション。 注:解消するために水に固体の CMC を追加する必要があります。乾燥した固形に水を加えて溶解し非常ににくい固体の「塊」が生成されます。</li>
				<li>M199 + 1.5 %cmc 低粘度 × 1 を準備 + ペン/連鎖球菌の混合で 1:1 を含む 2% の FCS M199 と 3% × 2 CMC 1.2.2.4.2 の手順で準備します。</li>
			</ol>
</li>
			<li>プレートを 37 ° C、5% CO2で 3 日間インキュベートします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>アッセイ プレートと分析 (日 5) の開発
	<ol>
<li>固定と発展途上のアッセイ プレート<ol>
<li>プレートを軽く反転 M199 + CMC + 2 %fcs 含むペン/連鎖球菌を破棄します。ゆっくりと追加 (避けるために細胞層を乱す) 200 μ L 固定バッファー (80% アセトン、20 %pbs、-20 ° C で保存) のセルを修正します。-20 ° c 20 分間インキュベートします。</li>
			<li>固定バッファーを破棄し、優しく吸収紙タオルの上にしみ。プレートの顔を残してまで 10 分間乾燥させます。 注:このステップから BSL2 フード外分析を実行できます。</li>
			<li>準備 5% 牛乳希釈ブロッキング液 0.05% を含むフィルター選択された PBS のポリソルベート 20 (PBS ポリソルベート、材料表を参照してください)。1 つのプレートの計算に基づいてブロック/200 と 110 の井戸のために必要なボリューム: 200/ウェル x 110 井戸 = 22 mL (1.1 mL の濃縮ミルク 20.9 mL の希釈は、PBS ポリソルベートをフィルター選択)。この段階でまたブロッキング液の十分な第一次および二次抗体を作る。1 つのプレートの計算/50 と 110 の井戸に基づく各抗体ソリューションに必要なボリューム: 50/よく x 110 井戸 = 5.5 mL。したがって、単板の試金のために必要なソリューションをブロック牛乳希釈液の総量は 33 mL です。</li>
			<li>ブロッキング液の 200/well を追加します。30 分破棄ソリューションに対する室温 (RT) でプレートをプレートを軽く反転によるインキュベートし、吸水紙タオルの上にしみを付けなさい。</li>
			<li>解決を妨げる希釈 1: 500 ヤギ X RSV 抗体 (mAb-一次抗体) を準備します。MAb ソリューションの 50/well を追加し、1 h. フィルター処理された PBS ポリソルベートで 3 回洗浄プレートの 37 ° C で孵化させなさい。</li>
			<li>ソリューションをブロック内の抗やぎ igg 抗体 (二次抗体) を希釈 1:5,000 Alexa Fluor ロバを準備します。二次抗体溶液の 50/well を追加し、1 h. フィルター処理された PBS ポリソルベートを使用して 5 回洗濯板の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
			<li>フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) チャネルを使用して自動化されたスポット リーダーのプレートを読み、図 2に示すように、設定をカウントします。箔でプレートをラップし、4 ° C で保存未使用の 96 ウェル培養プレートを使用して、アッセイの前にカウント設定を入力する楽器を調整します。 注:数日以内の再スキャンが必要な場合です。校正と count に設定保存でき、アッセイは、校正用プレートの同じタイプを使用する場合、将来のスキャンに使用します。</li>
			<li>アーチファクト プラークまたは細胞膜 (図 3) のための井戸の画像を確認してください。細胞膜と井戸を除外します。 注:アーチファクトのプラクのサイズに応じて手動カウントは、これらの井戸に実行する必要があります。 またはこれらの井戸データ分析から破棄する必要があります。有効な結果の条件には、1 つ以上のレプリケーションも検出なし細胞単層またはアーチファクト斑と負ウェルズ (ウェルズ追加ウイルスなし) で検出されたない PFU が含まれます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ウイルス濃度を決定します。
		<ol>
<li>スポットすることができます明確にカウントされる最後の 2 つの希釈を選択します。同じ希釈でレプリケート井戸からのスポットの数の平均値を計算します。以下の数式を使用してストック サンプル (1 mL あたり PFU) ウイルス価を計算します。 PFU/mL = プラークの数の平均値/(希釈係数 × 希釈ウイルス量も追加) 注: RSV 銘柄ごとのウイルス濃度は、PRN アッセイ (手順 2) で今すぐ使用できます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. RSV 中和試験
<ol><li>
播種板 (日 1)
	<ol>
<li>DMEM + 10 %fcs + 1000 IU ペン/連鎖球菌 4 x 105/mL で A549 細胞を再懸濁します。シード 96年ウェル平底滅菌プレート 100 μ L/ウェル 4 × 10 の4 A459 を含む細胞し、一晩で 37 ° C、5% CO2版を孵化させなさい (ログ相成長でセルになります)。 注:23 通路の後新しい A549 細胞バイアルを使用します。通路番号 3 の前に A549 細胞を使用することはお勧めできません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ウイルスと血清の準備 (日 2) 注:サンプルの種類に応じて、NAb の試金の前に前処理サンプルに必要な手順があります。今生物学的標準とコントロール (NIBSC) 国立研究所からリクエスト承ります RSV 国際標準的な血清を使用することをお勧めします。<ol>
<li>
血清希釈の準備
		<ol>
<li>人間 RSV 参照抗血清 (REF 参照血清) を解凍し、血清 RT。 熱不活化血清のサンプルをテストし、使用する前に 30 分の 56 ° c の水浴の抗血清を参照します。プレートのテンプレート (図 4) に従って希釈液を準備します。</li>
			<li>準備参考準備の 1: 100 希釈 DMEM + ペン/連鎖球菌 FCS なしアッセイ プレートあたりで希釈した REF の 110 μ L の最小値 (例えば、 150 μ L の総ボリュームで REF の 1.5 μ)。1: 100 の 110 μ L 希釈 96 ウェルの U 底も A12 で REF を追加滅菌プレート。</li>
			<li>井戸 B12 H12 12 欄に DMEM + FCS なしペン/連鎖球菌の 55 μ L を追加します。55 μ L を行 A から B の行に転送する、上下に 5 回ピペッティング コンテンツによるソリューションを混合とそれぞれの最終的なボリュームは 55 μ L をよくされるメディアの最後の 55 μ L 行 h. 破棄まで継続、シリアル プレートを 1:2 の希釈を実行します。それぞれの希釈のための新しいヒントを使用します。</li>
			<li>1: 100 希釈血清のテスト サンプルを準備します。すべての血清サンプルは 3 通と、準備 3 = 330 x 110 μ L/ウェルの最小ボリューム血清テスト サンプルあたり μ L。</li>
			<li>各希釈血清テスト サンプル (1: 100; 110 μ L を追加します。S1 = 血清 1、S2 = 血清 2、等.)A9、また図 4によると 96 ウェル滅菌プレートの E9 に E1 に対応する井戸 A1。</li>
			<li>DMEM の 55 μ L を追加 + ペン/連鎖球菌 FCS なしすべてのウェルにラベル X. 実行シリアル 2.2.1.3 の手順に従って 1:2 希釈 (1、2、および 3 のサンプル) の行 D まで。55 μ L 各ウェルの最終的なボリュームがあるので、メディアの最後の 55 μ L を破棄します。同様に、4、5、および 6 行 E h のサンプルのシリアル希釈 1:2 を実行します。 注:それぞれの希釈のための新しいヒントを使用することが重要です。</li>
			<li>列 10 および 11 の井戸に DMEM + FCS なしペン/連鎖球菌の 55 μ L を追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ウイルスの作製
		<ol>
<li>37 ° C の水浴ほぼ完全に解凍し、すぐに氷の場所までに RSV の単一凍結バイアルを急速に解凍します。</li>
			<li>1.3.2 ステップで決定した RSV 因数の濃度に基づく FCS なし DMEM + ペン/連鎖球菌性ウイルスを希釈します。約 200 PFU/ウェルは、希釈を適用します。(井戸) を 5.5 mL の容量を準備します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ウイルス血清混合物の調製
		<ol>
<li>1-9 の列のすべての井戸と井戸 10 および 11 (肯定的な制御) プレートのテンプレート (図 4) に従って列の行 E H の希薄ウイルスの 55 を追加します。</li>
			<li>10 および 11 (マイナス コントロール) の列の行 A ~ D のすべてのウェルに DMEM + FCS なしペン/連鎖球菌の 55 を追加します。37 ° C、5% CO2で 1 h のプレートを孵化させなさい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
A549 細胞へのウイルス接種
		<ol>
<li>潜伏期間の完了する前に準備した 2.1.1 A549 cell plate(s) を取得します。A549 細胞膜 96 ウェルのプレートの合流 ~ 80% であることを確認します。</li>
			<li>プレートを軽く反転と軽く滅菌吸水紙タオルの上にしみが付くことによってメディアを破棄します。すべての井戸を PBS 100 μ l を 2 回洗って、プレートを軽く反転して軽く各洗浄後滅菌吸水紙タオルの上にしみが付く過剰 PBS を破棄します。プレートを乾燥させるようにしてください。</li>
			<li>加温 37 ° C、5% CO2で 1 h 用プレート板テンプレートに従って A549 細胞の版に対応する井戸にウイルス血清の混合物の 100/well を転送します。</li>
			<li>後、ピペットを使用して、1 時間 90/よく取り出し、追加の 100 prewarmed M199 + 1.5 %cmc + 2% の FCS + ペン/連鎖球菌 × 1 です。プレートを 37 ° C、5% CO2で 3 日間インキュベートします。 注:ソリューションは 37 ° C でプレートを追加する前にウォーム アップされていることを確認します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アッセイ プレートと分析 (日 5) の開発
	<ol>
<li>手順 1.3.1.1 に 1.3.1.8 固定・ アッセイ プレートを開発します。</li>
		<li>50% 中和抗体価を決定します。<ol>
<li>50% 中和抗体価計算の上記相互血清希釈と 50% 以下」には血清' コントロールの距離に比例した井戸 (肯定的なウイルス制御 - 10 列、行 E H) を決定します。</li>
			<li>PFU (すなわち斑) の数をカウントする血清井戸とない血清制御井戸個々 のウイルス感染から生じる。ないの血清制御井戸の PFU の平均数を計算し、50% の値を決定します。</li>
			<li>すぐにない血清制御井戸の 50% 値の上下である数と血清希釈を識別します。片対数グラフまたはスプレッドシート テンプレートを使用して、プロット (リニア スケール) x 軸と y 軸 (ログ10スケール) に相互血清希釈 PFU の数です。2 点間線を引き、この線からテストの 50% 中和抗体血清サンプルを読みます。 注:RSV PRN 分析ワークシート (ワークシートの補足)、50% 中和抗体価を決定する使用されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015%3A+a+systematic+review+and+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li>
<li>Modjarrad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine+Development+Report+from+a+World+Health+Organization+Meeting+held+on+23-24+March+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015.</a> Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).</li>
<li>Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+%28RSV%29+vaccine+development%2C+Geneva%2C+25-26+April+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016.</a> Vaccine. , (2017).</li>
<li>Mazur, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+syncytial+virus+vaccine+landscape%3A+lessons+from+the+graveyard+and+promising+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Diseases%22%5BJournal%5D)">The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates.</a> Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).</li>
<li>Hosken, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-laboratory+study+of+diverse+RSV+neutralization+assays+indicates+feasibility+for+harmonization+with+an+international+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard.</a> Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).</li>
<li>Zielinska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+improved+microneutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+by+automated+plaque+counting+using+imaging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis.</a> Virology Journal. 2, 84(2005).</li>
<li>van Remmerden, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+respiratory+syncytial+virus+neutralization+assay+based+on+the+detection+of+green+fluorescent+protein+expression+and+automated+plaque+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting.</a> Virology Journal. 9, 253(2012).</li>
<li>Varada, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+using+a+quantitative+PCR-based+endpoint+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment.</a> Virology Journal. 10, 195(2013).</li>
<li>Tripp, R. A., Jorquera, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTripp%2C+RA+%22Human+respiratory+syncytial+virus%3A+methods+and+protocols%22">Human respiratory syncytial virus: methods and protocols</a>. , Humana Press. (2016).</li>
<li>Suara, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+neutralizing+antibody+to+respiratory+syncytial+virus+in+sera+from+mothers+and+newborns+residing+in+the+Gambia+and+in+The+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).</li>
<li>McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y">http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y</a> (2017).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+neutralizing+serum+antibodies+of+patients+vaccinated+with+human+papillomavirus+L1+or+L2-based+immunogens+using+furin-cleaved+HPV+Pseudovirions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions.</a> PLoS One. 9 (7), e101576(2014).</li>
<li>Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+resistance+to+neutralizing+antibodies%3A+Determination+of+antibody+concentrations+leading+to+escape+mutant+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution.</a> Virus Research. 218, 57-70 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

我々 は開発し、ほとんどの実験室に容易に合わせることができるシンプルかつ効率的なの RSV マイクロ中和のアッセイを最適化します。この試金はコンピューター化されたイメージのスキャンを使用して細胞レベルで民放連によるウイルス感染の阻害を測定し同様、ウイルスの感染能力を測定することができます。イメージング ベースのプラットフォームおよび特定抗体ベース システムの使用は、特異性と伝統的なプラーク検出方法6,7と比較してスポットの検出の感度を増加しています。これにより RSV の評価低い感染性を持つ株し、も PRN 試金で使用前に rs ウイルス濃度の定量の正確さを提供します。
RSV 株式間すべてバッチごとにバリエーションを最小限に抑えるため、各研究のウイルス ストックの同じバッチを使用することをお勧めします。アッセイの他の重要な側面は、ウイルス入力濃度、A549 細胞膜と同じカウントの設定を使用して試金の一貫性と正確性を確保するための整合性の整合性を含めます。プレートに...

呼吸器合胞体ウイルス (RSV) は、小児人口世界1の下気道感染症の主要な原因です。その高い負担にもかかわらずありませんまだワクチンや治療。2013 年以降、世界保健機関 (WHO) は回 WHO 協議会議2,の3の主要な研究の優先順位として RSV ワクチンの開発を宣言しています。WHO は、保護4の主要な血清学的マーカーと見なされると、rs ウイルス中和抗体 (NAb) の測定を使用してワクチンの免疫原性を監視するに合意しました。NAbs 抗 rs ウイルス抗体 palivizumab、現在のみ予防戦略利用できる4の臨床試験と同様、研究の数の厳しい RSV 感染に対する保護するために示されています。
5,6,7、8に挑戦の標準化の努力をした細胞および分子ベースのアッセイを含む世界中の研究所で使用される複数の NAb アッセイ フォーマットがあります。ただし、RSV 型特異抗体の存在によって減らされたプラーク形成単位 (PFU) の数を測定する従来のプラーク減少中和 (PRN) アッセイまだ金本位制9のままです。ここで、RSV の異なる系統と増加測定スループットに多数の細胞に使用ことができます改善、簡素化、および高スループット PRN プロトコルを報告します。このプロトコルは、さまざまな設定からだけでなく、動物実験からのサンプルの臨床サンプルを使用してテストされています。

<table><tbody><tr><td>Cell line</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>by Dr Keith Chappell, University of Queensland</td></tr><tr><td>Viral strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RSV A2</td><td>ATCC</td><td>VR-1540</td><td>ロット番号 60430286</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>1000142511</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor ロバ抗ヤギ IgG (4 °C;C)</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>CMC ナトリウム塩粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (無血清、3.7 g/L NaHC、P/S) (4°C;C)</td><td>科学サービス&ndash;在宅組織培養</td><td></td><td>MCRI 内</td></tr><tr><td>Fetal calf Serum (-20 °C で 50 mL アリコートに保存;C)</td><td>Interpath</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>Goat X RSV antibody</td><td>Merck</td><td>AB1128</td><td></td></tr><tr><td>ヒトポリクローナル抗血清 呼吸器合胞体ウイルス (RSV) (45 &micro;L アリコート -20 &deg;C)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-4022</td><td>登録時にBEI Resourcesを通じて無料注文。この血清は、RSV(NR-32832)</td></tr><tr><td>M199粉末</td><td>Life Technologies</td><td>31100035</td><td></td></tr><tr><td>ミルク希釈剤ブロッキング溶液(4°Cで保存;C)</td><td>Australian Biosearch</td><td>50-82-01</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン(-20°Cで6mLアリコートに保存;C)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>s.d.H2O Milli-Q dispenser</td><td>Merck</td><td></td><td>社内分注</td></tr><tr><td>培養用 1x PBS 滅菌 (4 °C;C)</td><td>科学サービス&ndash;家庭用組織培養</td><td></td><td>MCRI</td></tr><tr><td>Tween 20 polysorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>General 消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conical Falcon チューブ (50 mL)</td><td>Invitro Technologies</td><td>FAL352070</td><td></td></tr><tr><td>フィルターユニット 0.22 &mu;m (500 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL5660020</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み Eppendorf チューブ (1.5 mL)</td><td>オーストラリア PL</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み平底プレート (96 ウェル、蓋付き)</td><td>Interpath</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み U 底プレート (96 ウェル、蓋付き)</td><td>Interpath</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清学的ピペット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清学的ピペット</td><td>Interpath</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清学的ピペット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Tip Pipette 1-200 &micro;L クリア マキシマム リカバリー ラック 滅菌済み 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>フィッシャー バイオテック</td><td>TF-200-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>チップピペット 5-20 & マイクロ;L クリア マキシマム リカバリー ラック 滅菌済み 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>フィッシャー バイオテック</td><td>TF-20-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>チップピペット 100-1,000 & マイクロ;LClear Maxymum Recovery Racked 滅菌済み 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-1000-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Tip Pipette 1-10 & micro;L クリア マキシマム リカバリー ラック 滅菌済み 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td><td>Fisher Biotec</td><td>TXLF-10-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Equipments and softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISpot リーダ システム</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AID ELISpot software version 5.0</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロソフトエクセル 2007</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高スループットの改善された呼吸器合胞体ウイルス (rsv) 微量中和試験

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

呼吸器合胞体ウイルス特異中和抗体 (RSV NAbs) は、RSV に対する保護の重要なマーカーです。さまざまな分析フォーマットの数が現在使用中世界中があるので RSV NAbs を測定する正確かつ高スループット方法に必要性。RSV サブグループ A でテストされています、RSV サブグループ B の別のサンプル タイプも適合できるイメージング ベース微量中和試験をご紹介します。このメソッドは、10% 未満のものをされている参照抗測定間変動と、再現性が高いです。この試金は比較的低コストで、世界中の研究所で容易に確立できると考えています。RSV NAbs を測定、向上、高スループットの測定法の開発は、将来的に新規の RSV ワクチン候補の評価のために重要なあることと同様、国際的にこの方法の標準化のための重要な一歩前進を表します。

ウイルス ストックの滴定を 1:10 1:10 から行った8希釈 PRN アッセイ (典型的な結果を図 5に示すように) 前にウイルス ストック濃度を決定します。図 5から PFU カウントされることが確実に 1:10 の希釈液で4と 1:10 の5。同じ希釈で帳票の井戸から PFU の平均数を算出しました。1:105希釈された 14 のスポットの数の平均値、以来このウイルス株のウイルス価はとおり決定いた
14 (スポットの平均数)/[10-5 (希釈) 0.1 mL (菌量) x] 1.4 x 10 =7 PFU/mL
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

本研究は、高スループットを説明します呼吸器合胞体ウイルス (RSV) の中和抗体の力価を決定するためのマイクロ中和アッセイのイメージングに基づきます。このアッセイの形式は、別のサンプル タイプにテストされています。

高スループットの改善された呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 微量中和試験

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

呼吸間合質ウイルスに対する保護の重要なマーカーとして、RSV中和抗体を測定するための正確で高いスループット方法が必要です。この方法は、参照抗血清のアッセイ間の変動が10%未満であることで非常に再現性が高く、比較的低コストで世界中の多くの研究所でこのアッセイを容易に確立できると考えています。ここでは、RSVサブグループAで試験されたイメージングベースのマイクロ中和アッセイについて説明し、RSVサブグループB、および異なるサンプルタイプに適合させることもできます。この手順のデモンストレーションは、MCRIの研究チームのメンバーであるルーベン・ツです。1日目にプレートをシードするには、まずDMEM培地でA549細胞を再懸濁し、10%FCSと1,000単位ペニシリン・ストレプトマイシン混合物を1ミリリットル当たり400,000細胞の濃度で再懸濁させた。その後、ウェルあたり100マイクロリットルの密度で40,000 A459細胞を持つ96ウェルフラットボトム滅菌プレートをシードします。一晩で5%の二酸化炭素環境で摂氏37度でプレートをインキュベートします。2日目に血清希釈を調製するために、まずヒトRSV参照血清および血清検査サンプルを室温で解凍する。その後、加熱し、それらを活性化するために30分間摂氏56度の水浴にそれらを置きます。次に、110マイクロリットル以上のリファレンスセラムを1.5マイクロリットルの参照血清とFCSフリーDMEM培地とペニシリンストレプトマイシン混合物と混合して、150マイクロリットルの最終体積に調製します。この希釈のピペット110マイクロリットルは、96ウェルU-底滅菌プレートのA12によく。シリアル1~2の希釈液をプレートに下ろすには、まずペニシリン・ストレプトマイシン混合物を含むFCSフリーDMEM培地55マイクロリットルをウェルB12〜H12に加えます。その後、新しい先端で井戸A12からウェルB12に55マイクロリットルを移す。ピペットは5回上下して溶液を混合し、H12によく達するまで続けます。よくH12から溶液の過剰55マイクロリットルをオフにピペット。次に、血清試験サンプルの1~100希釈液を調製し、各希釈液の110マイクロリットルを、対応するウェルA1からA9、E1から96ウェルの無菌プレートのE9に加える。その後、55マイクロリットルのFCSフリーDMEM培地をペニシリン・ストレプトマイシン混合物で追加し、1列から9列の井戸に加えます。前に説明したように、行 A から行 D、および行 E から行 H の順次 1 から 2 つのディリューションを作成します。55マイクロリットルのFCSフリーDMEM培地をペニシリン・ストレプトマイシン混合物で、10列目と11桁目のウェルに加えます。ウイルスストックを準備するには、まず37°Cの水浴にRSVの冷凍バイアルを入れて急速に解凍し、次にバイアルを氷の上に置きます。次に、ペニシリンストレプトマイシン混合物を含むDMEM培地に、ウェルあたり約200 PFUでウイルスを加え、100ウェルの総容量を55ミリリットルにします。ウイルス血清混合物を調製するために、まず、希釈されたウイルスの55マイクロリットルをカラム1〜9の全ウェルと列10および11のHを通る行Eの井戸に加える。次に、ペニシリンストレプトマイシン混合物を含むFCSフリーDMEM培地を列10と11のD行AからDのすべてのウェルに加え、5%の二酸化炭素環境で37°Cでプレートを1時間インキュベートします。RSVによるA549細胞の接種に先立ち、光学顕微鏡下で細胞板を調べ、A549細胞単層が80%コンフルエントであることを確認します。その後、プレートを優しく反転して媒体を捨て、滅菌吸収性のペーパータオルで軽くプレートをブロットします。各後、濾過された滅菌PBSで洗浄する。次に、原稿に記載されているプレートテンプレートに従って、A549細胞プレート上の対応するウェルにウイルス血清混合物のウェルあたり100マイクロリットルを加え、5%の二酸化炭素で37°Cでプレートを1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、ピペットを使用して1ウェルあたり90マイクロリットルを除去し、ペニシリン・ストレプトマイシン混合物に1XM199、1.5%CMC、および2%FCSを含む培地の100マイクロリットルを加える。3日間の5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。アッセイプレートを固定して開発するには、まずRSV感染A549細胞プレートを優しく反転させ、M199、CMC、2%FCS、ペニシリン・ストレプトマイシン混合物を含む培地を廃棄します。その後、ゆっくりと各ウェルに固定バッファーの200マイクロリットルを追加します。マイナス20度でプレートを20分間インキュベートします。その後、固定バッファーを捨て、吸収性のペーパータオルにそっとブロットします。プレートの面を下にして10分間乾燥させます。次に、05ポリソルベート20を含む濾過されたPBSバッファーで、5%乳遮断溶液を作る。各ウェルに200マイクロリットルのブロッキング溶液を加え、室温でプレートを30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、プレートを優しく反転させ、吸収性のペーパータオルに溶液を捨ててブロットします。一次抗体を作るために、ブロッキング溶液中の1~500ヤギXRSV抗体を希釈する。各ウェルに50マイクロリットルを加え、1時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。ろ過したPBS-ポリソルベートでプレートを3回洗います。次に、ブロッキング溶液中の1~5,000個のアレクサフルーオールロバ抗ヤギ免疫グロブリンGを希釈して二次抗体を作る。各井戸に50マイクロリットルを加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。ろ過したPBS-ポリソルベートで5回プレートを洗います。自動スポットリーダーでプラークをカウントするには、まず未使用の96ウェルカルチャープレートを使用して、FITCチャンネルにカウント設定を入力して機器をコラボレーションします。その後、セルプレートを読み、ホイルで包み、摂氏4度で保存します。次に、実際のプラークまたは破壊された細胞単層の井戸の画像をチェックし、破壊された細胞単層を有する井戸を除外する。非血清制御ウェルのプラークの平均数を計算し、ウイルス活性の50%阻害をもたらす50%中和遮断を決定するために使用した。逆血清希釈は、x軸上にプロットし、2点間に引かれた線から半対数グラフのy軸上のプラークの数をプロットした。試験血清サンプルの50%中和価は、赤および血清希釈と、無血清制御ウェルの50%値の直下または直下の数を有し、同定された。ガンビアの2つの異なる成人コホートとメルボルンの健康なボランティアのRSVAPRNアッセイは、ガンビアの成人がメルボルンの成人と比較して低い平均NABトワトレを有する結果をもたらした。示されたヒトRSV参照血清は、6.82%の変動係数を有する非常に低い変動性を示し、この改善された高スループットRSVプラーク還元中和アッセイは多くの研究室で容易に実施することができ、RSV中和抗体アッセイのためのWHOの国際的な調和の取り組みをサポートします。これは、将来の新しいRSVワクチン候補の評価にとって重要です。

an-improved-high-throughput-respiratory-syncytial-virus-rsv-micro

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このプロトコルは、組換え受容体結合ドメイン（RBD）ベースのSARSに対するサブユニットワクチンを研究するための一般的な手順を説明します。それは、293T細胞におけるRBDタンパク質のトランスフェクションと発現、RBDおよび確立されたSARSの偽ウイルス中和アッセイを用いたマウス血清の中和活性の検出によるマウスの免疫化のためのメソッドが含まれています。...

タンパク質調製物、動物の予防接種と中和の検出：遺伝子組換えRBDベースのSARSのワクチンのためのプロトコル

このビデオは、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に対する中和抗体を測定するためのアッセイを示しています。RSV中和抗体を含む血清とプレインキュベートすると、ウイルス粒子が中和され、細胞感染とプラーク形成が減少します。次に、ウイルスに感染した細胞を固定、ブロッキング、およびフルオロフォア標識抗体標識してプラークを可視化します。このプロセスにより、RSV の 50% を中和する最も高い血清希釈液 (中和力価を表す)...

呼吸器合胞体ウイルスに特異的な中和抗体価を測定するためのアッセイ

ヒト呼吸器合胞体ウイルス(HRSV)は、幼児に重度の細気管支炎を引き起こす可能性があります。重度のHRSV疾患の病因の一部は、宿主の免疫応答によって引き起こされます。HRSVによるヒト初代免疫細胞の刺激は、炎症経路と感染の活性化を研究するための迅速で再現性の高いモデルシステムを提供します。...

ヒト呼吸器合胞体ウイルス感染に対するヒト末梢血単核細胞の免疫応答を研究するためのインビトロモデル

この研究は説明します ウイルス間の抗原性の関係を分析するための画像化ベースのマイクロ中和アッセイ。プロトコルは、フラットベッドスキャナを使用し、滴定、滴定の定量、中和、及び中和定量を含む4つのステップがあります。アッセイは、現在の循環インフルエンザA（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスでうまく動作します。...

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

生成する方法について述べる、RSVs の呼吸器合胞体ウイルス (RSVs) と最適化されたプラクの試金を変更遺伝子を増幅します。RSV レプリケーションの定量化しライブ RSV 封入体と顆粒の封入体のダイナミクスの分析、それぞれ 2...

世代、増幅、および組換え呼吸器合胞体ウイルスの滴定

呼吸合体ウイルス(RSV)RNA合成の詳細な機械分析のために、RNA非含核タンパク質(N0)をウイルス特異的ヌクレオキャプシド(NC)のその後のインビトロ集合体に対するRNAフリー核タンパク質(N0)の共発現にシャペロンホスホタンパク質(P)を利用するプロトコルを報告する。...

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。...

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

SARS-CoV-2の中和IgGおよびIgM抗体を同時に測定できる多重血清および抗体中和アッセイの開発には、2レポーターの読み出しを提供するビーズベースの多重化アッセイのフロー分析システムが使用されました。...

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

AAV6に対する中和元素を検出するための、迅速で費用対効果が高く、簡単な比色細胞ベースのアッセイについて、包括的なラボプロトコルと分析ワークフローが説明されています。...

比色細胞ベースのアッセイを用いてAAVに対する中和抗体を検出するためのステップバイステップ法

偽型ウイルス(PV)は、複製欠損のあるウイルス粒子であり、本物のウイルスを扱うよりも安全な条件下で宿主とウイルスの相互作用を研究するために使用されます。ここでは、SARS-CoV-2...

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

学ぶ高スループットのイメージングベース微量中和試験法で、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）に対する中和抗体価を正確に測定します。A549細胞を用い、再現性が高く低コストで世界中の研究室で実施可能です。

高スループットの改善された呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 微量中和試験

さらに動画を探す