カルバリア共培養と組織病量を用いた骨リモデリングと腫瘍-骨微小環境の再現
March 14th, 2020
骨外植の元生体培養は、骨生理学の研究や骨のリモデリングや骨疾患における薬物の潜在的な評価のための貴重なツールとなり得る。提示されたプロトコルは、新生児マウスの頭蓋骨から分離されたカルヴァリアの調製および培養、ならびにその用途を記述する。
この手順の目的は、骨のリモデリングを評価し、カルバリア培養または癌細胞との共培養を用いて腫瘍-骨微小環境を再現するex vivoモデルを有することである。最もカルバリアの技術は、新生児マウスのカルバリア骨を使用して骨のリモデリングを評価する臓器培養系である。多様な分子の治療可能性をテストしたり、がん細胞との共培養を行う場合は骨腫瘍微小環境を再現することもできます。
そのすべては、短時間で簡単にアッセイし、低コストで。この技術の目的は、マウスのカルバリア臓器培養のex vivoモデルを用いて、癌骨微小環境における骨再生を評価するツールを有することである。まず、マウスの子犬を選択し、フードの下に置きます。
私たちは、5〜7日齢のマウスの子犬からカルバリアを使用しています。注射器で頭を取り、皮膚を切断し、カルバリアを解剖するのに十分な頭皮領域をクリアします。頭蓋骨、矢状、冠状動脈、およびラムドイドの縫合糸を特定します。
ラムドイド縫合糸に沿ってまっすぐにカットし、目の高さにします。両側に、子羊の縫合糸からコロナ縫合糸に向かって切る。45角度で、もう一つのカットを行い、前のフォントのカットで作られたカットの端を接続します。
正しい組織包入および組織学分析を保証するために、頭蓋骨縫合糸、矢状、前頭、コロナ、ラムドイドを定義することは非常に重要です。細かい先端鉗子で、カルヴァリアを取り外し、ペトリ皿カバーの上に置きます。メスで、冠状縫合糸を通して矢状縫合に沿って後部フォンタネルからまっすぐにカットします。
2つのヘミカルバリアが得られる。鉗子で各カルバリアをピックアップし、PBSと新しいペトリ皿に入れます。培養のために、1ミリリットルの培地を含む24ウェル組織培養プレートにヘミカルバリアを入れ、37度で24時間インキュベートする。
また、原発性カルバリア培養を用い、骨吸収のための腫瘍-骨微小環境を再現することもできます。そのために、カルバリアをがん細胞、またはがん細胞のコンディショ条件付き培地と共培養します。24時間後、メディアを取り出し、テストしたい治療を含む培地に交換してください。
がん細胞と骨の相互作用を評価したい場合、または腫瘍骨微小環境を再現したい場合は、カルバリアを低細胞付着プレートに渡し、癌細胞のプレートへの付着を避けます。がん細胞をトリプシン化し、数え、ヘミカルバリアの上部に慎重に配置します。また、がん細胞の条件付き培地を使用し、それを使用してヘミカルバリアをインキュベートすることもできます。
37度で6~7日間インキュベートし、CO2は5%です。3日目に、メディアを交換し、インキュベートを続けます。共培養で使用する細胞の数は、癌細胞株に依存する。
まず、応答を誘導するために必要な細胞の数を最適化する必要があります。培養後、カルバリアは固定、脱灰、パラフィン埋め込みのプロセスを通過します。また、組織をミクロトームで切り離し、染色し、組織形態測定解析を行う。
カルバリアを含めることは難しい場合があります。包み込み中に組織が保護されていることを確認するには、スポンジの間に組織を置くか、ティッシュペーパーまたは他の吸収性紙を使用してカセットに入れることができます。組織処理の場合は、ヘミカルバリアをティッシュペーパーで包みます。
次に、それを埋め込みカセットに入れ、ホルマリン中の中性バッファーに4度で24時間固定します。カルバリアを脱灰するには、カセットを10%EDTAに4度で48時間置きます。自動組織プロセッサでヘミカルバリアで組織カセットを処理します。
規則的な日の回転サイクルに従い、次いで、パラフィンに含める。断面化のために、マイクロトームで4つのマイクロチックセクションを切断し、ガラス顕微鏡スライドにセクションを取り付け、ヘマトキシリン、エオジンで染色します。組織学分析は、骨表面および骨のリモデリング領域の定量分析を行うために使用された。
7日間のカルバリアの画像をイメージングソフトウェアを用いて分析した。定量的評価の場合は、まず分析の領域を定義します。4つのXがあるテロパのセクションを見て、方向と縫合糸を特定します。
コロナ縫合を定義し、片側の長い骨の表面を特定し、次に他方の短い面を特定します。40倍率の下で、コロナ縫合を特定し、長い表面に沿って縫合線から離れて2つまたは3つの光学フィールドを移動します。解析のためにこの領域の画像をキャプチャします。
イメージ ソフトウェアを使用して、ボーンの構造的な整合性を分析できます。ヘミカルバリアの厚さと骨面積に関する定量的組織形態解析が可能です。正しいカルバリア解析は、一貫した組織学的結果を得るために、良好な埋め込みと適切な方向に依存します。
実験条件ごとに少なくとも3つのカルバリアを使用してください。ここでは、骨の構造を見ることができます。オレンジ色では、骨が観察される。
また、骨膜、オストーサイト、エンドステウム、および骨の別の部分の存在を見ることができます。私たちの場合、骨のリモデリングを増加させるためにインスリンを使用しています。コントロールと比較すると、骨領域の有意な増加を見ることができます。
ここでは、MDA-MB-231細胞株がモデルカルバリアに及ぼす影響を確認できる。コントロールと比較して、がん細胞の存在が骨破壊を刺激する骨分解因子を誘導していることがわかります。カルバリアモデルを用いて、がん細胞や細胞学との共培養による骨再生とがん細胞と骨の相互作用を測定しました。
定量的リアルタイム PCR でデータを検証します。このex vivoモデルは、骨の立体組織や細胞の多様性が保持され、実験条件を制御することができるような多くの利点を有する。また、モデルはシンプルで、短時間で結果を見ることができ、低コストです。
定量的リアルタイム PCR、顕微鏡、マイクロ CT などの他の手法と組み合わせることができます。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この記事では、新生児マウスの頭蓋骨からex vivoで培養するプロトコルを提示し、骨の生理学を研究し、骨リモデリングに対する薬物効果を評価することを目的としています。この技術により、腫瘍-骨の微小環境を再現することができます。
主要な研究要素
科学の分野
- 骨の生理学
- 骨リモデリング
- がん生物学
背景
- 骨エキスプラントを培養して生理学的プロセスを研究できます。
- 新生マウスの頭蓋骨は骨研究のモデルとして機能します。
- がん細胞との共培養により、腫瘍-骨の微小環境を模倣できます。
- この方法は費用対効果が高く、簡単です。
研究目的
- ex vivoモデルで骨リモデリングを評価すること。
- 様々な分子の治療効果を評価すること。
- 骨-腫瘍の微小環境を再現すること。
使用された方法
- 新生児マウスから頭蓋骨の分離。
- 骨エキスプラントのex vivo培養技術。
- がん細胞との共培養システム。
- 骨再生と薬物効果の評価。
主な結果
- 骨リモデリングの研究のための頭蓋骨の培養に成功。
- 管理された環境で治療薬をテストする能力。
- 腫瘍-骨の微小環境の再現が実証されました。
- この方法は効率的で低コストであることが示されました。
結論
- ex vivo頭蓋骨培養は骨研究のための貴重なツールです。
- 骨の生理学に対する薬物効果の研究を促進します。
- 共培養システムにより、がんと骨の相互作用の理解が深まります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
