Name: オレイン酸のトリペプチド安定ナノエマルション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学ぶオレイン酸プラチナ(II)共役体のトリペプチド安定ナノエマルション合成法。生分解性の低毒性安定化剤を用いて抗がんプラチナ薬剤を封入し、卵巣がん治療への応用可能性を探索する。

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我々 は感謝して SC2CA206194 を付与国立がん研究所からの財政支援を認めます。競合する金銭的な利益が宣言されていません。

1. オレイン酸 Acids–Platinum(II) 共役の合成
<ol><li>シスプラチンの活性化<ol>
<li>60 ° C で 50 mg (0.167 モル) 4 mL の水 (例えば、nanopure) にシスプラチンを中断します。</li>
		<li>シスプラチンのソリューションに 0.5 mL の水にアグノ3滴 55.2 mg (0.325 ミリ モル) を追加し、60 ° C で少なくとも 2 時間の反応をかき混ぜる反応の進行状況を示す塩化銀の白色沈殿物を形成します。</li>
		<li>活性化反応は完了するには、10% のテストを行う無料 Ag+イオンの存在の hcl が掲載。テストは負の値にする必要があります (追加 AgCl の沈殿物を形成する必要がありますなし)。</li>
		<li>3,220 × g 10 分で反応混合物を遠心分離し、塩化銀の白色沈殿物を削除します。</li>
		<li>上清を収集し、0.2 mm のシリンジ フィルターを介してフィルターします。プラチナの有無を清をテストするには、新規2結晶をパスツール ピペットで溶液の 2 〜 3 滴を適用します。検査結果が陽性の場合はプラチナでスズの座標複合体の色は濃い黄色/オレンジ色です。</li>
		<li>2 番目のステップの活性化 Pt(II) の上澄みを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オレイン酸活性化 Pt(II) との反応<ol>
<li>60 ° C で水 3 mL でオレイン酸 (0.333 モル) 94.2 mg を中断します。</li>
		<li>1 mL の水の NaOH の 13.3 mg (0.333 mmol) を追加し、手順 1.1 からアクティブ化された Pt(II) の溶液を混ぜてください</li>
		<li>2 h の反応 60 ° c、次に室温で一晩撹拌します。原油製品は油性の茶色/黄色沈殿物です。</li>
		<li>3,220 × g 10 分で反応混合物を遠心し、上清を除去します。ロータリーエバポレーターを使用して 25 の ° C で粗製品を乾燥させます。アセトニ トリルと複数の洗浄によって、製品を浄化します。純粋なオレイン酸 acids–Pt(II) 共役の最終的な色は淡い黄色です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. KYF-白金-NE の合成と FITC 標識ナノエマルション FITC-KYF-白金-NE
<ol><li>KYF トリペプチドと蛍光に分類されたトリペプチド FITC KYF の合成<ol>
<li>標準的な固体ペプチド化学を用いた KYF を合成します。カップリング条件次の標準を使用して、各アミノ酸を添付する: 王ガレージ (2.19 m モル)、fmoc 保護保護アミノ酸 (4.38 モル) 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium テトラフルオロホウ酸 (TBTU) (4.38 モル) と diisopropylethylamine(DIPEA)(8.76 モル)。ジメチルホルムアミド (DMF) に TBTU とアミノ酸の溶解と DIPEA。</li>
		<li>DMF を 1 時間使用する前に 25 mL で fmoc 保護-L-フェニルアラニン 4-alkoxybenzyl アルコール樹脂 (0.382 meq/g) の 5.7 g を浸します。</li>
		<li>5 分間 20% ピペリジン/DMF 溶液 15 mL と L-フェニルアラニン アミノ酸のアミン グループを deprotect、溶媒を破棄し、20 分サイクルで洗浄を繰り返します。</li>
		<li>1 分以下の溶剤で樹脂を洗う: DMF、イソプロピル アルコール (IPA)、DMF、IPA、DMF、IPA、DMF、DMF。各洗浄した後、溶媒を破棄します。</li>
		<li>樹脂の無料 NH2グループの存在を定めるためカイザー テストを実行 (手順を参照してください) (樹脂種は紫) 陽性、fmoc 保護 L-チロシンのアミノ酸を追加すると、結合を実行して一晩。<ol>
<li>カイザー別ボトルでテスト ソリューションを準備します。</li>
			<li>エタノール 100 mL にニンヒドリンの 5 g を溶かします。</li>
			<li>エタノール 20 mL にフェノールの 80 g を溶解します。</li>
			<li>青酸カリの 0.001 M 水溶液 2 mL を混ぜてください。 ピリジンの 98 mL。</li>
			<li>各カイザーの 2 〜 3 滴 5 分間水を沸騰のサンプルおよび熱ソリューションのテストを追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2 番目のアミノ酸の成功したカップリングは、カイザー テストを実行して負が脱保護プロトコル (手順 2.1.3 に 2.1.5) を続行します。Fmoc 保護フェニルアラニン アミノ酸とプロセスを繰り返します。<ol>
<li>すべてのアミノ酸の結合、時に各洗浄溶媒を破棄後の DMF、IPA、DMF、メタノール、ジクロロ メタン、ジエチル エーテル 5 mL で 1 分のガレージを洗ってください。さらに処理用樹脂を保存します。</li>
			<li>FITC とペプチドを変更するのに次の手順 (2.1.7-2.1.9) 樹脂の半分を使用します。そのまま KYF トリペプチドを得るためには、2.1.10 から始まる手順に従います。</li>
		</ol>
</li>
		<li>6-azidohexanoic 酸 KYF N3 KYF の N 末端アミノ酸を変更します。このため、1 g (0.382 モル) KYF 王ガレージの 120.1 mg (0.764 ミリ モル) 6-azidohexanoic 酸の 245.2 mg (0.764 ミリ モル) とのミックス TBTU 197.1 mg (1.528 モル) DIPEA の DMF の 30 mL で。反応を室温で一晩攪拌します。</li>
		<li>KYF N3クリック反応によるプロパルギル フルオレセインの合成から KYF FITC を取得します。このため、固体 CuI の 3.78 mg (0.019 モル)、プロパルギル フルオレセインの 71.9 mg (0.193 モル) 2.24 mg (0.017 モル) DIPEA と KYF N3王ガレージの 253 mg (がかかります 0.097 mmol) をミックスします。反応は、茶色に緑から色を変更必要があります。</li>
		<li>24 h 後 1 分交互に DMF と IPA の 5 mL、メタノールと水を三度、DMF と水 3 回、5 回とジクロロ メタンとジエチル エーテルの樹脂を 3 回洗います。各洗浄した後、溶媒を破棄します。</li>
		<li>トリフルオロ酢酸 (TFA) 溶液でガレージから KYF FITC または KYF ペプチドを切断/triisopropylsilane (ヒント)/H2O 95/2.5/2.5 の比率で 3 時間以上。</li>
		<li>冷たいジエチル エーテル、冷たいエーテルと三度洗いと、真空下で乾燥し、粗ペプチドを沈殿させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pt(II) (FITC KYF Pt NE) と KYF Pt NE FITC KYF 安定ナノエマルションの合成<ol>
<li>1.5 ml のイソプロパノールのオレイン酸 acids–Pt(II) 共役と 5 mL の注射器の場所の 10 mg (0.0126 mmol) を解散します。</li>
		<li>オレイン酸 acids–Pt(II) 共役シリンジをシリンジ ポンプにし、流れを 0.1 mL/分に設定します。</li>
		<li>FITC KYF Pt NE を合成するために FITC KYF と KYF 1 mg (0.00219 mmol) の 1 mg (0.00105 mmol) を溶解 (FITC のモル比を 1:2-KYF:KYF) 20 mL の水にし、37 ° c. に解決の温度を調整FITC の蛍光の退色を避けるためにアルミ箔容器の壁をカバーしてください。KYF Pt NE を合成、水 20 mL で KYF トリペプチドの 2 mg (0.0044 モル) を溶解し、37 ° c. に解決の温度を調整</li>
		<li>FITC KYF/KYF または KYF トリペプチドの溶液に滴下オレイン酸 acids–Pt(II) 共役を追加します。この手順では、フードの下で。</li>
		<li>有機溶媒を蒸発させるように、室温で一晩ソリューションをかき混ぜる、FITC KYF Pt NE または KYF Pt ねの自己集合</li>
		<li>遠心濃縮器で FITC KYF Pt NE または KYF Pt NE を集中 (10 k MWCO)、4 mL の nanopure 水で 3 回洗浄します。</li>
		<li>4 ° C で KYF Pt NE と FITC KYF Pt NE の水溶液を格納します。</li>
		<li>プラチナの量を原子吸光分析 (原子吸光法)、次の製造元のガイド48を使用しての分析します。<ol>
<li>10% 塩酸溶液でプラチナ基準を備える検量線 (原子吸光法の有効範囲は 100 に 1,200 ppb (10億分の 1) の間)。</li>
			<li>王水 (濃塩酸と硝酸の 3:1 の混合) の手順 2.2 で 100 μ L から KYF Pt NE ソリューションの 50 μ L を溶かし、常温で一晩おきます。最終的なサンプル量は 1 mL に達する水の 850 μ L を追加します。原子吸光法を使用してサンプルを分析します。最終酸濃度は、すべての分析試料を 10% をする必要があります。</li>
			<li>Ppb で Pt 濃度の読書を記録し、サンプル (サンプル希釈とナノエマルションの最初のボリュームのアカウント) で最終的なプラチナの量を計算します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 FITC KYF Pt NE の細胞内取り込み共焦点イメージング
<ol><li>4 チャンバーごとの4セル数 10 × 4.7 の密度でも商工会議所共焦点料理に 6 卵巣癌細胞株 (A2780、CP70、SKOV3、OV90、TOV21G、ES2) をシードし、37 ° C で一晩培養済み</li>
	<li>リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) で三度セルを洗浄して、24 時間後とセル培地の FITC KYF Pt 鍛錬と孵化 (セルの行の特定の詳細手順 6.1 参照) 37 ° C で 15 分間</li>
	<li>インキュベーション後、メディアを取り出し、洗浄 3 回 PBS のセル。</li>
	<li>-20 ° C で 5 分間冷メタノールとセルを修正し、3 回 1 mL の PBS で洗浄します。</li>
	<li>0.1 ml の 1 セルを permeabilize % トリトン X 室内温度と洗浄で 10 分の 3 回 1 mL の PBS の。</li>
	<li>1:50 で Alexa Fluor 647 (1 mL) と共役 LAMP1 抗体 90 分細胞をインキュベート室温で PBS で希釈。次に、PBS で 3 回セルを洗浄してください。</li>
	<li>DAPI 原液 (1 mg/mL) を 1 mg/mL の PBS で希釈します。各チャンバーに希釈した溶液の 1 mL を追加し、室温で 15 分間インキュベートします。PBS で 3 回洗浄を行う。</li>
	<li>メディアをマウントを使用してスライド上 coverslips にマウントします。</li>
	<li>画像の 405 の励起波長で生きているセルの共焦点顕微鏡を用いた細胞 nm、488 nm および 633 nm。以下の通り検出パラメーターを設定: 0.2% と 1% 以上、ピノール 1 風通しの良いユニットからレーザー電力利得マスター 650-750、デジタル オフセット 0。</li>
	<li>画像処理ソフトウェアで画像を開く。表示されたイメージの下にグラフィックスを選択し、挿入スケール バー画像にスケールバーを挿入するを選択します。</li>
</ol>4. 薬物放出の研究
<ol><li>PBS の薬物放出の研究を行います。それぞれ 7.4 6.8、5.0 3 PBS バッファーの pH 値を調整します。</li>
	<li>180 μ L の PBS バッファーの適切な pH で KYF Pt NE の 5 μ L を希釈、3.5 kDa MWCO ミニ透析カップに移し、PBS で 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>2、4、6、24、48、および 140 h でそれぞれ 3 つのミニ透析チューブからバッファーを削除し、原子吸光法による白金濃度を測定します。2.2.8 の手順に従ってすべてのサンプルを準備が 500 μ L のサンプルの最終的な音量を調整します。</li>
</ol>5. 細胞培養法
<ol><li>培養細胞は、L-グルタミンとペニシリン/ストレプトマイシン A2780 CP70、skov 氏 3、OV 90、tov さん-21 G、添加 (A2780、CP70、skov 氏-3、ES 2) 10% や 15% (tov さん-21 G、OV 90) ウシ胎児血清 (FBS)、細胞培養液中 (DMEM) ES 2 をラインします。すべての 5% CO2のセル、37 ° C で水飽和雰囲気を成長します。</li>
	<li>各 96 ウェル プレートでの培養実験のため一晩前培養種 3 × 105セル。水にカルボプラチン、シスプラチン、KYF Pt NE ソリューションを準備します。各細胞株のシスプラチンとカルボプラチンの濃度に合わせて KYF Pt 鍛錬で Pt(II) の濃度を調整します。37 ° C で 72 時間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、比色アッセイ (MTT のセル拡散の試金) を用いた細胞の生存率を評価します。簡潔に、培地を取り除き、各媒体で MTT がよく、37 ° C で 2 時間インキュベート 10 %110 μ L を追加各ウェルに 100 μ L の洗剤を追加し、37 ° C で 5 時間インキュベート</li>
	<li>570 で吸光度をチェック プレート リーダーを使用して nm。統計分析を使用して Z 検定と P 検の結果を分析します。</li>
</ol>

著者には、利益相反を開示するはありません。

ナノエマルション合成で重要な手順は、基板のモル比を調整、オレイン酸 acids–Pt(II) 追加中の温度と流量制御の維持、自己組織化のための十分な時間を提供すること、使用して製品を浄化、遠心濃縮器列。これらのパラメーターに影響を与える KYF Pt NE; の形態とサイズしたがって、特に適切なモル比を維持し、正しく合成条件を調整することが重要です。
ナノエマルション合成 (ステップ 3) の際に基板の比は、自己組織化プロセスの重要な製品の最終的なサイズを決定します。KYF オレイン酸 acid-Pt(II) のモル比は 1:3 と水で KYF tripepide の最適濃度は 0.2 mM。さらに、3.1 の手順でオレイン酸 acid-Pt(II) 共役を溶解するために使用される有機溶剤は水、ろ過システムとの互換性と混和性で、室温で簡単に蒸発します。
重要な手順の 1 つは、KYF ソリューション (ステップ 3.4) オレイン酸 acid-Pt(II) 共役の滴下です。流れはならない低速 0.1 mL/min 以下と 0....

近年では、ナノ粒子ドラッグデリバリーとバイオ1,2,3,4としてこのような医用工学における関心の高まりがあった。ナノ粒子ベースのシステムの多面的機能はしばしば 1 つの定式化の内で複数のコンポーネントを組み込むことを必要とします。しばしば脂質またはポリマーに基づくビルディング ブロックは、その物理化学的特性、生体適合性、生分解性は、最終的にナノ構造1,の機能に影響を与える可能性があります点で異なる5,6。タンパク質やペプチドなどの生物学的派生材料は長い多機能ナノ構造、シーケンス柔軟性7,8のための有望なコンポーネントとして認識されています。非常に発注された超分子構造体形成ヘリカルに自己組み立てるペプチド リボン9,10、線維性足場11,12、および多く、従って建物への道を舗装生体分子ベースのハイブリッド ナノ構造をボトムアップ型を使用してのアプローチ13。
ペプチドは、医学やバイオ テクノロジー、特に抗がん剤療法14と抗生物質開発16,17、代謝と心血管疾患15同様のアプリケーションに検討されています。障害18、および感染症19。小さなペプチドによる治療受けている臨床試験20数百以上あります。ペプチドは、簡単を変更して高速に低コストで合成しています。さらに、彼らはその生物学・薬学アプリケーション21,22を容易に大きく生分解されます。ペプチド構造部材としての使用を含む、ペプチド ベースの応答性ナノ粒子の放出制御23,24,25,26のハイドロゲル デポ工学,27ペプチドを用いたバイオ センサー28,29,30,31, またはバイオ電子デバイス32,33,34。重要なは、フェニルアラニンを含む 2 つまたは 3 つのアミノ酸残基とも短いペプチッドはガイドに発見された、自己集合35,36,37を処理し、安定したエマルジョン38 を作成します.
彼らの高効率により、プラチナ ベースの薬は、両方単独でそして他のエージェント39,40との組み合わせで多くのがんの治療で使用されます。白金化合物は、monoadducts、intrastrand または interstrand のクロスリンクを形成し DNA 損傷を誘発します。Pt DNA 損傷は細胞機械装置によって認識され、修復されていない場合は細胞をアポトーシスに導きます。Pt(II) が癌細胞の死に貢献、最も重要なメカニズムは、DNA 転写41,42の抑制です。ただし、重篤な副作用を発生させる Pt(II) の全身毒性によってプラチナ療法の利点は減少します。これ Pt(II)43, で、しばしば DNA に達するプラチナのサブ治療濃度の低い臨床投与に します。結果として、次の DNA 修復はがん細胞の生存と Pt(II) 抵抗性の獲得に貢献します。プラチナ化学療法抵抗は、抗がん剤療法と治療障害44,45の主な原因主な問題。
全身循環のシールド効果を提供するためにおよび Pt II による副作用を軽減するため、Pt(II) エージェントをカプセル化する安定したナノシステムを開発しました。システムは、ナノエマルション (KYF Pt NE)46を形成する KYF トリペプチドで安定したオレイン酸 acids-Pt(II) のコアに基づいています。KYF Pt 北東、オレイン酸と同様に、トリペプチドのアミノ酸のビルディング ブロックは、食品医薬品局 (FDA) と一般認識として安全 (フォアグラ) ステータスを持っています。KYF Pt NE は、47nanoprecipitation メソッドを使用して準備されます。要するに、オレイン酸 acids-Pt(II) 共役は有機溶剤に溶解し、37 ° C で水の KYF ソリューション (図 1) に滴下し、KYF Pt 好中球エラスターゼの自己集合を許可するいくつかの時間のため、溶液を攪拌します。ナノエマルションは 10 kDa 遠心コンセントレーターに集中し、水で 3 回洗浄しました。Fluorophore と KYF の化学修飾により蛍光 FITC-KYF-白金-NE の合成、生体イメージングに適した。

<table><tbody><tr><td>2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸塩(TBTU)</td><td>アナスペック:</td><td>AS-20376</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>4-well chamber confocal dish</td><td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td><td>154526 for</td><td>imaging</td></tr><tr><td>6-bromohexanoic acid</td><td>Chem-Impex INT'株式会社エル</td><td>24477</td><td>ペプチド</td></tr><tr><td>A2780</td> のクリック加工 <td>マウントサイナイ病院のジョン・マルティネッティ教授による寛大な寄付</td><td>卵巣がん細胞株</td>バーンステッド ナノピュア サーモフィッシャー D11901 水ろ過システム BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 溶媒除去とサンプル乾燥用 遠心分離機 5810 R eppendorf <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>5811F</td><td>白金錯体分離用</td></tr><tr><td>シス-ジクロロジアミン白金 (II) 99%</td><td>Acros Organics</td><td>19376-0050</td><td>in vitro tests</td></tr><tr><td>CP70</td><td>マウントサイナイ病院のジョン・マルティネッティ教授が寛大に提供</td><td>卵巣がん細胞株</td>デジタルウォーターバス VWR 97025-134 細胞培養用培地のウォーミングアップ用 動的光散乱(DLS)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ブルックヘブン・インスツルメンツ・コーポレーション</td><td></td><td>ナノ粒子径測定用</td></tr><tr><td>ES-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1978</td><td>卵巣がん細胞株</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79%</td><td>Chem-Impex INT'株式会社エル</td><td>00493</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe 4-アルコキシベンジルアルコール樹脂 (0.382 meq/g)、</td><td>Chem-Impex INT'株式会社エル</td><td>01914</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>H59730</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>HERACELL 150i CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td></td><td>インキュベーター</td></tr><tr><td>高圧シリンジポンプ</td><td>New Era</td><td>1010-US</td><td>ナノ粒子合成における白金錯体添加用</td></tr><tr><td>ホットプレート/スターラー</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>サンプルの攪拌および加熱用</td></tr><tr><td>LAMP-1 抗体(Alexa Fluor 647と共結合)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-18821 AF647</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)</td><td>オークウッドケミカル</td><td>005027</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>ニンヒドリン 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10409</td><td>カイザー試験</td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>Chem-Impex INT'株式会社エル</td><td>01421</td><td>白金錯体合成用</td></tr><tr><td>OV90</td><td>ATCC</td><td>CRL-11732</td><td>卵巣がん細胞株</td></tr><tr><td>PBS</td><td>コーニング</td><td>21-031-CV</td><td>細胞洗浄用</td></tr><tr><td>パーマウント封入剤</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>SP15-100</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>フェ</td><td>ノールフィッシャーケミカル</td><td>A92500</td><td>カイザー試験</td></tr><tr><td>リンタングステン酸</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A248-25</td><td>TEM</td></tr><tr><td>ピペリジン 99%</td><td>BTC</td><td>219260-2.5L</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>プラチナ AAS 標準 soultion</td><td>アルファ エーザー</td><td>88086</td><td>1000ug/ml 検量線用</td></tr><tr><td>臭化プロパルギル 97%</td><td>アルファ エーザール</td><td>L10595</td><td>フルオレセインのアルキン修飾用</td></tr><tr><td>サイエンティフィック バイオ キャビネット</td><td>サーモ サイエンティフィック フィッシャー</td><td>1385</td><td>バイオフード細胞培養用</td></tr><tr><td>セルフクリーニング 真空システム</td><td>ウェルチ</td><td>2028</td><td>回転式蒸気用真空ポンプ</td></tr><tr><td>硝酸銀</td><td>アクロス・オーガニクス</td><td>19768-0250</td><td>シスプラチン活性化</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>卵巣がん細胞株</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S313-1</td><td>白金錯体合成用</td></tr> 塩化<tr><td>スズ(II)</td><td>プラチナの存在のためのシグマAldrich</td><td>の208256</td><td>テスト</td></tr><tr><td>TOV21G</td><td>ATCC</td><td>CRL-11730</td><td>卵巣癌の細胞株</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸99% (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>トリイソプロピルシラン(TIPS)</td><td>Chem-Impex INT'株式会社エル</td><td>01966</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>用 ウラニン粉末 40%</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>S25328A</td><td>フルオレセイン</td></tr><tr><td>ビバスピン 20 (10000 MWCO)</td> <td>Sartorious</td><td>VS2001</td><td>ナノ粒子洗浄および凝縮</td></tr><tr><td>VWR 倒立顕微鏡</td><td>VWR</td><td>89404-462</td><td>細胞培養モニタリング用</td></tr></tbody></table>

オレイン酸のトリペプチド安定ナノエマルション

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

オレイン酸 acids-Pt(II) コアとリジン-チロシン ・ フェニルアラニン (KYF) コーティング (KYF Pt NE) から成るナノエマルションを生成する方法について述べる。KYF Pt NE は、107 ± 27 nm と負の表面電荷の直径を有する 10 重量 % で Pt(II) をカプセル化します。KYF Pt NE は安定した水と、血清と生物学的活性します。KYF に fluorophore の活用により生体イメージングに適した蛍光ナノエマルションの合成ができます。水溶液環境と短い KYF ペプチドおよびオレイン酸 acids-platinum(II) 共役の自己集合による KYF Pt NE フォームで、ナノエマルションの合成を行います。自己組織化プロセスは、ソリューションの温度、基板のモル比と基質添加の流量に依存します。重要なステップは、合成の際に最適な撹拌速度を維持し、自己組織化のための十分な時間を許可する、ナノエマルションを遠心濃縮器に徐々 に集中して事前に含まれます。

このプロトコルを使用して準備 KYF Pt NE の代表の TEM 像を図 2 aに示します。KYF Pt ファミコン、球状形態、よく分散していると均一の大きさの。KYF-白金-ファミコン、200 測定、最低 3 つの TEM 画像から直接測定のコア径は、107 ± 27 nm です。KYF-白金-NE、動的光分光法 (DLS) を使用して分析の流体力学的直径が 240 に発見された 0.156 の多分散性のインデックスを持つ nm。-60.1 の平均値と 3 つの独立した合成 KYF Pt 水 - NE のゼータ電位を測定した mV。ポテンシャルの高い等級を示します、定式化のコロイド安定性良いと負の表面電荷はオレイン酸のイオン COO-表面グループに起因します。KYF の等電ポイント 8.59 であり従ってそれが正荷電中性 pH で。
蛍光に分類された FITC KYF...

このプロトコルでは、リジン ・ チロシン ・ フェニルアラニン (KYF) トリペプチドで安定したオレイン酸 acids-platinum(II) 共役のナノエマルションを合成するための効率的な方法について説明します。穏やかな条件合成を介しての自己集合、KYF と共役ナノエマルション フォーム。

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

幅広い短いペプチド配列を考えると、この方法は他の多くのナノ粒子設計に拡張することができる。ペプチドの修飾は、診断目的に適したシステムを作ることができます。生分解性の薬剤に抗癌白金を封入し、低毒性安定化剤は、医薬品用途に対して非常に関連性が高い。卵巣癌の予備的なインビボ研究は有望であり、さらに調査される。まず、摂氏60度で4ミリリットルの超純水に50ミリグラムのシスプラチンを吊り下げます。硝酸銀溶液を滴下してシスプラチン溶液に加え、暗闇の中で摂氏60度で2時間300〜400RPMで混合物をかき混ぜます。その後、溶液中に遊離の銀イオンがないことを確認するために10重量%の塩酸を使用してください。塩酸を添加しても追加の塩化銀が形成しない場合は、混合物を10分間重力の3倍220倍にして遠心分離する。上清をデカントし、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターを通してそれをフィルタリングする。次に、2~3滴を20個の塩化物結晶に塗布して、白金の濾液を試験します。懸濁液が濃い茶色またはオレンジ色に変わる場合は、プラチナが存在します。次に、1ミリリットルの水に13.3ミリグラムの水酸化ナトリウムを加え、60°Cの3ミリリットルの水にオレイン酸の94.2ミリグラムの懸濁液を加えます。60°Cで2時間かき混ぜます。次に、火を消し、室温で16〜24時間攪拌を続け、粗生成物を油性の黄褐色沈殿剤として得る。反応混合物を3、220倍の重力で10分間遠心し、上清を除去した。25°Cのロータリーエバポレーターで製品を乾燥させます。粗物を5ミリリットルのアセトニトリルで、ボルテックスで懸濁し、遠心分離によって回収します。この洗浄工程を少なくとも2回以上繰り返して、純白色の白金IIを淡黄色の固体として得る。まず、5.7グラムのFmoc保護されたLフェニルアラニンを25ミリリットルのジメチルホルムアミドで1時間浸漬する。次いで、80RPMで振盪しながら、DMFに20%ピピリジンの15ミリリットルに樹脂を5分間浸し、アミンを保護解除する。樹脂を水切りし、保護解除を20分間繰り返します。その後、DMFとイソプロピルアルコールで樹脂を洗浄します。脱保護が確認されたら、Fmoc保護されたL-チロシンTBTUとDIPEAを加え、カップリングを行うために16〜24時間混合物を攪拌する。DMFおよびイソプロピルアルコールで樹脂を洗浄します。カイザー試験を行い、前述のように保護解除と洗浄を続行します。カップルと保護解除Fmocは同じようにリジンを保護しました。その後、DMF、IPA、メタノール、ジクロロメタン、ジエチルエーテルで樹脂を洗浄します。FITCの修正のためのKYF軸受樹脂の1グラムを脇に置きます。残りの樹脂を95%トリフルオロ酢酸に浸します。2.5%トリイソプロピルシランおよび2.5%水は、樹脂からトリペプチドを切断するために3時間。20°Cまで冷却したジエチルエーテルで粗ペプチドを沈殿させます。沈殿物を冷たいジエチルエーテルの30~40ミリリットルの部分で遠心分離して3回洗浄し、真空下で乾燥させます。次に、KYF樹脂の残りのグラムを、TBTUおよびDIPEAと共に30ミリリットルのDMF中の6-アセトヘキサン酸の120.1ミリグラムと混合する。混合物を室温で16〜24時間攪拌し、アジド修飾トリペプチドを得た。次に、この樹脂の253ミリグラムを3.78ミリグラムの固体銅(I)ヨウ化物71.9ミリグラムのプロパルギルフロリサンと2.24ミリグラムのDIPEAと組み合わせます。24時間振りながら混合物を反応させてください。その後、FITC変性KYF軸受樹脂を十分に洗浄します。FITCを修飾したKYFを樹脂から切断し、未修飾トリペプチドと同様に精製します。ナノメモルシオンの調製を開始するには、10ミリグラムのオレイン酸白金IIを1.5ミリリットルのIPAに溶解します。この溶液を5ミリリットルのシリンジに引き込み、20ゲージの針を取り付け、シリンジをシリンジポンプに付けます。注射器ポンプを毎分0.1ミリリットルに設定します。FITC修正KYFを用いたナノエマルジョンの場合、FITC改変KYFの1ミリグラムと20ミリリットルの水に1ミリグラムの未改変KYFを溶解する。未修飾のKYFを用いたナノエマルジョンの場合、代わりに20ミリリットルの水にKYFの2ミリグラムを溶解する。FITCを改変または変更されていないKYF溶液を摂氏37度に加熱します。KYF溶液が約400RPMで撹拌され、シリンジが溶液に合っていることを確認してください。次に、シリンジポンプを開始し、オレイン酸白金2個のコンジュゲートドロップをワイズして添加開始する。コンジュゲートを加えたら、撹拌速度を150RPMに下げ、溶液を室温まで冷まします。16~24時間撹拌を続けます。次いで、ナノマルチオンを10,000ダルトン遠心フィルターユニットに濃縮する。ナノエマルジョンを遠心フィルターユニットで3回、超純水の4ミリリットルの部分で洗浄します。そして、摂氏4度で水溶液として保存します。最終製品は、KYFナノ粒子の青白色化、FITC修飾ナノ粒子の蛍光です。未修飾のKYFで調製されたナノエマルジョン中の液滴は球状で、十分に分散し、比較的均一な大きさであった。透過電子顕微鏡画像を用いて、コアの直径は約107ナノメートルであった。ここに緑色で現れるFITC修飾ナノエマルジョンは、様々な卵巣癌細胞株から細胞に入る可能性がある。両方の製剤の流体力学的直径は、水中での貯蔵の4ヶ月の間に増加したが、全体の寸法は保存された。さらに、20%のウシ胎児血清中の1日のインキュベーションの後にエマルジョンのオプソニンゼーションは観察されなかった。エマルジョンからの白金の放出はpH 7.4で最も遅く、4時間後に放出された白金のわずか20.8%であった。白金放出はpHが減少するにつれて加速した。白金含有KYF被覆ナノエマルジョンは、これらの卵巣癌細胞株の生存率を、臨床的に関連する類似体であるカルボプラチンによって達成されたよりもはるかに大きな程度に低下させた。ナノエマルジョンはまた、6つの細胞株のうち5個においてシスプラチンよりも生存率の同等または大きな減少を示した。KYFコーティングされたナノエマルジョンは、オレイン酸白金IIコンジュゲート単独と比較可能またはより大きな生存率の低下を一貫して誘導した。これは、トリペプチド基底ナノ粒子足場内に疎水性治療薬をカプセル化するための簡単で効率的な方法です。短いペプチドは生分解性であり、毒性が低く、医学やバイオテクノロジーにとって重要です。この手順は、有機溶剤への暴露を避けるために、ヒュームフードの下で行ってください。白金オレイン酸およびKYF白金ナノエマルションは抗癌特性を有するため、特別な注意を払って取り扱う必要があります。この方法は、低いフィラビレーター活性および装置の点では簡単であるが、それは合成戦略の適切な適用、および基礎となる化学概念に依存している。私たちの方法は、他の小さな薬物分子を提供するために拡張することができます。ナノ粒子コアはオレイン酸から構成されているため、疎水性薬剤のカプセル化に適しています。

a-tripeptide-stabilized-nanoemulsion-of-oleic-acid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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オレイン酸のトリペプチド安定ナノエマルション

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