Name: 多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学ぶCK2キナーゼ基板の識別法。細胞や組織溶解液から内因性基板を特異的に標識・濃縮・同定する生化学的手法です。あらゆる細胞型や組織に適用可能で、CK2の生物学的役割解明に貢献します。

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この作品は、授業を実施するペンシルベニア州保健省から連邦普遍的な研究強化助成金によって部分で支えられました

メモ: は、必要な材料は、使用可能な適切に準備を確認 (材料の表を参照してください)。
1. 準備
<ol><li>機械的に組織サンプル (表 1の換散バッファーの 100 μ L の組織の 1-2 mg) を溶解または培養細胞 (換散バッファーの 350 μ L で 80-90% の合流は、10 cm プレート)、実験用サンプルの 900 μ L の合計を収集することを目標とします。このボリュームは、以下の実験に必要なをわずかに超えることに注意してください。</li>
	<li>4 ° C で 3 分間 17,500 × gで遠心分離によってスピン ・ ダウン サンプル完了すると、3 つの新しい 1.7 mL の遠心管のそれぞれに上澄みの 270 μ L を転送します。残り約 90 μ L があります。「入力コントロール」と新しい管の場所として使用される 40 μ l を削除します。氷の上には、すべてのサンプルを配置します。</li>
</ol>2. キナーゼ試金: thiophosphorylation およびアルキル化
<ol><li>ラベルを次のように各 270 μ L を含む 3 つの管:「キナーゼ rxn」、「GTPγS だけ」と「PNBM (p nitrobezyl メシル酸) だけ」。キナーゼ反応を準備します。<ol>
<li>「キナーゼ rxn"チューブ CK2 の 2.7 μ L (1,350 U に相当) を追加し、2.5 mm GTPγS 2.7 μ L を追加。</li>
		<li>「GTPγS だけ」管に 2.5 mm GTPγS、2.7 μ l を追加し、、換散バッファーの 2.7 μ L を追加。</li>
		<li>「PNBM だけ」管の換散バッファーの 5.4 μ l を追加します。ミックスし、すぐに氷の上に配置するすべてのチューブをフリックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 ° C の水浴中 1 分のすべての 3 つの管を孵化させなさい。インキュベーション、次すべての 3 つの管に 12 mg/mL PNBM の 13.5 μ L を追加します。サンプルをミックスに反転します。1 時間室温でこれらのサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>手順 2.2 で孵り後、約 45 分かかる、できるだけ早く脱塩カラムを準備します。</li>
</ol>3. 脱塩カラムの準備
<ol><li>初期ストレージ バッファー内の樹脂のセファデックス G-25 を再停止を数回各列の反転によって列 (この例の実験のための 3) の準備します。各列をクランプ スタンドに接続して、約 5 分に邪魔されずに座ることによって解決する樹脂を許可します。</li>
	<li>重力によって排出し、チューブの破棄の流れを通して収集する下部開口部の下に配置を持っているストレージ バッファーを許可する列の上下両方からキャップを削除次のセファデックス G-25 樹脂の定着します。</li>
	<li>記憶域バッファーがなくなると、一度列を平衡するために約 2.7 mL の溶解バッファーを追加します。フローを通じて収集し、破棄します。3 回繰り返します。次の最終的な平衡列が 4.1 のステップの準備ができています。</li>
</ol>4. PNBM の除去
<ol><li>1 時間培養 (手順 2.2) およびコラムの準備 (ステップ 3) が完了した後は、サンプル列に適用されます。ラベルの各列を次のように:「キナーゼ rxn」、「GTPγS だけ」、「PNBM だけ」。すべてのそれぞれの列に各サンプルのロードします。収集し、流れを破棄します。</li>
	<li>換散バッファーの 420 μ L を各列に追加することによってサンプルを洗います。換散バッファーの列をフィルター処理して破棄の流れを介して収集を許可します。この洗浄ステップ次サンプルのコレクションの位置にチューブを配置します。</li>
	<li>換散バッファーの 500 μ L を各列に追加することによってサンプルを溶出します。今 thiophosphorylated とアルキル化 CK2 基板を含むフロースルーを収集します。</li>
</ol>5. 免疫沈降法: 第 1 報
<ol><li>免疫沈降のそれぞれ (「キナーゼ rxn」、「GTPγS だけ」、「PNBM だけ」) それぞれ有害溶出のステップ 4.3 で収集したから「溶出入力コントロール」サンプルの最初削除 80 μ l サンプルを準備します。次の各サンプルから 80 μ L を除去した残りの 1 サンプルあたり約 420 μ L になります。<ol>
<li>各サンプルを各 200 μ L を含む 2 管に分割します。各それぞれのチューブにラベルを付ける:「キナーゼ rxn 反 thiophosphate エステル」、「キナーゼ rxn IgG」、「GTPγS 抗 thiophosphate エステル」、「GTPγS IgG」、「PNBM 抗 thiophosphate エステル」、「PNBM IgG」.</li>
	</ol>
</li>
	<li>反 thiophosphate エステル抗体抗 thiophosphate エステル ラベル チューブのそれぞれの 2.8 μ g と 2.8 μ g のアイソタイプ コントロール抗体 IgG というラベルの付いた管のそれぞれに追加します。2 h の 4 ° C で回転子にチューブを置きます。</li>
	<li>5.2 の手順で 2 時間インキュベーションの最後 15 分間蛋白質 A/G ビーズの準備を開始します。</li>
</ol>6. タンパク質 A/G アガロース ビーズ準備
<ol><li>簡単に渦ビーズを確保するためのストレージ管が完全に再懸濁です。サイズを測るきれいなかみそりの刃を使用して高めるためにピペット チップ P200 の端を切り落とします。ピペット 100 μ L の新しい 1.7 mL 遠心チューブに免疫沈降あたりビード スラリー。この例では、6 管の合計が必要です。</li>
	<li>4 ° C で 1 分 17,500 x gでチューブを遠心分離します。上澄みを除去し、破棄します。再換散バッファーと簡単に渦を 200 μ l 添加でビーズを中断します。スピンを繰り返し、3 回ステップを洗浄します。</li>
	<li>次の最終的な洗浄ステップ 5.2 で孵化が完了するまで氷にビーズを配置します。</li>
</ol>7. 免疫沈降: パート II
<ol><li>4 ° C で 3 分間 17,500 x gでサンプル手順 5.2 から 2 時間培養後スピンダウンします。以下の遠心洗浄ビーズ チューブに各サンプルから 200 μ L を追加します。1 h の 4 ° C で回転子にチューブを置きます。</li>
	<li>1 時間培養後 4 ° C で 1 分 17,500 x gでチューブを遠心分離します。次に各サンプルから清 40 μ L を削除し、「枯渇コントロール」として保存 (合計 6 本).上澄みと破棄の残りの部分を削除します。ビーズを邪魔しないように注意してください。</li>
	<li>換散バッファーとボルテックスの 200 μ L を簡単に追加することによって、サンプルを洗います。4 ° C で 1 分 17,500 × gで遠心分離します。上澄みを除去し、破棄します。洗浄を繰り返し、3 回手順をスピンします。これらの手順の中にビーズを邪魔しないように注意してください。</li>
	<li>洗浄の手順を完了すると、ビーズを含む各サンプルに 2 x サンプルバッファーの 50 μ L を追加します。その他のすべてのサンプルのサンプル バッファー x 6 の 8 μ L を追加:「入力コントロール」、「溶出入力コントロール」と「枯渇コントロール」.</li>
	<li>一度バッファーは、管、ピペットで移しなさい、ミックスして SDS のページに進む前に 5 分間 95 ° C ですべてのサンプルの熱を上下に追加されます。</li>
</ol>8. 結果の分析/検証
<ol><li>成功した CK2 依存 thiophosphorylation およびアルキル化を検証します。<ol>
<li>手順 2.2 CK2 を介した thiophosphorylation の有効性を判断するには、SDS のページおよび溶出入力「統制」12.5% ポリアクリルアミドゲルで手順 5.1 で収集の 15-20 μ l を実行することによって西部しみを実行します。</li>
		<li>次抗体を用いた膜プローブ: 反 thiophosphate エステル、反 CK2α、アンチ GAPDH (やその他の適切な読み込み制御)。この手順が成功した場合強化対策 thiophosphate エステル信号は 2 車線 (図 2) と比較して「キナーゼ rxn"レーンで明白なはずです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CK2 の濃縮と推定される基板を視覚化し、蛋白質のアイデンティティを決定します。<ol>
<li>免疫沈降法の手順が成功した場合を評価するには、別の 12.5% ポリアクリルアミドゲルの 7.4 手順でビーズから溶出サンプルの 25-30 μ L を実行します。すべての機器が清潔手袋を着用を常時この手順中に汚染を最小限に抑えることを確認します。</li>
		<li>Coomassie のゲル染色実験的プロトコル (図 3) の様々 な段階から濃縮タンパク質を視覚化するブルー。新しい razorblades を使用して、慎重に物品税ユニークなバンドは、彼らのおおよその分子量を指摘し「キナーゼ rxn 反 thiophosphate エステル IP」レーンに存在。</li>
		<li>液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (MS/LC-MS) (図 4) によるタンパク質の同定のためのこれらのバンドを送信します。識別された蛋白質に対する抗体がある場合入力、枯渇、SDS-PAGE による質量分析の結果、イムノブロッティングを確認、プロトコル (図 4) のコースの間に収集された IP 分数。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+CK2%3A+structure%2C+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li>
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<li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival%3A+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li>
<li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biologyl%22%5BJournal%5D)">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97(2017).</li>
<li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460(2013).</li>
<li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li>
<li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy%3A+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li>
</ol>

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ここでは、複雑な生物的サンプルからの蛋白質キナーゼ CK2 の基板を識別するため比較的単純な生化学的手法について述べる。このプロトコルの重要なステップは、CK2 の異常な酵素学的性質に基づくし、CK2 依存 thiophosphorylation GTPγS 以降免疫沈降と識別を用いた特異的基質タンパク質が含まれています。これらの結果、ひと神経膠芽腫細胞、ショウジョウバエ卵巣18でこの戦略を適用している我々 としてのユーティリティとこのアプローチの多様性を説明してきました。
定量的プロテオミクス手法を用いた以前に発行された文献数実際に小説 CK2 基板19,20,21,22,を識別するに成功を収めている<sup class=...

蛋白質キナーゼはシグナル伝達カスケードの主要なコンポーネントです。これらの酵素による基質タンパク質のリン酸化は細胞分裂、新陳代謝および他の中の分化を制御する重要なイベントを調節する生体反応を引き出します。CK2 は普遍的表現、好酸性セリン/スレオニン ・ キナーゼ人間に酵母から保存されているが、転写制御からアポトーシス1 細胞周期の進行に至るまで多くの細胞プロセスで重要な役割を果たしています。、2,3。酵素は 2 つの触媒 α で構成される heterotetramer (または α') サブユニットと 2 つの規制 β サブユニット4。高い, だけでなく、CK2 の特徴 2 他珍しいその分析を複雑にするすなわち、構成活動5と二重共同の基質特異性6。この後者のプロパティは、基質タンパク質のリン酸化のため ATP と同様に GTP を使用する能力を持つ CK2 を与えます。
マウス CK2 の触媒作用または規制のサブユニットの遺伝子の欠失は、開発と器官形成7、8時に重要な役割を果たしていることを示す胚性致死の結果します。CK2 は癌のいくつかの種類の過剰発現も、従って有望な治療上のターゲット9,10,11を表します。確かに、特異的阻害剤そのターゲット CK2 キナーゼ活動現在調査中ですこの目的12,13,14。一方、CK2 の阻害は, 本来の代わりを与え、可能なオプションと、おそらくより合理的なアプローチはある特定の癌の進行の根底にある重要な CK2 基板を対象とするでしょう。したがって、包括的な同定と CK2 基質タンパク質の機能解析は特定の組織や腫瘍の型の中でこのキナーゼの特定の機能を解明するための重要な利点のでしょう。
ここでは、細胞や組織ライセートなど複雑な生体試料から CK2 基板を識別するため多彩な生化学的手法について述べる。このプロトコルを用いて GTP アナログ GTPγS (その他の内因性のキナーゼを使用ことはできませんグアノシン 5'-[γ-thio]triphosphate) CK2 のデュアルの共同の基質特異性の活用します。これにより、このサンプルに後続の分離と同定のための基板を「ラベル」としてキナーゼ。

<table><tbody><tr><td>12 mg/mL PNBM</td><td>アブカム</td><td>ab138910</td><td>40.5 &micro;L</td></tr><tr><td>2.5 mM GTP&γ;S</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>G8634-1MG</td><td>5.4 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>抗CK2&α;(E-7) マウスモノクローナル抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-373894</td><td>1:1000 for Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32233</td><td>1:1000 for Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td><td>Abcam</td><td>ab22758</td><td>1:1000 for Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td><td>Abcam</td><td>ab92570</td><td>はさまざまです (最終濃度 2.8 & micro;各サンプルのg)</td></tr><tr><td>遠心分離機は4&ordmに事前設定されています。C</td><td>ThermoScientific</td><td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td>以下のレシピを参照</td> 以下の<td>レシピを参照</td><td>30 mL</td></tr><tr><td>正常ウサギ IgG 抗体 (アイソタイプコントロール)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2729S&nbsp;</td><td>変動します(最終濃度2.8 &micro;各サンプルのg)</td></tr><tr><td>PD MiniTrap カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-10</td><td>3カラム</td></tr><tr><td>プロテイン A/G プラス アガロース ビーズ</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td>600 &micro;L</td></tr><tr><td>組換えヒト CK2 ホロ酵素</td><td>New England Biolabs</td><td>P6010S</td><td>2.7 & micro;L</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Labnet: ミニLabroller</td><td>Mini Labroller SKU# H5500</td><td></td></tr><tr><td>T98G ヒト膠芽腫細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス 30&ordmにプリセット;C</td><td>シェルラボ</td><td>H20 バスシリーズ モデル# SWB15</td><td></td></tr></tbody></table>

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 ck2 キナーゼ基板の識別

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

キナーゼ基質の関係の研究は生理と病態におけるこれらの酵素とその下流の機能の完全な理解を得るために不可欠です。CK2 は複数の細胞プロセスに関与する基板の何百もの成長のリストに進化上保存されたセリン/スレオニン キナーゼです。その多面プロパティのため抽出と定量化 CK2 基板の包括的なセットは特に挑戦されているし、この重要な酵素の研究でハードルのまま。このような課題に対処するため、我々 は、ターゲットの濃縮と推定 CK2 基板の識別を可能にする汎用性の高い実験的戦略を考案した.このプロトコルは、ライセートその基質細胞または組織の特定の thiophosphorylation を可能にする CK2 のユニークな二重共同基質特異性の活用します。これらの基質タンパク質がその後は、アルキル化、沈澱と液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (MS/LCMS) によって識別されます。我々 はショウジョウバエ卵巣から CK2 基板を正しく識別するこのアプローチを使用している以前とここで我々 は調査方法の適応性を示すひと膠芽腫細胞にこのプロトコルのアプリケーションを拡張、各種のモデル生物・実験システムにおけるこのキナーゼの生物学的役割は。

図 1に実験手順の概略図があります。技術の基盤には、リン酸化グループ転送に GTP を使用する CK2 の珍しい機能です。ホロ酵素 CK2 外因性内因性 CK2 基板の thiophosphorylation の細胞ライセート結果 GTP アナログ、GTPγS、に沿っての追加。ライセート アルキル化試薬p- ニトロベンジル イマチニブ (PNBM) との後の治療はエステル抗 thiophosphate 抗体を用いた免疫沈降したことができますこれらの特異的基質タンパク質の thiophosphate のエステル基を生成します質量分析法による最終的に識別されました。図 2は、T98G に CK2 と GTPγS と PNBM の添加に続いて肯定的な結果を示しています (膠芽腫) 細胞ライセート。これらの結果は、CK2 依存 thiophosphorylation およびそれ以降のアルキル化が成功したことを示します。予想通り、完全なキナーゼ反...

このプロトコルの目的は、ラベル、豊かにする、および特定蛋白質キナーゼ CK2 細胞ライセートや組織ホモジネートなど複雑な生物的サンプルからの基板です。このメソッドは、この目的のため CK2 生物のユニークな側面を活用しています。

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

このプロトコルは、細胞または組織のライセートのような複雑な生物学的サンプルから特定の標識およびそれに続くCK2基質の濃縮および同定を可能にする。この方法は、任意の細胞タイプまたは組織に適用することができる。このようにして、種々の生物学的文脈におけるCK2の研究を促進する。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるジョン・チョイノフスキです。まず、テキストプロトコルで概説されているように組織サンプルまたは培養細胞を機械的に融液し、合計900マイクロリットルのサンプルを収集する。17倍、重力500倍、摂氏4度で3分間遠心分離機。次いで、上清の270マイクロリットルを3つの新しい1.7ミリリットルマイクロ遠心分離管のそれぞれに移す。入力コントロールとして使用する残りの上清の40マイクロリットルを取り除き、新しいチューブに移します。すべてのサンプルを氷の上に置きます。まず、ここに示すように、3つのサンプルチューブのそれぞれにラベルを付けます。キナーゼ反応チューブに、CK2の2.7マイクロリットルと2.5ミリモルGTPgammaSの2.7マイクロリットルを加えます。チューブをフリックして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。GTPgammaS専用チューブに、2.7ミリモルGTPgammaSの2.7マイクロリットルと2.7マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。このチューブをフリックして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。PNBMにのみチューブにリシスバッファーの5.4マイクロリットルを追加します。チューブをフリックして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。3本のチューブを摂氏30度の水浴に1分間インキュベートします。この後、各チューブに1ミリリットルあたり12ミリグラムで13.5マイクロリットルのPNBMを加えます。チューブを反転してサンプルを混合し、室温で1時間インキュベートします。サンプルがインキュベートされている間、次に示すように、読み込むサンプルの各列にラベルを付けます。各カラムを数回反転させて、記憶バッファー内のSephadex G-25樹脂を再懸濁させてカラムを準備します。各列をクランプスタンドに取り付け、約5分間邪魔されずに座らせて樹脂を落ち着かせます。次に、各列の下の開口部の下にチューブを配置します。各列の上部と下部の両方からキャップを取り外し、ストレージバッファが重力によってチューブに排出されるようにします。ストレージバッファーが使い果たされたら、各カラムに約2.7ミリリットルのLysis Bufferを追加して平衡化し、フローを収集して廃棄します。Lysis バッファを追加し、フローを 3 回破棄するこのプロセスを繰り返します。開始するには、各サンプルをそれぞれの列にロードします。フローを収集し、破棄します。各カラムに420マイクロリットルのLysis Bufferを加え、サンプルを洗浄します。Lysis バッファが列を通してフィルター処理し、フローを収集して破棄します。次に、サンプル収集のために各列の下の位置にチューブを配置します。各カラムに500マイクロリットルのLysis Bufferを加える。キナーゼ反応でチオリン酸化およびアルキル化されたCK2基質の濃縮集団を含む流れを収集します。GTPgammaSのみの反応は、存在する任意の内因性CK2によってチオリン酸化およびアルキル化された基質を含む。PNMBのみの反応は、バックグラウンドアルキル化タンパク質を含む。溶出入力制御サンプルとして各溶出から80マイクロリットルを取り除く。次に、各サンプルを200マイクロリットルを含む2つのチューブに分割します。各管に対して、抗チオリン酸エステルまたは免疫グロブリンGのいずれかであることをラベル付けする。.抗チオリン酸エステルチューブのそれぞれに2.8マイクログラムの抗チオリン酸エステル抗体を加えます。各IGGチューブに2.8マイクログラムのアイソタイプコントロール抗体を加えます。その後、2時間摂氏4度で回転器の上にチューブを置きます。サンプルインキュベーションの最後の15分間、きれいなカミソリの刃を使用して、P200ピペットチップの端部を切り落とし、ゲージサイズを大きくします。使用の直前に、アガロースビーズを含む貯蔵管を短時間渦に入れます。カットピペットチップを使用して、新しい1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに免疫沈降ごとにビーズスラリーの100マイクロリットルを移します。ビーズが落ち着くのを防ぐために、各転送の前にビーズを渦に入れるのが重要です。チューブを17、500倍の重力、摂氏4度で1分間遠心分離します。上清を取り除き、捨てます。200マイクロリットルのLysisバッファーを加え、短時間渦を混ぜてビーズを再懸濁します。このプロセスを繰り返し、遠心分離し、ビーズを洗浄します。最後の洗浄の後、ビーズを氷の上に置いて、準備が整うまで進みます。サンプルがインキュベートを終えたら、17、500倍の重力、摂氏4度で3分間遠心分離します。次いで、各サンプルの200マイクロリットルを洗浄されたビーズを含むチューブに移す。チューブを摂氏4度の回転器に1時間置きます。次に、チューブを17倍、重力の500倍、摂氏4度で1分間遠心します。各上清から40マイクロリットルを取り除き、枯渇制御として保存します。上清の残りの部分を取り除き、ビーズを邪魔しないように注意してください。サンプルを洗浄するには、それぞれに200マイクロリットルのライシスバッファーを加え、短時間で渦を出します。17、500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で1分間、上清を捨てる。この洗浄と遠心分離プロセスを3回繰り返し、ビーズを乱さないように注意してください。この後、ビーズを含む各サンプルに2Xサンプルバッファーの50マイクロリットルを追加します。入力コントロール、溶出入力コントロール、および枯渇制御を含む他のすべてのサンプルでは、6X サンプル バッファーの 8 マイクロリットルを追加します。ピペット各チューブは、ビーズを含むチューブを除いて混合し、SDS-PAGEを続行する前に5分間摂氏95度ですべてのサンプルを加熱します。免疫沈降が成功したかどうかを評価するには、ビーズから除外された各サンプルの25〜30マイクロリットルを別の12.5%ポリアクリルアミドゲルで実行します。各ゲルをクマシーブルーで染色し、実験プロトコルの様々な段階から濃縮タンパク質を可視化します。新しい、きれいなカミソリの刃を使用して、慎重にそれらのおおよその分子量をメモしながら、キナーゼ反応抗チオリン酸エステルIPレーンに存在する任意のユニークなバンドを切除します。新しいカミソリの刃は、それぞれのユニークなバンドに使用する必要があります。この技術の根底にあるのは、この技術は、CK2がリン酸化基の転写にGTPを用いるという異常な能力である。外因性CK2ホロ酵素をGTPアナログと共に添加すると、GTPgammaSは、細胞ライセートに、内因性CK2基質のチオリン酸化を生じる。アルキル化試薬p-ニトロベンジルメシル酸を用いたライセートの後の処理は、これらの特定の基質タンパク質上にチオリン酸エステル部分を生成し、抗チオリン酸エステル抗体を使用して免疫沈降させ、最終的には質量分析によって同定することができる。ここに示す代表的な陽性結果では、CK2依存性、チオリン酸化およびその後のアルキル化が成功した。予想通り、ウェスタンブロッティングによる強化された抗チオリン酸エステルシグナルは、完全なキナーゼ反応を含むレーンでのみ観察され、GTPgammaSのみおよびPNMBのみで処理されたサンプルでは観察されない。免疫沈降およびほのめかされたタンパク質のクーマシーブルー染色ゲルと、陽性の結果も示す。複数のユニークなバンドは、抗チオリン酸エステルIPレーンでのみ明らかであるように、ライセートは外因性CK2およびGTPgammaSでインキュベートされた。マークされたバンドは、その後、ゲルから切除され、質量分析によってタンパク質同定のために提出される。この手順に従って、質量分析法によって同定された推定CK2基質は、標準的なin vitroキナーゼアッセイにおけるCK2依存性リン酸化などの追加アプローチを使用して検証されなければならない。

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学ぶCK2キナーゼ基板の識別法。細胞や組織溶解液から内因性基板を特異的に標識・濃縮・同定する生化学的手法です。あらゆる細胞型や組織に適用可能で、CK2の生物学的役割解明に貢献します。

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

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