Name: 自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ、自動生細胞固体撮像素子を用いたがん細胞の移行と侵襲のリアルタイム解析法。この再現性の高い効率的な手法により、細胞の運動性と形態学的変化を詳細に観察し、転移メカニズムの理解に貢献します。

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ハンター医療研究所 (HMRI 13-02) を通じてブルーム フィールド グループ財団の資金援助を承認したいと思います。X.Z をサポートするには、ニューカッスル大学を通じて APA 奨学金と HCRA バイオ マーカー旗艦博士課程奨学金。

注:2 つのセルラインを個別に処理する必要があります。次の手順する必要がありますが 1 つの単一セルの行に適用されます指定されていません。
1 負傷する前に細胞密度を最適化します。
<ol><li>T75 cm2培養フラスコを約 80% の付着性細胞の培養でフェノール レッド無料ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、200 mM L グルタミン 5% CO2 (37 ° C で 2 μ g/mL インスリンと合流ほとんど癌セルライン文化製剤の標準培養条件がセルの行に依存) です。</li>
	<li>廃棄物コンテナーにオフ ピペッティングによる文化メディアを削除します。予め温めておいた 0.1% トリプシン-EDTA を単層細胞とピペットを簡単に洗うことの 2 mL をピペットで移しなさい。0.1% トリプシン-EDTA の別の 2 mL を追加し、5 分の 37 ° C で標準的な培養条件下でフラスコを置きます。</li>
	<li>細胞の剥離を確実に、フラスコを軽くし、タンパク質分解反応を停止するために予め温めておいた培地 10 mL を追加します。</li>
	<li>15 mL 遠心管、室温 (RT) で 5 分間 200 x gでスピンダウンに細胞懸濁液を転送します。慎重に細胞ペレットを撹拌せず上澄みを除去し、別の 10 mL に予め温めておいた文化メディアで再懸濁します。</li>
</ol>2. 自動化された細胞カウンター (またはカウントのメソッド) を使用してセル数を数える
<ol><li>ダルベッコ リン酸 x 1 の 800 μ L で再懸濁細胞懸濁液の希釈 200 μ L は、1.5 mL 遠心チューブに生理食塩水 (DPBS) をバッファーしました。</li>
	<li>60 μ m 細胞カウント センサーを付けるセル カウンター、トグルを押し細胞懸濁液に先端をマージします。細胞懸濁液はセンサーに正常に描画されるまでゆっくりとトグルを解放します。細胞濃度は細胞/ml に表示されます。</li>
	<li>10 mL の細胞懸濁液の細胞数を計算します。</li>
</ol>3. セルめっき
<ol><li>プレート細胞細胞の密度 (40,000 90,000 細胞/ウェル) 96 ウェル プレートで 3 通の範囲で。</li>
	<li>
住セルイメージ イメージャにプレートを置き、24 時間すべての 2 h をスキャンをスケジュール設定します。
	<ol>
<li>ソフトウェアで、タスク一覧から「スケジュール スキャン」をクリックしてします。引き出しのセットアップ ウィンドウでプレートの位置を決定する、追加の容器をクリックし、プレートの種類を選択します。スキャン セットアップウィンドウを選択または板実験設定に従ってスキャン パターンを編集し、標準としてスキャンの種類を設定します。</li>
		<li>タイムラインを右クリックし、間隔の設定を選択します。24 時間スケジュールで 2 h に追加スキャンすべてを設定します。適用をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 移行の試金のための播種密度最適のセルを決定します。
<ol><li>24 h 後スキャン Stop 合流点処理に自動的に収集される HD 位相コントラストの画像解析ツールを適用し、時間に対する細胞増殖曲線の生成します。
	<ol>
<li>3-6 代表的なイメージを決定し、新しいイメージのコレクションで配置します。</li>
		<li>処理定義として適切なマスクを決定します。</li>
		<li>分析ジョブを起動します。</li>
		<li>時間と合流点によると最適化された細胞密度を決定 (約 100% 合流 6 内遊走試験開始時に応じて-18 h)。 注:合流する細胞の成長にかかる時間の量は、播種の希釈によって異なります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 日 1 と 2: 移行と侵略の試金のための準備
<ol><li>
1 日目に浸潤アッセイ用プレートをコートします。 注: ECM ゲルは、一晩冷蔵庫の中に配置されているヒントと氷の上常に処理する必要があります。<ol>
<li>ECM ゲルを 100 μ g/mL の冷たい培地を希釈し、指定されたウェルに希釈した ECM ゲル/メディアの 50 μ L を追加します。</li>
		<li>場所標準的な培養条件でプレートを一夜します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 日目、優しく余分なメディアを吸い出しなさい。(現在のプロトコルの最適化された播種密度で午後遅くに移行の試金 (コーティング) のための指定 2 の 96 ウェル プレートと次のセクション 1-3 トリプリケートで (コーティング) 浸潤能の測定に最適化された細胞密度と細胞をプレートします。ZR75-1 と MDA MB 231 90,000/ウェルと 50,000/まあ、それぞれでした)。</li>
	<li>標準培養条件にプレートを一晩置きます。</li>
</ol>6. 3 日目: 傷傷
<ol><li>スプレーでスクラッチ ツールと 2 キャビネット、バイオ セーフティにそれらを置く前に 70% のエタノールのボートを洗って拭きます。正確 45 ml の滅菌 (オートクレーブ) 蒸留水と 70% のエタノールの洗濯船 1 と 2 をそれぞれ入力します。</li>
	<li>殺菌、洗浄 5 分の 1 と 2 のボートのスクラッチ ツール ピン ブロック (上) を配置します。</li>
	<li>
移行アッセイ プレートを始めます。
	<ol>
<li>インキュベーターから細胞を含むプレートを移動し、スクラッチ ツールの損傷を防ぐため乾燥井戸がないかどうかを確認します。プレート カバーを取り外しますとスクラッチ ツールのベース プレート ホルダーに挿入し、ダボを導くことによって基本の部分に上の部分を慎重に配置。黒いレバー キーを押しながら一方 pin ブロックを慎重に持ち上げます。各ウェル内のギャップが肉眼および顕微鏡下で通常表示されます。</li>
		<li>すぐに水でピンを浸すこれはプレートの設定が同じ場合、浸潤アッセイ プレートをスクラッチ前にスクラッチ ツールをきれいにするための十分なです。それ以外の場合、5 分間滅菌蒸留水とし、70% エタノール殺菌手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗浄剥離細胞または細胞を避けるために予め温めておいた文化メディアでプレート 1 または 2 回は、井戸に再アタッチ シートします。</li>
	<li>指定された井戸または治療せずに新鮮な暖かいメディアの 100 μ L を追加します。</li>
	<li>
浸潤能の測定のための追加の手順です。
	<ol>
<li>均衡を取って、慎重に冷たいメディアを吸引に 5 分間、4 ° C で浸潤アッセイ プレートを配置します。</li>
		<li>ECM ゲル 5 mg/mL に冷えた培地を希釈指定井戸に希薄の ECM ゲルの 50 μ L を追加し、30 分の標準的な孵化の下に置きます。</li>
		<li>化合物をテストすることがなくウォーム アップ メディアの 100 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>生細胞の撮像素子にプレートを置き、5 分 imagelock プレートとして容器の種類を選択の平衡それ。スクラッチ傷としてスキャンの種類を設定選択または板実験設定 (1 画像/ウェルとワイドモード) に従ってスキャン パターンを編集し、スキャンをスケジュール設定 24 時間繰り返し 72 時間ごとの 1-2 時間の傷が癒されるまで。</li>
	<li>5 分: 0.5% 洗剤 1 の次のソリューション (ボートの洗浄に 45 mL) の各トップ ピンのブロックを置くスクラッチ ツールをきれいにする (材料の表を参照)、1% 洗剤 2 (材料の表を参照してください)、滅菌蒸留水と 70% エタノール。埃のない環境で、ベース プレートと店に戻ってスクラッチ ツールを配置します。</li>
</ol>7. データ解析
<ol><li>引き出しセットアップ板の実験を選択、容器の削除をクリックしてすべての傷が癒された後に指定されたプレートをスキャンを停止します。</li>
	<li>傷が行われた後、創傷閉鎖 10% と 50% の画像権利を含む音の割合の範囲にまたがる 3-6 代表的な画像を収集します。</li>
	<li>適正処理の定義を調べるには、セグメンテーション調整、クリーンアップとフィルターを使用して適切なスクラッチ傷マスクと合流マスクを適用します。電流/すべてのプレビューを使用すると、マスクの精度を表示できます。</li>
	<li>分析ジョブを起動します。</li>
	<li>データをソフトウェア内で分析またはさらなる分析のためにエクスポートすることができます。HD 位相画像を評価するソフトウェアによって提供される 3 つのメトリックを使用できます: 傷傷の幅 (μ m)、合流 (%) および相対的な傷密度 (%)。比較は、次のセクションで説明します。</li>
</ol>

<ol><li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li>
<li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li>
<li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%3A+markers+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li>
<li>Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx">http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx</a> (2012).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215(2011).</li>
<li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

移行と侵略は、癌細胞の移動を評価する重要なパラメーターです。96 ピンのスクラッチ ツールを使用して、2 D と 3 D の試金を同時に治癒を行うことが可能です。別に自動スキャンを促進する、最小限の中断で安定的な培養環境を提供する 96 ピンのスクラッチ ツールを用いてスクラッチ試験提供一貫したスクラッチ傷より堅牢な実験を有効にして再現できます。96-well 版のフォーマットは、細胞または別の薬剤の処置数の増加いずれかの追加のオプションを提供します。さらに、細胞の形態変化とダイナミックな動きは、さらに分析の記録できます。
移行/浸潤アッセイは、いくつかの前提条件を簡単に適用できるように設計されています。コンフルエントの細胞膜は、ギャップに指示細胞運動を確保するため負傷する前に重要です。したがって強くお勧め播種密度、セルを最適化するために、6-18 h の間の時間枠は通常理想的です。表面と増殖率に取り付ける実験細胞の能力はこの期間に影響を与えます。長時間インキュベーション時間が強い細胞接着につながるし、細胞シートの除去のための曲がった両側セル面を生成します。ニッピバイオ マトリック...

細胞の遊走と浸潤は、創傷閉鎖、胎盤の子宮と乳腺形態1,2,3への侵入など、人間の体の正常な機能を可能にする重要な生物学的プロセスです。人間の体はこれらの生物学的イベントの正確かつ厳格に管理ただし、いくつかの例外があります。悪性腫瘍、たとえば、このセーフガードを脱出し、異常増殖を示す転移と呼ばれる、周辺の組織に侵入することが。転移は癌関連死亡率4の主要な原因です。
乳がんは、最も一般的女性の癌を診断され、先進国世界5の女性の間で癌関連死の 2 番目に高い原因です。乳がんは、ダクトや小葉の上皮細胞の 1 つまたは複数のレイヤーで構成されるから起きる。通常の乳房の上皮細胞は互いと E-カドヘリンやインテグリン6などの膜蛋白質を介して基底膜に付着します。しかし、浸潤性乳癌細胞の極性や細胞接着を失っている古典的な上皮間葉転換 (EMT) を受けるし、移動する能力を得る。血管外漏出後、これらの細胞は細胞外マトリックス (ECM) の間で移動し、血管やリンパ系、それから続いて intravasation と転移の成長7を入力します。これが発生するメカニズムを理解することが重要、以来、転移癌関連死亡の最も一般的な原因し、密接に関連してがん細胞の移行/侵略。がん細胞の動きを可視化、移行と浸潤アッセイ、2 D と 3 D の細胞運動をそれぞれ研究に理想的なモデルです。移行は直接侵入、微小環境と生物学的障壁を低下させる能力との相互作用を含むに対し、細胞の運動を評価します。移行は侵略の要件として 2 つのプロセスは、互いに完全に独立しています。
移行と侵略を研究するいくつかの方法が開発されています。フェンスとマイクロ キャリア ・ アッセイが領域の変化を評価するセルを移動できるように携帯無料領域を生成として Kramer ら、創傷治癒など移行アッセイによって一方、transwell と毛細血管のアッセイは、誘引8に向かって移動するセルの数に基づいています。ECM 環境は例えば、ECM ゲルやコラーゲンを設定する、浸潤アッセイと侵攻エリア、距離、セル数 (例えば transwell 試金、カモノハシの試金) を監視することによって 3次元の動きを評価する8。浸潤能の測定の別のタイプは、非侵襲的な細胞の侵襲性のセルを結合し、侵襲的な細胞の行動を評価する (例: 回転楕円体試金)。上記の方法の長所と短所と簡単にアプローチを繰り返して、移行アッセイを結合する簡単な方法があるし、似たようなワークフローの浸潤能の測定は実験的なデザインで優遇。
このプロトコルでは、細胞の遊走と浸潤細胞の撮像素子を使用しての測定について説明します。標準細胞文化のインキュベーターでインストールされているシステムを監視リアルタイム細胞です。スキャン間隔と測定セルまたは蛍光体に適切なマスクを適用することによって設定によると高精細画像がかかります。96 ウェル プレートに細胞膜上に均一なひっかき傷を作りに適した 96 ピンのスクラッチ ツールを使用して移行・浸潤アッセイのモジュールが含まれます。機構は、体外傷癒しの試金、プラスチックや塗装面に 2次元細胞運動の監視に基づいています。侵略やスクラッチ傷内追加 ECM 間で 3次元の動きも評価することができます。簡単なワークフローを図 1に示します。

<table><tbody><tr><td>0.5% トリプシン-EDTA 溶液 (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Countess II FL で</td> 2x に希釈 自動セルカウンター <td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>洗剤 1 (Alconox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985</td><td>0.5% 使用濃度</td></tr><tr><td>洗剤 2 (Virkon S)</td><td>VetProduct DIRECT</td><td></td><td>1% 使用濃度</td></tr><tr><td>ダルベッコs Modified Eagle Medium, no phenol-red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>10% FBS, 200 mM L-グルタミン, 2 &mu;g/ml インスリン</td></tr><tr><td>ECM ゲル (マトリゲル)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909</td><td>成長因子低減、フェノールレッドフリー</td></tr><tr><td>Essen ImageLock 96 ウェルプレート、平底</td><td>Essen</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>EVE カウンティングスライド</td><td>BioTools</td><td>EVS-50</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 96ウェルスクラッチ創傷細胞浸潤アクセサリー</td><td>Essen</td><td>4444</td><td>CoolBox、2x CoolSink</td></tr>を含む <tr><td>IncuCyte細胞移行キット</td><td>Essen</td><td>4493</td><td>96ウェルピンブロック、2xウォッシュボート、ソフトウェアを含む</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>エッセン</td><td></td><td>ライブ細胞解析システム</td></tr><tr><td>インスリン溶液 ヒト</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液 (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030-091</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ、75 cm2成長領域</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr></tbody></table>

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

がん細胞移動は転移の開始にとって重要です。したがって、細胞運動と侵襲的な容量の調査は意義があります。移行の試金は浸潤アッセイは、生体内でがん細胞外れて元のサイトの真似をして細胞外マトリックスを介して侵入、もっと生理学的関連に対し 2 D レベルで細胞運動の基本的な洞察力を提供します。現在のプロトコルは、移行および侵略の試金のための単一のワークフローを提供します。一緒に統合された自動顕微鏡カメラ リアルタイム HD 画像と内蔵の解析モジュールのため、それは研究者、時間の効率的なシンプルで再現性のある実験的なオプションを提供します。このプロトコルには、消耗品の置換とから選択するユーザーのための代替手法も含まれています。

この移行・浸潤アッセイは、96 ピン スクラッチ ツールによって作成された無料のセル領域に移動細胞の率を評価する創傷治癒アッセイに基づいています。移行と浸潤アッセイの違いは、移行がメジャーのセル処理培養プラスチック表面との侵略対策細胞の ECM ゲルを渡って移動を試金。
スクラッチ ツールは、指定されたプレートに一貫性のあるスクラッチ傷をように設計されています、住セルイメージ イメージャが途中でひっかき傷とリアルタイム高解像度画像を撮影する設計されています。2 つの乳房のがん細胞の現在のプロトコルで使用する線は、ZR75 1 および MDA-MB-231、内腔 B として分類し、トリプル ネガティブ サブタイプそれぞれ9。96 ピン スクラッチ ツールによって生成されたスクラッチ傷一般 700 900 μ m の間が異なる細胞 (図 2) の間で...

現在のプロトコルでは、がん細胞の遊走とリアルタイムで単一のプラットフォームに侵略を調査、細胞の移動と形態の勉強を簡単に再現できると時間効率の良いオプションを提供する統合的な手法について説明します。

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

癌細胞の移動は転移の開始に重要である。したがって、腫瘍細胞の細胞の動きや侵襲能の調査は大きな関心事である。この統合されたがん細胞の移動と浸潤を、単一のプラットフォーム上でリアルタイムで調査する統合された方法は、細胞の移動性と病理を研究するための容易に再現可能で時間効率の高いオプションを提供します。この方法は、細胞外マトリックスを介して癌細胞浸潤に関する洞察を提供し、他の細胞タイプに適用することができる。最適なスクラッチ時間を達成するために、シード密度が最適化されていることを確認し、細胞単層が合流率100%に達した後、インキュベーション期間を延長しないでください。移行アッセイに最適なシードセル数を決定するには、細胞を密度の範囲内に 96 壁プレートに 3 倍に配置します。プレートをライブ セル イメージャーに配置し、イメージャー ソフトウェアのタスク リストからスケジュール スキャンを選択します。引き出しの設定ペインで、プレートの位置を決定し、[容器を追加]をクリックしてプレートタイプを選択します。スキャンのセットアップ ペインで、実験版の設定に従ってスキャン パターンを選択または編集し、スキャンの種類を標準として設定します。タイムラインを右クリックし、間隔の設定を選択します。次に、24時間ずつ[スキャンを追加]を2時間に設定し、[適用]をクリックします。24時間後、引き出しのセットアップを開いて実験プレートを選択し、容器を取り外します。3 ~ 6 個の代表的なイメージを選択し、新しいイメージ コレクションに配置します。適切な処理定義を決定するには、セグメンテーション調整、クリーンアップ、およびフィルターを使用して適切な合流マスクを適用し、プレビュー電流 all'を使用してマスクの精度を表示します。移行アッセイの開始時期に応じて、6~18時間以内に、時間に対する約100%の合流に従って、分析ジョブを起動し、最適化された細胞密度を決定します。次に、合流処理解析ツールを、時間に対して細胞増殖曲線を生成するために自動的に収集された高精細位位相コントラスト画像に適用する。アッセイを開始する前に、浸潤アッセイ用プレートを50マイクロリットルの細胞外マトリックスゲルでコーティングし、氷冷細胞培養培地で希釈し、1ミリリットル当たり100マイクログラムにします。次いで、細胞培養インキュベーターにプレートを一晩入れる。翌日の午後、余分な培地を穏やかに吸引し、細胞を最適化された密度で、三重化して、細胞外マトリックスコーティングされたプレートの適切な井戸に、そして追加のコーティングされていない96ウェルプレートにプレートします。次いで、細胞培養インキュベーターにプレートを一晩入れる。翌朝、塗装されていない移動アッセイプレートをスクラッチツールのベースプレートホルダーに入れ、導くダボを使用してホルダーの上部を慎重にベースに置きます。慎重にピンブロックを持ち上げて傷を作りながら、黒いレバーを押し、保持します。各井戸の傷は、顕微鏡の下だけでなく、肉眼で見える必要があります。次いで、プレートを予め温めた培養培地で1〜2回洗浄し、脱離した細胞または細胞シートを除去する。侵略アッセイのために、ちょうど実証したようにコーティングされたプレートを傷つける。切り離された細胞とシートを取り除いた後、冷たい媒体を慎重に吸引する前に、冷たい4°Cでプレートを5分間平滑にするために冷やした冷たい箱を使用してください。次に、希釈した細胞外マトリックスゲル50マイクロリットルを適切なウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに30分間入れます。気泡は細胞外マトリックスゲルを使用する場合によく見られますが、70%エタノールを吸引することで除去できます。次に、100マイクロリットルの新鮮な、暖かい媒体を、試験化合物の有無にかかわらず、移行または侵入アッセイプレートの適切なウェルに加え、ライブセルイメージングプラットフォームにプレートを配置します。スクラッチツールをクリーニングするには、上部のピンブロックを、5%の洗剤1個、洗剤2個、滅菌蒸留水2個、滅菌蒸留水、または70%エタノールを含む個々の45ミリリットルの洗浄ボートに入れ、スクラッチツールをベースプレートに戻して、ほこりのない環境に保管します。創傷アッセイを撮像するために、プレートを5分間平衡させた後、画像ログ面として容器タイプを選択し、スキャンタイプを傷傷として設定する。実験プレートの設定に従ってスキャンパターンを選択または編集し、72時間、または示したように傷が治癒するまで、1〜2時間ごとに24時間の繰り返しスキャンをスケジュールします。すべての創傷が治癒したら、スキャンを停止し、創傷が行われた直後の画像を含む音の割合の範囲にまたがる3〜6つの代表的な画像を選択し、創傷を10%と50%で閉鎖する。適切な処理定義を決定するには、適切な傷巻きマスクと合流マスクを例示に適用し、プレビュー電流を使用してマスクの精度を表示します。次に、分析ジョブを起動します。移動アッセイでは、創傷幅は創傷の横にある細胞シート間の平均距離である。創傷合流は、傷ついた領域内の合流点である。理想的な初期創傷合流はゼロ%に近いはずです。相対的な創傷密度および創傷合流は、傷の傷領域を占める細胞の速度を示唆する。これらのデータは、これらの代表的なセルラインの両方でほぼ重複しています。異なる細胞株は、非常に異なる創傷治癒能力を示し、細胞株間の異なる回遊能力を示す。例えば、ラメリポディアは、移行の開始時に移行前線でこの乳房腺癌細胞株において観察されるが、このムチン1産生乳癌細胞株は同時に細胞移動の兆候を示さなかった。また、乳房腺癌線の相対創傷密度は50時間後に飽和したが、一方、ムチン1産生乳癌細胞株の相対創傷密度は経時変化しなかったのに対し、腺癌細胞の侵襲性の高い表現型および非侵襲性を強調する1産生乳癌細胞。腺癌細胞はまた、細胞外マトリックスゲルを介して侵入しながら異なる振る舞い、一流の突起を有する細長い形態を実証し、移行アッセイでは、移行前線のブレブを視覚化した。めっきする場合、播種する細胞が少なすぎると傷が正しく形成されず、播種された細胞が多すぎると過密状態になることを覚えておいてください。この手順に従って、トラック治療を追加することができ、この方法をハイスループットトラックスクリーニングに適応させることができます。この方法により、研究者はこれらのアッセイを高スループットである単一のプラットフォームで実行することができ、研究者は実験エンドポイントではなくリアルタイムで細胞を監視することができます。スクラッチツールの殺菌に使用する消毒剤は危険である可能性があります。関連する MSDS と施設の通常のトリガーラインに従って、ソリューションを収集して廃棄してください。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ここで、我々は、マウスの足蹠にホーミング白血球を研究する非侵襲的二光子（2P）顕微鏡のアプローチを説明します。私たちは、組織イメージングの準備の技術的側面を議論し、実行してデータ収集するための初期設定から典型的な実験を通してリーダーを歩く。...

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

がん幹細胞の移動を調査するための区分するマイクロ流体デバイスが記載されている。この小説のプラットフォームは、生存細胞の微小環境を作成し、生細胞運動の微視的な可視化を可能にします。非常に運動性のがん細胞は、潜在的に、より効果的な将来の治療法につながる積極的な浸潤の分子メカニズムを研究するために隔離されています。...

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

このメソッドは、実時間、速度、変位、速度など、さまざまな細胞への移行パラメータの定量的測定の細胞のモニタリングが可能になります。従来の方法とは異なり、このリアルタイムのアプローチは、エンドポイントの定量的な移行の測定値に基づいてされていません。代わりに監視し、継続的にさまざまなパラメータを計算することができます。...

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

このような細胞遊走などの細胞プロセスは伝統的に二次元、硬いプラスチックの表面に研究されている。このレポートは、直接タンパク質の局在を可視化し、より生理学的に関連する、三次元マトリックスに移行する細胞で蛋白質のダイナミクスを分析するためのテクニックを説明します。...

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。...

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。...

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

ソフトウェア ベースの後処理に続いてタイムラプス ビデオ顕微鏡による神経の人口を監視するための堅牢なプロトコルを説明します。このメソッドは、ライブ...

ライブ イメージング モニター細胞生物学および複数の神経集団の血統で、進行を追跡 1 つのセルに続いて

ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。...

スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、流れを自分の移行パスを再定位せん断流の力に対応します。このプロトコルは、記録し、流体工学ユニット、ポンプ、顕微鏡イメージング システム、フリー...

生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析

この研究は、小児びまん性正中線グリオーマ細胞株に適用される生3D細胞免疫細胞化学のプロトコルを提示し、3D細胞の浸潤や遊走などの動的プロセス中の原形質膜上のタンパク質の発現をリアルタイムで研究するのに役立ちます。...

小児びまん性正中線神経膠腫の生3D細胞免疫細胞化学アッセイ

このプロトコルは、一次マウスT細胞の単離および特定の環境条件下でのT細胞遊走のタイムラプス顕微鏡法を定量的分析とともに提供します。...

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

学ぶ、自動生細胞固体撮像素子を用いたがん細胞の移行と侵襲のリアルタイム解析法。この再現性の高い効率的な手法により、細胞の運動性と形態学的変化を詳細に観察し、転移メカニズムの理解に貢献します。

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

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