フルオレセインイソチオシアネート-ポリスクロースを用いたマウスにおける糸球透過性の高感度測定 70

この方法は、腎臓病における糸球体透過性の役割に関する腎臓学分野の主要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、蛍光鉛標識トレーサーを用いて、糸球体透過性の小さな一過性の増加が検出される点である。麻酔後、雌マウスに尿カテーテルを入れる。

マウスを下振れ状態に置きます。下腹部を締め、尿道オスチウムを見つけます。22G血管カテーテルのカテーテルのプラスチック部分を入手し、キシロカインゲルで潤滑します。

左人差し指を使って下腹部に慎重な張力を入れ、遠位尿道軸を平行しながらカテーテルを3ミリメートル尿道オスチウムに導入します。尿道オスティウム内の先端を維持し、尿道の軸を維持することにより、血管カテーテルの上部を180度回します。次に、カテーテルをさらに7ミリメートルマウスに導入し、膀胱内に置きます。

1.5ミリリットルの茶色のチューブを血管カテーテルの上に置き、尿を採取します。尿の生産を高めるために皮下0.9%の塩化ナトリウムの1ミリリットルを適用します。マウスの首を剃り、外科医に向かって頭で債務に置きます。

ハイパーはテープでマウスの頭を伸ばす。70%イソプロパノールで首を消毒する。トゥイザーとハサミを使用すると、顎の下に5ミリメートルの皮膚切開を行います。

胸骨の真ん中に達するまで、胸骨の方向に約1センチメートルの皮膚を切断します。はさみを使用してください。首の右側に皮膚を慎重に解剖します。

首の軟部組織を露出させるために右に皮膚の長方形の切開を行います。頸静脈を損傷しないように注意してください。はさみとトゥイザーを使用して、2つのクランプで皮膚のフラップを固定します。

細かいツイーザーの先端を使用して、鈍い調製によって頸静脈を慎重に露出させる。必要に応じて、細かいはさみで組織を取り除きます。静脈の枝の損傷を避ける。

マウスの頭に向かって見える頸静脈の遠位部分に絹糸で合字を置いて閉じます。合字に緊張を入れるテープでシルクの糸を固定します。これは頸静脈のわずかな緊張を保障する。

頸静脈の近位部分の周りに合字を準備します。その後、カテーテルを平衡融解と融合液で満たします。カテーテルが頸静脈を揃えるように、カテーテルをテープで固定します。

空気塞栓症を避けるために気泡の制御。挿入部位で細かいピンセットで頸静脈を持ち上げます。管を頸静脈に平行に位置合わせし、管腔を目指す頸静脈を穿刺する。

頸静脈の軸線と平行に約2~4ミリメートル挿入します。活発な動きを避けてください。合字を閉じてカテーテルを固定します。

顕微鏡を通して注意深く見ることによって合字の締まりのための制御。手術の部位の上に湿った綿棒を置きます。マウスが後尻尾に置かれながら、マウスの尻尾の底に尾の袖口を置きます。

測定を開始し、時間ポイントごとに 10 回繰り返します。血圧測定が正しくないと思われ、誤ったデータが生成される場合は、テールカフの位置を調整します。平衡段階の前に、尿採取管を交換し、氷の上に置きます。

綿棒を折り畳み、頸静脈に導入された小さな血管カテーテルの周りに置きます。逆行血流または空気塞栓症を廃止するために綿棒の上にクランプを置きます。27Gの針をFITCボーラスで満たされた1ミリリットルの注射器と小さな容器カテーテルの端に接続します。

クランプを開き、100マイクロリットルFITCボーラスを塗布します。クランプをもう一度閉じて、より大きなカテーテルを小さいカテーテルと接続します。クランプを再度開き、毎分0.008ミリリットルの流量でシリンジポンプを始動します。

注入を60分間続けます。この段階では、糸球体のパーマ選択性に対する有効な薬剤を調査する。尿管のフォームタイムポイントをゼロ分に変更して、別の1.5ミリリットルの茶色のチューブにします。

小さな容器カテーテルの周りに綿棒を置き、小さな容器カテーテルから大きなカテーテルを取り外します。シリンジを実験段階溶液で満たします。注射器ポンプに入れ、注入ポンプを実行させて、大きなカテーテルが実験相溶液で満たされるようにします。

空気塞栓症を避けながらカテーテルを再接続し、クランプを再度開きます。1分間に0.008ミリリットルの流量でシリンジポンプを開始します。注射器ポンプを60分間継続し、尿管内で尿を採取する。

尿管を氷の上に置きます。本研究では、ネイティブマウス尿の蛍光スキャンは395ナノメートルでピークを示す。FITCポリスクロース70は、マウス尿中の1ミリリットル当たり40マイクログラムの濃度で、525ナノメートルで最大蛍光を示す。

マウス尿はFITCポリスクロース70の蛍光測定を妨げない。FITCポリスクロース70の濃度を増加する525ナノメートルの入院時に、蛍光強度の増加を示す。この方法は、糸球体透過性の違いを検出することもできる。

白いカラムは、実験段階におけるアンジオテンシンII刺激の開始前のFITCポリスクロース70レベルを表す。60分間の投与後、糸球体透過性は対照群と比較して増加した。アンジオテンシンIIは、球状透過性の低下を洗い流す。

FITCポリスクロース70レベルは、アンジオテンシンII刺激の追加60分後またはアンジオテンシンII洗浄の60分後に減少した。アンジオテンシンIIによる糸球体透過性の増加は、アンジオテンシンII受容体遮断薬によって遮断され得る。テールカフ法によってモニタリングされた血圧は、対照群とアンジオテンシンII治療群との間に有意な差を示さなかった。

この手順を試みる間、輸液溶液を変更する際に空気塞栓症を避けるために重要です。