Name: フルオレセインイソチオシアネート-ポリスクロースを用いたマウスにおける糸球透過性の高感度測定 70 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶマウスにおける糸球透過性の高感度測定法。FITC-ポリスクロース70を用いた蛍光トレーサーによる非放射性検出で、少量尿での繰り返し測定が可能な腎臓病研究の新手法です。

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著者らは、クリスティーナ・シュヴァント、ブランカ・デュヴンジャク、ニコラ・クルに対し、卓越した技術支援と、蛍光スキャンに関する彼の助けに対するデニス・ソーン博士に感謝しています。この研究は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG)SFB 612 TP B18のL.C.R.およびL.S.への助成金によって支えられた。資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持ちはありませんでした。

調査は、実験動物のケアと使用に関するガイド(米国国立衛生研究所第85-23号、1996年改訂)に記載されたガイドラインに従って実施されました。すべての動物実験は、関連する機関の承認に従って行われました(州政府ランデサムト・フュル・ナチュラル、ウムウェルト・ウンド・ヴェルブラウチャーシュッツ[LANUV]参照番号84-02.04.2012.A397)。
1. 機器、ソリューション、機器の準備
<ol><li>0.9%の滅菌塩化ナトリウム(NaCl)でFITC-ポリスクロース70を10mg/mLの最終濃度(すなわち、NaClの10mLで100mg)に再構成する。</li>
	<li>透析FITC-ポリスクロース70溶液は、4°Cで一晩フリーFITC分子を除去する(分子量遮断[MWCO]10,000)。一定の撹拌下でFITC-ポリスクロース70の10mL当たり0.9%の無菌NaClの1Lを使用してください。光から守る。透析FITC-ポリスクロース70をアリコートし、-20°Cで保存する。</li>
	<li>FITC-ポリスクロース70ボルスの場合は、10mg/mL FITC-ポリスクロース70溶液の4 μLを0.9%NaClの996 μL(FITC-ポリスクロース70:40 μg/mL)に加えます。</li>
	<li>平衡注入液の場合、10mg/mL FITC-ポリスクロース70溶液の20 μLを0.9%の無菌NaClの9.98 mLに加え、最終的な濃度20μg/mLにします。</li>
	<li>実験溶液の場合、注入液に薬物または物質を添加する(例えば、アンジオテンシンII[Ang II][100 ng/kg/min])を25gマウス用に、1mM溶液のAng IIの3 μLを添加する。</li>
	<li>手術のために、1つの剃り具、2つの外科クランプ、外科はさみの1組、2つのピンセット、2つの細かいピンセット、1組の細かいはさみ、および綿棒を準備する。ライゲーション手順のために2本の10cmシルク糸(4-0~6-0)を準備します。</li>
	<li>中央静脈カテーテルの配置のために、21 G針で10 mLシリンジを準備する。針の先端を長さ30cmのカテーテル(内径[ID]0.58mm)に入れておきます。0.58 mm カテーテルを 10 cm カテーテルに接続します(ID は 0.28 mm)。小さいカテーテル斜めの先端を切り、頸静脈に導入される鋭い先端を作成する。</li>
	<li>麻酔を調出す(すなわち、経皮麻酔ケタミン、体重100mg/kg、キシラジン、体重5mg/kg)を調出す。</li>
	<li>針を捨て、先端からカテーテル1cmをマーキングすることにより、22Gアンジオカテーテルを準備します。加熱パッドを37°Cに予熱します。</li>
	<li>血圧装置を準備し、必要に応じて血圧測定膜を変更します。</li>
</ol>2. 準備段階
<ol><li>尿カテーテル 注: セクション 2.1 は、Reis ら 7.で説明したプロトコルに従います。図1および補足図1は、雌マウスにおける尿カテーテルの配置を示す。<ol>
<li>ケタミン/キシラジンでマウスを麻酔する(ステップ1.8参照)。適切な麻酔を確認するためにつま先ピンチテストを使用してください。麻酔を維持するために、60分後に麻酔(例えば、投与量の半分)を繰り返し、つま先のピンチテストが反射的な引き出しをもたらさない場合に適切な麻酔が確認される。 注:このプロトコルではメスFVBマウスが使用される。</li>
		<li>マウスを37°Cの加熱パッドに後膜の再組み立てに置きます。下腹部を締め、尿道骨(例えば、顕微鏡下)を見つける。</li>
		<li>22Gアンジオカテーテルのカテーテルのプラスチック部分を使用し、キシロカインゲルで潤滑します。遠位尿道軸を平行にしながら尿道骨に3mm入れ注意深く導入する(図1A)。</li>
		<li>尿道骨内に先端を保ち、尿道の軸を維持することにより、アンジオカテスター180°の上部を回します(図1B)。</li>
		<li>カテーテル7mmをさらにマウスに入れ、膀胱内に入れられるようにする(図1C)。カテーテルを抵抗を超えて強制しないでください。抵抗が感じられた場合は、最初からカテーテルの位置を修正します。尿カテーテルの位置が正しい場合、尿は既にカテーテル内に現れる可能性があります。</li>
		<li>1.5 mLの茶色のチューブをアンジオカテレータの上に置き、尿を採取します。尿の生産を高めるために皮下に0.9%NaClの1 mLを適用する。</li>
	</ol></li>
	<li>中央静脈カテーテル
	<ol>
<li>マウスの首を剃り、外科医に向かって頭で満たして置きます。テープでマウスの頭部をハイパーエクステンドします。</li>
		<li>70%イソプロパノールで首を消毒する。つまみとはさみを使って、顎の下に小さな皮膚切開(5mm)を作ります。胸骨の真ん中に達するまで、胸骨の方向に約1cmの皮膚をカットします。</li>
		<li>はさみを使って、首の右側の皮膚を慎重に解剖します。マウスの右側に皮膚の長方形の切開を行い、首の軟部組織を露出させます。はさみとツイザーを使います。2つのクランプでスキンフラップを固定します。 注:頚静脈は甲状腺の左側に沿って走るか、甲状腺の右葉によってわずかに覆われている。この手順の後、手術のために顕微鏡を使用してください。</li>
		<li>細かいインテッツァーの先端を使用して、鈍い準備によって慎重に頚静脈を露出させる。静脈枝の損傷を避けてください。 注:細かいはさみで組織を取り除く必要があるかもしれません。はさみを使用して組織を除去する場合は、出血のリスクが高まるので注意が必要です。</li>
		<li>目に見える頚静脈(マウスの頭部に向かって)の遠位部分にシルク糸(4-0~6-0)で合字を置き、閉じます。糸をテープで固定して合字に張力を入れ、頸静脈にわずかな張力を確保します。頸静脈の近位部分の周りに合字を準備します。</li>
		<li>カテーテルを平衡注入液(ステップ1.4参照)で充填し、カテーテルが頚静脈を整列するようにテープでカテーテルを固定します。空気塞栓症を避けるために気泡のための制御。</li>
		<li>挿入部位で細かいピンセットで頚静脈を持ち上げます(挿入部位は合字の1~2mm近位です)。チューブを頚静脈に平行に合わせます。内膜を目指して頸静脈を穿刺し、約2~4mmの挿入を行い、頸静脈の軸を平行にする。活発な動きを避けてください。</li>
		<li>合字を閉じてカテーテルを固定します。顕微鏡を通して注意深く見ることによって合字の堅さのための制御。手術の現場に湿った綿棒を置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>血圧測定
	<ol>
<li>マウスが後部のリカムに横たわっている間、マウスの尾の下部にテールカフを置きます。測定を開始し、1時間あたり10倍繰り返します。測定値から平均を作成します。</li>
		<li>血圧測定が正しくないと思われ、誤ったデータが生成される場合は、テールカフの位置を調整します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 平衡化段階
<ol><li>平衡化段階が始まる前に尿採取管を変更し、氷の上に置きます。</li>
	<li>21G針と大きなカテーテル(0.58mmのID)でFITC平衡相溶液で満たされた10 mLシリンジ(ステップ1.4参照)を導入し、シリンジポンプに入れておきます。</li>
	<li>綿棒を折りたたみ、頚静脈に導入される小器のカテーテル(0.28 mmのID)のまわりでそれを置く。綿棒の中にカテーテルを置きます。逆行性血流または空気塞栓症を廃止するために綿棒の上にクランプを置きます。27 G 針を FITC ボーラスで満たされた 1 mL の注射器で小容器カテーテルの端に接続します。</li>
	<li>クランプを開き、FITCボーラス(100 μL)を適用します。クランプをもう一度閉じ、より大きなカテーテルを小さいカテーテルに接続します。シリンジポンプを0.008 mL/min(0.480 mL/h)で起動します。注入を60分間続けます。</li>
</ol>4. 実験段階
注:この段階では、糸球体パーマ選択性に対する薬物の影響を調べることができる。
<ol><li>尿管(時時点0分)を別の1.5 mL茶色の管に変更します。小さい容器のカテーテルのまわりで綿棒を置き、ステップ3.3に示すようにクランプを閉じる。</li>
	<li>大きなカテーテルを小容器カテーテルから取り外します。注射器を実験段階ソリューションに変更します(ステップ1.5を参照)。大きいカテーテルが平衡溶液で満たされるように注入ポンプを動かしてみましょう。</li>
	<li>空気塞栓症を避けながらカテーテルを再接続し、クランプを再び開きます。シリンジポンプを0.008 mL/minで起動します。</li>
	<li>注射器ポンプを60分間動かし続け、その後尿管内に尿を回収する(尿60分)。尿管を氷の上に置きます。</li>
	<li>麻酔中に頸部脱臼によってマウスを犠牲にする。処分する前に、マウスが死んでいることを確認するために5分間観察されます。</li>
</ol>5. 尿分析
<ol><li>
蛍光測定
	<ol>
<li>尿プールを解凍し、リン酸緩衝生理食生(PBS)で1:10に希釈します。 注:尿プールは、代謝ケージ内の12-24時間の尿コレクションで健康なマウスから収集された尿のプールです。</li>
		<li>蛍光測定の基準を準備します。10個の茶色の1.5mLチューブを取り、ブランク(1:10希釈尿プール)と次のFITC-ポリスクロース70濃度(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、および160 μg/mL)にラベルを付けます。</li>
		<li>希釈尿プールのピペ246 μLを1.5mLブラウンチューブに入れ、FITC-ポリスクロース70ストック濃度の4μLを加え(ステップ1.1参照)、最終的な濃度を160μg/mL FITC-ポリスクロース70に得る。希釈された尿プールのピペ状100 μLを他のすべてのチューブに入れます。</li>
		<li>160 μg/mL FITC-ポリスクロース70チューブの100 μLを80 μg/mLチューブにピペッティングして1:2を希釈し、他の濃度を継続します。希釈された濃度の適切な混合物を保証する(例えば、継続する前にチューブを渦にすることによって)。</li>
		<li>希釈された尿プールでマウス尿サンプル(0分、60分)1:10を希釈します。</li>
		<li>各標準的なFITC-ポリスクロース70濃度のピペット5μLと、黒の384ウェルプレートに三重としてマウス尿サンプルの。気泡を避けるために、1,000 x gでプレートを15sで遠心分離します。</li>
		<li>プレートリーダーの384ウェルプレートを分析します。496 nmで励起を行い、525nmで蛍光を測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
クレアチニン測定
	<ol>
<li>製造元の指示に従ってください。簡単に言えば、100 mMクレアチニン標準溶液の10 μLを990 μLのクレアチニンアッセイバッファーで希水ミン標準溶液を希釈して10μLを希水ミン標準溶液を調べて、1mM標準溶液を調用します。</li>
		<li>1 mMクレアチニン標準溶液の0、2、4、6、8、および10 μLを96ウェルプレートに加え、それぞれ0、2、4、6、8、および10nmol/ウェル規格を生成します。各ウェルにクレアチニンアッセイバッファを追加し、体積を50μLにします。</li>
		<li>クレアチニンアッセイバッファーの42-44 μL、クレアチニンの2μL、クレアチニン酵素ミックスの2μL、クレアチニンプローブの2μLを加えて反応ミックスを調製します。ブランクの場合は、クレアチニンアッセイバッファーの44 μL、クレアチニン酵素ミックスの2μL、クレアチニンプローブの1-2 μLを使用します。</li>
		<li>96ウェルプレートの各ウェルに適切な反応ミックスの50 μLを加え、37°Cの水平シェーカーで60分間インキュベートします。インキュベーション中にプレートを光から保護します。プレートリーダー上の570 nmで吸光度を測定します。</li>
		<li>すべての読み取り値から空白の値を減算してクレアチニン濃度を計算します。結果は単位ナノモル/マイクロリットルを有する。クレアチニンの濃度にクレアチニンの分子量(113.12 ng/nmol)を掛け、単位ナノグラム/マイクロリットルを受け取ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. データ分析
<ol><li>標準曲線からFITC-ポリスクロース70尿濃度を計算します。</li>
	<li>代表的な尿試料中のクレアチニン濃度にFITC-ポリスクロース70尿濃度を参照してください。</li>
	<li>尿60分サンプルを対照および処置されたマウスの尿0分サンプルに参照する。</li>
</ol>

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<li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

提示された方法は、研究者がトレーサーを使用して非常に敏感な方法でマウスの糸球体透過性をテストすることを可能にする。この方法では、糸球体透過性の短期的な増加は、少量の尿のみを使用して診断することができる。この技術をうまくマスターするための最も重要なステップは、1)マウス手術、特に中枢静脈のカナンテーションにおける手動専門知識の開発、2)粘膜に害を与えることなく尿カテーテルを配置すること、および3)取り扱いに関する手動の専門知識です。サンプルの小さい容積が付いている384ウェル版。
中央静脈カテーテルを配置する場合、カテーテルが頸静脈に浸透しないことが不可欠である。浸透を避けるために、遠位合字(ステップ2.2.7を参照)で頸静脈に緊張を置き、細かいピンセットで頸静脈を持ち上げて頸静脈の内気を拡張することをお勧めします。挿入部位を小さく保つために、カテーテルを挿入している間グロスの動きを避け、余分なティッシュを取除くことによって外科分野の最もよい眺めを常に保障しなさい。尿カテーテルの配置の最も重要なステップは膀胱への最終的な挿入である。抵抗が感じられた場合は、粘膜に誤った痕跡や損傷を引き...

糸球体濾過バリア内の機能的または構造的欠陥は、アルブミンに対する糸球透過性を増加させ、尿中のアルブミンの検出(アルブミン尿)をもたらす。アルブミン尿は心血管の転帰を予測し、糸球体損傷1の重要なマーカーである。アルブミン尿の低レベルでさえ、正常範囲内に横たわって、増加した心血管リスク1に関連している。
生理学的条件下では、アルブミンは糸球体を通して濾過され、管状システム2、3でほぼ完全に再吸収される。マウスでは、尿中のアルブミンの検出は、通常、尿採取の24時間からアルブミン酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって行われる。24時間の尿採取またはスポット尿からの尿を使用すると、アッセイ感受性の問題のためにアルブミン濃度の小さな違いが見逃される可能性があります。したがって、ほとんどの研究者は、毒素、薬物、腎外科による強い腎損傷によってアルブミン尿が誘発される動物モデルを使用する。
したがって、糸球体透過性の小さくて一過性の変化を検出する敏感な方法の発見は、フィールドにとって非常に重要である。Rippeらは、蛍光標識トレーサー、すなわちFITC-ポリスクロース70(すなわち、FITC-Ficoll 70)をアルブミン4の大きさで適用することにより、糸球体透過性を試験するラットモデルを提示した。トレーサーアプリケーションは、糸球体透過性(数分以内)の短期的な変化のテストを可能にし、非常に敏感な4.2つの研究は、マウス5、6でトレーサー法を使用している。その利点にもかかわらず、この方法は、残念ながら、欠点を持っています:それは技術的に非常に複雑で、放射性、および侵襲的です。尿のさらなる分析は、ゲル濾過またはサイズ排除HPLC5、6を用いてのみ行う。
本論文では、蛍光標識FITC-ポリスクロース70を用いてマウスの糸球体透過性を測定する代替的、敏感、非放射性、および高速方法を提示する。経尿道カテーテルを導入することにより、尿採取は膀胱穿刺、尿道切除術、および上腹部カテーテル塗布よりも侵襲性が低く、少なくとも30分毎に尿採取が可能である。蛍光プレートリーダー。尿中のトレーサー濃度は、酵素クレアチニンアッセイを使用して尿中のクレアチニン濃度に正規化される。
したがって、この新しい方法は、糸球体透過性の増加と早期糸球体損傷を研究するための敏感なツールを提供しています。

<table><tbody><tr><td>Motic SMZ168 BL</td><td>マウス手術用</td><td>Motic</td><td>SMZ168BL</td>顕微鏡</tr><tr><td>KL1500LCD</td><td>Pulch and Lorenz顕微鏡</td> マウス<td>手術用</td><td>150500</td>ライト</tr><tr><td>Microfederschere</td><td>Braun、Aesculap</td><td>FD100R</td><td>細かいはさみ</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td><td>Braun、Aesculap</td><td>BC210R</td><td>首のカット</td></tr><tr><td>用 Anatomische Pinzette</td><td>Braun、手術用Aesculap</td><td>BD215R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PR&auml;parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>手術用&nbsp;</td></tr><tr><td>セラフレックス</td><td>セラグ ウィスナー</td><td>IC108000</td><td>絹糸</td></tr><tr><td>ケタミン 10%</td><td>メディスター</td><td></td><td>麻酔</td></tr><tr><td>ロンプン (キシラジン) 2%</td><td>バイエル</td><td></td><td>麻酔</td></tr><tr><td>ファインボア ポリエチレン チューブ ID 0.28mm OD 0.61mm</td><td>Portex</td><td>800/100/100</td><td>カテーテル</td></tr><tr><td>ファインボア ポリエチレン チューブ ID 0.58mm OD 0.96mm</td><td>Portex</td><td>800/100/200</td><td>カテーテル</td></tr><tr><td>ハーバード装置11プラス</td><td>ハーバード装置</td><td>70-2209</td><td>シリンジポンプ</td></tr><tr><td>BDインサイトオートガード</td><td>BD</td><td>381823</td><td>&nbsp;尿道カテーテル</td></tr><tr><td>マルチモード検出器 DTX 880</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>プレートリーダー</td></tr><tr><td>384ウェルマイクロタイタープレート</td><td>Nunc</td><td>262260</td><td>384ウェルプラット</td></tr><tr><td>クレアチニンアッセイキット</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>MAK080</td><td>クレアチニン濃度を測定する</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Nunc</td><td>260836</td><td>クレアチニンアッセイ&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC標識ポリサクロース 70</td><td>TBD コンサルタント</td><td>FP70</td><td>FITC-ficoll</td></tr><tr><td>アンジオテンシンII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td>糸球体透過性の試験に使用</td></tr><tr><td>BP-98A</td><td>血圧測定用</td><td>ソフトロン</td><td></td></tr><tr><td>OTS 40.3040</td><td>Medite</td><td>01-4005-00</td><td>マウス手術用加熱プレート</td></tr><tr><td>Instillagel 6mL</td><td>Farco-Pharma GmbH</td><td></td><td>尿道カテーテル</td></tr><tr><td>Exacta</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>シェーバー</td></tr></tbody></table>

フルオレセインイソチオシアネート-ポリスクロースを用いたマウスにおける糸球透過性の高感度測定 70

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

尿中のアルブミンの損失(アルブミン尿)は、心血管の結果を予測します。生理学的条件下では、少量のアルブミンを糸球体で濾過し、吸収限界に達するまで管状系で再吸収する。病理学的アルブミン濾過の早期増加は、したがって、アルブミン尿を分析することによって見逃されがちである。したがって、糸球体パーマ選択性をテストするためにトレーサーを使用することは有利と思われる。蛍光標識標識フッ素イソチオシアネート(FITC)-ポリスクロース(すなわち、FITC-Ficoll)は、糸球体透過性を研究するために使用することができる。FITC-ポリスクロース分子は糸球体によって自由に濾過されるが、管状系では再吸収されない。マウスおよびラットにおいて、FITC-ポリスクロースは、技術的に複雑な手順(すなわち、放射性測定、高性能液体クロマトグラフィー[HPLC]、ゲル濾過)を用いて糸球体透過性のモデルで調査されている。我々は、マウスにおけるFITC-ポリスクロース70(アルブミンのサイズ)に対する糸球透過性の早期および小さな増加をテストするために、FITC-ポリスクローストレーサーベースのプロトコルを改変し、促進した。この方法は小さい尿容積(5 μL)の反復的な尿の分析を可能にする。このプロトコルは、トレーサーFITC-ポリスクロース70が静脈内に適用され、尿が単純な尿カテーテルを介して収集される方法に関する情報を含む。尿は蛍光プレートリーダーを介して分析され、尿濃度マーカー(クレアチニン)に正規化され、技術的に複雑な手順を回避します。

図2に示すように、マウスにおける糸球体透過性を試験する方法は、3つの段階で構築されている。第1段階は、尿カテーテルと中央静脈カテーテルが置かれる調製段階と呼ばれる。第2段階は平衡化段階と呼ばれ、FITC-ポリスクロース70の静脈内ボーラス注入から始まり、続いてFITC-ポリスクロース70を60分間連続注入する。最後のフェーズは実験段階と呼ばれます。この段階では、FITC-ポリスクロース70の注入が継続され、薬物または他の物質が球体透過性に影響を与えるため試験することができる。尿は各段階の終わりに集される。
このトレーサーモデル内の糸球体透過性を調べるためには、粘膜を傷つけずに尿カテーテルを適切に配置することが不可欠です。女性のマウス膀胱への尿カテーテルの配置を図1で示す。カテーテルは尿道骨に3mm入れられ、頭蓋尿道軸と平行である(<s...

ここでは、高感度で非放射性トレーサーを用いてマウスの糸球体透過性を試験するプロトコルを提示する。この方法は、小さな尿量で反復的な尿分析を可能にします。

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

この方法は、腎臓病における糸球体透過性の役割に関する腎臓学分野の主要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、蛍光鉛標識トレーサーを用いて、糸球体透過性の小さな一過性の増加が検出される点である。麻酔後、雌マウスに尿カテーテルを入れる。マウスを下振れ状態に置きます。下腹部を締め、尿道オスチウムを見つけます。22G血管カテーテルのカテーテルのプラスチック部分を入手し、キシロカインゲルで潤滑します。左人差し指を使って下腹部に慎重な張力を入れ、遠位尿道軸を平行しながらカテーテルを3ミリメートル尿道オスチウムに導入します。尿道オスティウム内の先端を維持し、尿道の軸を維持することにより、血管カテーテルの上部を180度回します。次に、カテーテルをさらに7ミリメートルマウスに導入し、膀胱内に置きます。1.5ミリリットルの茶色のチューブを血管カテーテルの上に置き、尿を採取します。尿の生産を高めるために皮下0.9%の塩化ナトリウムの1ミリリットルを適用します。マウスの首を剃り、外科医に向かって頭で債務に置きます。ハイパーはテープでマウスの頭を伸ばす。70%イソプロパノールで首を消毒する。トゥイザーとハサミを使用すると、顎の下に5ミリメートルの皮膚切開を行います。胸骨の真ん中に達するまで、胸骨の方向に約1センチメートルの皮膚を切断します。はさみを使用してください。首の右側に皮膚を慎重に解剖します。首の軟部組織を露出させるために右に皮膚の長方形の切開を行います。頸静脈を損傷しないように注意してください。はさみとトゥイザーを使用して、2つのクランプで皮膚のフラップを固定します。細かいツイーザーの先端を使用して、鈍い調製によって頸静脈を慎重に露出させる。必要に応じて、細かいはさみで組織を取り除きます。静脈の枝の損傷を避ける。マウスの頭に向かって見える頸静脈の遠位部分に絹糸で合字を置いて閉じます。合字に緊張を入れるテープでシルクの糸を固定します。これは頸静脈のわずかな緊張を保障する。頸静脈の近位部分の周りに合字を準備します。その後、カテーテルを平衡融解と融合液で満たします。カテーテルが頸静脈を揃えるように、カテーテルをテープで固定します。空気塞栓症を避けるために気泡の制御。挿入部位で細かいピンセットで頸静脈を持ち上げます。管を頸静脈に平行に位置合わせし、管腔を目指す頸静脈を穿刺する。頸静脈の軸線と平行に約2~4ミリメートル挿入します。活発な動きを避けてください。合字を閉じてカテーテルを固定します。顕微鏡を通して注意深く見ることによって合字の締まりのための制御。手術の部位の上に湿った綿棒を置きます。マウスが後尻尾に置かれながら、マウスの尻尾の底に尾の袖口を置きます。測定を開始し、時間ポイントごとに 10 回繰り返します。血圧測定が正しくないと思われ、誤ったデータが生成される場合は、テールカフの位置を調整します。平衡段階の前に、尿採取管を交換し、氷の上に置きます。綿棒を折り畳み、頸静脈に導入された小さな血管カテーテルの周りに置きます。逆行血流または空気塞栓症を廃止するために綿棒の上にクランプを置きます。27Gの針をFITCボーラスで満たされた1ミリリットルの注射器と小さな容器カテーテルの端に接続します。クランプを開き、100マイクロリットルFITCボーラスを塗布します。クランプをもう一度閉じて、より大きなカテーテルを小さいカテーテルと接続します。クランプを再度開き、毎分0.008ミリリットルの流量でシリンジポンプを始動します。注入を60分間続けます。この段階では、糸球体のパーマ選択性に対する有効な薬剤を調査する。尿管のフォームタイムポイントをゼロ分に変更して、別の1.5ミリリットルの茶色のチューブにします。小さな容器カテーテルの周りに綿棒を置き、小さな容器カテーテルから大きなカテーテルを取り外します。シリンジを実験段階溶液で満たします。注射器ポンプに入れ、注入ポンプを実行させて、大きなカテーテルが実験相溶液で満たされるようにします。空気塞栓症を避けながらカテーテルを再接続し、クランプを再度開きます。1分間に0.008ミリリットルの流量でシリンジポンプを開始します。注射器ポンプを60分間継続し、尿管内で尿を採取する。尿管を氷の上に置きます。本研究では、ネイティブマウス尿の蛍光スキャンは395ナノメートルでピークを示す。FITCポリスクロース70は、マウス尿中の1ミリリットル当たり40マイクログラムの濃度で、525ナノメートルで最大蛍光を示す。マウス尿はFITCポリスクロース70の蛍光測定を妨げない。FITCポリスクロース70の濃度を増加する525ナノメートルの入院時に、蛍光強度の増加を示す。この方法は、糸球体透過性の違いを検出することもできる。白いカラムは、実験段階におけるアンジオテンシンII刺激の開始前のFITCポリスクロース70レベルを表す。60分間の投与後、糸球体透過性は対照群と比較して増加した。アンジオテンシンIIは、球状透過性の低下を洗い流す。FITCポリスクロース70レベルは、アンジオテンシンII刺激の追加60分後またはアンジオテンシンII洗浄の60分後に減少した。アンジオテンシンIIによる糸球体透過性の増加は、アンジオテンシンII受容体遮断薬によって遮断され得る。テールカフ法によってモニタリングされた血圧は、対照群とアンジオテンシンII治療群との間に有意な差を示さなかった。この手順を試みる間、輸液溶液を変更する際に空気塞栓症を避けるために重要です。

highly-sensitive-measurement-glomerular-permeability-mice-with

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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