Name: キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶキネシン駆動型分子シャトルの構築法。マイクロチューブルとモータータンパク質を用いた動的平衡系のナノスケール生物システムをTIRF顕微鏡で観察し、自己修復特性と分子動態を解析する技術です。

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作者は感謝して NSF grant NSF DMR 1807514 の財政支援を認めます。著者は、GFP キネシン蛋白質を提供するため g. と V. Vandelinder をありがとうございます。実行されたこの作品を統合されたナノテクノロジー センターの一部、科学ユーザー施設の事務所はロスアラモス国立研究所で科学の米国エネルギー省 (DOE) オフィスの運営 (契約なし。DE-AC52 06NA25396) とサンディア国立研究所 (コン道 97 号デ AC04 94AL85000)。著者は、博士ジェニファー ネフと AllVivo 維管束をペグ-PPG-PEG 修飾と国税庁の贈り物ありがちましょう。

1. ソリューションの準備
注意: このプロトコル (トルエン、dimethyldichlorosilane、およびジチオトレイトール) に用いられる試薬の 3、猛毒です。使用前に製品安全データシート (MSDS) を参照してください。さらに、このプロトコルの部分は示されているように、保護メガネ ・保護手袋の 2 つのセットを着て保護の高いレベルで実行する必要があります。そうでなければお勧めしない限り、実験はすべて、適切な個人用保護具 (保護メガネ、手袋、白衣、フルの長さのズボン、閉じてつま先の靴) を使用している間実験室ベンチに実行できます。
注: ATP、キネシン、このプロトコルで使用されている微小管の濃度は、各実験の必要性を与えられて変更できます。ただし、変更した場合を確認してください指定されたと同じである他の試薬の最終濃度以下。すべての実験は、部屋の温度、(〜 25 ° C) で行われました。
<ol><li>ストック溶液の調製 注: 準備と分注事前に以下のソリューション。すべての因数は、室温 (〜 25 ° C) で用意できます。<ol>
<li>
BRB80 バッファー 注: このプロトコルで使用されるソリューションのほとんどのバッファーは、BRB80 です。BRB80 を大量に作成し、-20 ° C のフリーザーで保存されています。<ol>
<li>24.2 g を溶解ピペラジン N, n ′-bis(2-ethanesulfonic acid) (パイプ) 800 mL の脱イオン水に水酸化カリウム (KOH) の 3.1 g の 100 mM のパイプの 800 mL を作るため。水酸化カリウム (KOH) と 8 の pH は、パイプおよびグリコールエーテルジアミン四酢酸の溶解の助けることができる 1 の l. 向上の最終的な容積を得るため 100 mL (MgCl2) 塩化マグネシウム 10 mM と 10 mM エチレング リコール四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸) の 100 mL を追加します。 注: BRB80 バッファー中の化学物質の最終濃度は、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM MgCl2、80 mM のパイプです。</li>
			<li>6.9 島と塩酸 (HCl) を使用して、バッファーの pH を調整します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ATP
		<ol>
<li>100 mM 超純水の ATP の 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-80 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
GTP
		<ol>
<li>25 mM 超純水で GTP の 500 μ L 溶液を準備します。5 μ 因数にソリューションをピペットで移しなさい。-80 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
MgCl2
		<ol>
<li>100 mm MgCl2純水 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
カゼイン
		<ol>
<li>ドライ カゼインの 1 グラムの重量を量るし、50 mL の円錐形遠心管にそれを転送します。カゼインの粉末を溶解する管に 35 mL の BRB80 バッファーを追加します。</li>
			<li>一晩溶解するため冷蔵室でタンブラーにソリューションを配置します。この時点で、ソリューションは、厚めで粘度になります。</li>
			<li>チューブは解決する任意の大きな不溶の塊を許可する 4 ° C 冷蔵庫で直立のままにします。上清を新しいチューブに転送します。</li>
			<li>多くの沈殿物をペレットに 1,000 × gで遠心分離の管をスピンします。もう一度、上清を新しいチューブに転送します。</li>
			<li>繰り返し 0.2 μ m (最大圧力バー 7) フィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。厚いソリューション、多くのフィルターが詰まるのでフィルターがクリアされるまで、この手順を繰り返します、unclogged になります。</li>
			<li>紫外・可視吸光光度法、280 nm2019 mM-1∙cm-1のカゼインの消散係数を使用してを使用して得られた溶液でカゼイン濃度を決定します。カゼインの 23 kDa の分子量を仮定すると、希釈濃度 BRB80 で 20 mg∙mL-1のソリューションです。</li>
			<li>ピペット 20 μ 因数にソリューションし、-20 ° C のフリーザーに因数を格納します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
D-グルコース
		<ol>
<li>純水で 2 M D-グルコースの 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
グルコースオキシダーゼ
		<ol>
<li>BRB80 で 20 mg∙mL-1グルコースオキシダーゼの 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
カタラーゼ
		<ol>
<li>BRB80 で 0.8 mg∙mL-1カタラーゼの 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ジチオトレイトール (DTT) 注: DTT はわずかに揮発性、毒性、ヒューム フードの下で次の手順を実行してください。<ol>
<li>1 M 超純水で希釈した DTT の 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
パクリタ キセル
		<ol>
<li>DMSO で希釈し 1 mM パクリタ キセルの 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ジメチルスルホキシド (DMSO) 注: これらの実験で使用される DMSO は純粋です。<ol>
<li>10 μ L の因数に純粋な DMSO の 1 mL をピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
クレアチンリン酸
		<ol>
<li>純水で 0.2 M クレアチンリン酸の 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
クレアチンホスホキナーゼ
		<ol>
<li>200 units· の 1 mL の溶液を準備します。L-1クレアチンホスホキナーゼ純水。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
硫酸ニッケル (II)
		<ol>
<li>純水で 50 mM ニッケル (II) の硫酸塩の溶液 500 mL を準備します。室温 (〜 25 ° C) でソリューションを保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Poly(ethylene glycol)-ブロック-poly(propylene glycol)-ブロック-poly(ethylene glycol) (ペグ-PPG-PEG) ソリューション
		<ol>
<li>ペグ PPG ペグ 2 mg を量り (数平均分子量: 14,600 g∙mol-1)-紙の重さの NTA パウダー。ペグ-PPG-ペグ-国税庁は、修飾とニトリロ三酸 (NTA) グループ トリブロック共重合体です。ペグ PPG ペグ NTA の詳細について材料表を参照してください。</li>
			<li>1.5 mL 遠心チューブに粉を転送します。チューブにストックのニッケル (II) の硫酸塩の溶液の 1 mL を追加します。粉末を溶解するまで渦とない目に見える塊のままです。</li>
			<li>室温で 1 ヶ月までのストア。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>実験を開始する前に
	<ol>
<li>氷とバケツを埋めます。</li>
		<li>1.1.1 に 1.1.13 上記のセクションで説明されている 13 の試薬のそれぞれから 1 つの因数を取るし、氷の上それらをようにバケツにそれらを追加します。使用前に試薬のそれぞれを解凍します。</li>
	</ol></li>
	<li>微小管の準備 注: 微小管が凍結乾燥チューブリンの色素標識の 20 μ g 因数から重合します。色素の励起波長は 647 nm。<ol>
<li>
微小管の成長バッファーの準備
		<ol>
<li>ピペット 21.8 μ BRB80 のバッファー (0.6 ml) 遠心チューブします。MgCl2原液 1 μ、GTP のストック溶液 1 μ L と DMSO の原液の 1.2 μ L を追加します。 注: したがって、BRB80 バッファー試薬の最終濃度は 5% (v/v) ジメチルスルホキシド、1 mM GTP、4 mM MgCl2。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
微小管重合
		<ol>
<li>ラベル付けされた凍結乾燥チューブリンの 20 μ g 因数に直接微小管の成長バッファーの 6.25 μ L を追加します。渦 5 因数 30 rps で s。</li>
			<li>45 分の 37 ° C で培養する前に 5 分間氷上因数を冷却し、1.3.3 をセクションに進みます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
微小管の安定化
		<ol>
<li>BRB80 バッファーの 490 μ L に検体パクリタ キセル溶液の 5 μ L を追加します。渦 10 ソリューション 30 rps で s。</li>
			<li>微小管のインキュベーションの 45 分がアップされたら、微小管重合溶液 5 μ L を BRB80/パクリタ キセルのソリューションに追加します。 注: MT100 として、この 100 希釈、安定化、微小管ソリューションを指す以下でしょう。5 日間使用することができます、各実験に必要な微小管密度を得るため希釈することができます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>運動ソリューション
	<ol>
<li>
ATP、ATP の再生システム、酵素 antifade
		<ol>
<li>BRB80 バッファーの 291 μ L に検体カゼイン溶液の 9.0 μ L を追加します。</li>
			<li>場合は実験に必要な ATP 濃度は 1 mM、新しい 0.6 mL 遠心チューブに BRB80/カゼイン溶液のピペット 83 μ L より低い。それ以外の場合、新しい 0.6 mL 遠心チューブにソリューション ピペット 85 μ。</li>
			<li>そのチューブに D-グルコース、グルコース酸化酵素の 1 μ L、カタラーゼ活性の 1 μ L、DTT の 1 μ L の 1 μ L を追加します。 注: これらの化学物質、酵素を構成する削除することによって退色を軽減する antifade のカクテル21溶存酸素と消炎反応性ラジカル。これは、蛍光イメージング-2223中に励起光による退色と微小管の崩壊を軽減されます。</li>
			<li>実験 ATP 濃度が 1 mM 未満大幅に選択されます、次の試薬を ATP 生成システムを作成するソリューションに追加: 検体のクレアチン燐酸液と検体のクレアチンの 1 μ L の 1 μ Lクレアチンホスホキナーゼ ソリューションです。</li>
			<li>運動ソリューションに ATP 原液 1 μ L を追加します。フリックまたは渦流既存化学物質を配布する因数。 注: したがって、最終的なソリューション中の化学物質濃度が 10 μ M のパクリタ キセル、0.5 mg·mL− 1カゼイン、20 mM D-グルコース、200 μg·mL− 1グルコースオキシダーゼ、8 μg·mL− 1カタラーゼ、ジチオトレイトール 10 mM、2 mM クレアチンリン酸 (追加), 2units·L− 1クレアチンホスホキナーゼ (追加) の場合、1 mM ATP.このソリューションに運動ソリューションとして以下が。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
キネシン 注: これらの実験で使用される在庫キネシン ソリューションはサンディア国立研究所統合ナノテクノロジー センターで g さんとで調製した、ユーザー契約 (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php) の下で利用できるようにしますここで使用されるバッファーは 40 mM のイミダゾール、300 mM の NaCl、0.76 g·。L-1 37.2 mg· グリコールエーテルジアミン四酢酸L-1 EDTA、50 g·50 μ M、0.2 mM TCEP、L-1ショ糖 Mg ATP。この一連の実験では、rkin430eGFP のキネシンの構造体が使用されました。これは eGFP と尾ドメイン24C ターミナル彼-タグ融合したラット キネシン重鎖の最初 430 のアミノ酸から成るキネシンです。それは大腸菌で発現させた、Ni−NTA 列を使用して浄化します。GFP キネシンの原液の濃度は 1.8 ± 0.3 μ M 紫外・可視吸光光度法、489 nm25、55 ミリメートル-1·cm-1の GFP の消散係数を使用してによって決定されるとそのキネシンを考慮して含まれています。<ol>
<li>実験の目的キネシン濃度または表面密度を決定します。この濃度は、典型的な試金、20 nM。キネシン濃度を希釈する必要がある場合よりも 100 倍、0.5 mg·mL-1のカゼインが含まれている BRB80 の溶液で希釈しています。</li>
			<li>Approximatively 20 の最終濃度を得るために運動ソリューションにキネシン溶液 1 μ L を追加 nM。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
微小管
		<ol>
<li>運動ソリューションのセクション 1.3 で、MT100 溶液 10 μ L を追加します。 注: この運動ソリューションは、最大 3 時間使用できます。その後、antifade システムは、ソリューション内のブドウ糖は酵素反応によって使い果たされたためその効果を失います。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. フロー セルの組み立てください。
<ol><li>
洗浄、coverslips
	<ol>
<li>フロー セル使用大きい coverslip (ディメンション: 60 mm × 25 mm) と小さいの (寸法: 22 mm × 22 mm)19。</li>
		<li>すべて coverslips エタノールで 2 回と超純水で 2 回洗浄します。5 分は 50-75 ° C の温度のオーブンでそれらを乾燥するために純水 coverslips を超音波照射します。</li>
		<li>クリーナー UV/オゾンを用いた (表の材料と製造元の指示を参照)、室温 (〜 25 ° C) で、通常の大気条件で 15 分この手順が実行する各 coverslip の片側を治療 (1 の圧力 atm)。</li>
		<li>慎重に各 coverslip (ピンセットを使用して) その他の側に、UV/オゾン治療側も。</li>
		<li>50-75 ° C の温度のオーブンでそれらを再度乾燥する前に 5 分間再び純水 coverslips を超音波照射します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ペグ PPG ペグ コーティングを有効に coverslips の治療 注: dimethyldichlorosilane と非常に有毒なされているプロトコルのこの部分で使用されるトルエンは次の予防策を取っている間ヒューム フードの下で次の手順を実行: 2 組の手袋および彼らの実験室の下に長袖シャツを着用コート。腕の皮膚は、流出の場合化学物質に直接公開ないので、シャツの袖の内側の手袋の端を押し込みます。保護メガネを着用します。<ol>
<li>475 ml のトルエンの純粋な dimethyldichlorosilane の 25 mL を希釈します。15 秒間 dimethyldichlorosilane とトルエン溶液にそれぞれ coverslip を浸します。</li>
		<li>メタノール トルエンで 2 回、3 回、coverslips を洗います。加圧窒素を用いて coverslips を乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フローセルに coverslips を組み立てる
	<ol>
<li>一度、coverslips が乾燥、2 1 × 2.5 cm の縞模様に垂直に両面テープの 2 × 2.5 cm 部分をカットします。</li>
		<li>繊細なタスク ワイパーに大きな coverslip を置いてテープ ストライプをテープの部分の間 1 cm × 2.5 cm の領域を作成する coverslip のエッジに沿って縦にスティックします。</li>
		<li>フロー ・ セル ・ アセンブリを完了するテープ ストライプの上に小さな coverslip を棒します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. フローセルにソリューションの流れ
<ol><li>ペグ PPG PEG 溶液 20 μ L approximatively を組み立てフロー ・ セルに流れ込みます。セルで飛行はボリュームは、部屋を満たす十分な大きさでなければなりません。次の手順では、ソリューションを交換するとき同じボリュームを使用します。</li>
	<li>5 分の表面に吸収するペグ PPG-止め釘の解決を可能にします。Exchange BRB80 バッファーとペグ PPG ペグ ソリューションでバッファーを流れることによって 3 回。運動ソリューションをフローセルに流れ込みます。</li>
	<li>計画の実験の時間よりも長い場合、蒸発を防ぐためにグリースのフロー ・ セルのエッジをシールします。 メモ: フロー ・ セルはイメージを作成する準備ができました。</li>
</ol>4. 流れ細胞のイメージング
<ol><li>微小管、キネシン (材料の表を参照してください)、目的型全反射蛍光 (TIRF) のセットアップを使用してイメージングを実行します。 注意: ここを使用して顕微鏡 100 倍で 1.49/開口数の対物レンズ、642 の波長 1 つ 2 つのレーザーを使用して nm と最大出力 140 mW、および 488 の波長別 nm、最高出力 150 mW。</li>
	<li>目的浸漬オイルの滴を配置します。</li>
	<li>顕微鏡プラットフォームへのフロー ・ セルの配置し、目的のオイルとフロー ・ セル間の接触があるまで目的をもたらします。</li>
	<li>顕微鏡のインター ロック カバー システムを使用して、エスケープからすべてのレーザ光をブロックします。</li>
	<li>レーザーをオンにし、流体セルの下の面に焦点を当てます。微小管は蛍光標識し、647 の波長で励起 nm。彼らは、GFP キネシン モーターの 488 nm レーザーが使用されている間 642 nm レーザーを使ってイメージ化されるでしょう。</li>
	<li>興味のある動画や画像を記録します。通常、レーザー出力は約 30 mW と 50 ms の両方のための露光時間レーザー チャンネル。フロー ・ セルに運動性がある限りの画像を記録できます。 注: レーザー照射は肉眼に目に有害な取り返しのつかない損傷を引き起こすことができます。照射領域が不透明な蓋で完全に覆われていることを確認してください。</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

この作品は、自己組み立てる弱くバインディング ビルディング ブロック、独自のトラックを作成するアクティブなナノスケール システムを提案する.図 1に示すように、ソリューションからキネシン モーターを蓄積、表面に微小管の滑走します。キネシン モーターは、ソリューションに戻る前に時間の短い期間に、微小管の通夜に残ります。したがって、この実験では、キネシン モーター別 3 つの状態の間。
(1) 微小管シングル バインド状態: これは、キネシンが微小管に結合最初。それは平衡状態 (2) に存在します。
(2) ダブル バインド状態: この場合、微小管シングル バインド キネシンもバインド、表面を介して彼のタグ。このダブル バインド状態は微小管推進のためことができます。
(3) の単一の表面束縛状態: 微小管の端に歩いていると、まだ表面から脱着しないダブル バインド キネシンがこの状態に。これらのモーターは図 1 (結合とグリーン チャンネル) で観察できる: 彼らは数 μ m の微小管の尾部の後ろに拡張し、その減少の道を形成します。
このプロトコルの最も重要なステップ スライドの疎水性表面の形成であります。それが危険な化学物質を使用してだけ、ペグ-PPG-ペグ キネシン表面に可逆的に結合することができます表面をコートする国税庁グループの機能を実行できます。もう一つの重要なステップは、グリース フロー ・ セルをシールです。フロー セル蒸発液体なし長時間イメージングが可能になります。
この手法の主な変更濃度微小管、キネシン濃度と ATP 濃度を変更することで構成されます。微小管の濃度を変更すると、微小管の表面にグライダーの数が変更されます。キネシンの濃度を変更すると、微小にバインドできますキネシン分子の数が変更されます。ただし、この実験で既に定義されている金額以上キネシンの濃度を増加させると、微小管の滑走が残したキネシンの軌跡を確認することが難しく、バック グラウンド蛍光を増加できます。一方、10 μ M 以下の ATP 濃度を下げるが、微小管の滑走速度を大幅減少します。この効果を希望する場合、クレアチン ホスファターゼおよびクレアチンホスホキナーゼから成るシステムを再生成する分子の ATP を利用する必要は。
この技法の可能な制限は、システムの大規模なアクティブ キネシン コンテンツにより ATP が急速に消費されることができます、実験は一定の条件で 1 時間未満を最後可能性があります。これたとえば場合になる 1 つは二重高いキネシン濃度とこのプロトコルに表示される内容よりも 5 倍の高い微小濃度を使用する場合。
以前作品18で調べたに沿って微小管、キネシン モーターの空間分布証明ソリューションからキネシン モーターを滑空微小管に蓄積の長さに沿ってモーターの密度の増加の結果、微小管。微小管の滑走安定性がソリューション キネシンの微小管と濃度速度の非線形依存性を示したことが分かった。
提案するプロトコルは、ナノスケールの設計システム、動的平衡は、アクティブなナノシステムのデザインのさらなる調査にタンパク質モータのより効率的な使用のための道を開きます。さらに、このシステムの動的な性質は自己治癒と動的交換分子コンポーネント、設計され、自然の構造の間のギャップの部分を閉じるを勉強するためのモデル システムとして使用することができます。

アクティブなナノシステムの行動を支配する相互作用は、寿命の長い、ほぼ不可逆的な債券1,2,3,4,5,6 に特徴づけられている常に ,7,8。このよく研究例はキネシン-微小管システム不可逆的表面結合キネシン モーター1,2,3,4によって推進しているグライダー微小管 5。システム コンポーネントが互いに可逆的に接続しているされている9,10を理論的に調べたとナノ11,12、達成しますが、ダウンしてこれらのシステムをスケーリング、ナノスケールは挑戦されています。これのための主要な理由の 1 つは、破壊と環境に大きな変化を必要とする多くのコンポーネント間の結合を改革します。にもかかわらず、このような変更は、過去の13,14,15で実装されている、その環境に適応するのではなく、システム自体を変更することに頼る。動的挙動の広い範囲の探査への扉を開きます、コンポーネントは継続的に組み立てるし、実験が場所を取る全体的な環境を乱すことがなく構造に再編成の分子システムの設計16,17。
ここで、説明し、動的にアセンブルを作成し、ナノスケール機能システムの分解の詳細なプロトコルを示します。システムとその全般的な動作は導入以前18をされている: 微小管のフィラメントは可逆的表面結合キネシン 1 モータのトラックによって推進されます。これらのキネシン モーター蛋白質は、その後間もなく再び放出する前に、微小管を推進するためにソリューションから募集しています。一度ソリューションに戻る彼らは新しい微小管を推進する再度募集することができます。過去の13,14,15、速報および社債の改革必要な環境の変更;対照的に、表面とキネシン モーターの対話我々 のフロー ・ セルの環境は変わりません。
このプロトコルは、(1) プロトコルのすべてのステップを可視化して、(2) このタイプの試金のトラブルシューティングを支援する研究に役立ちます。それはハワードら 1993年19に記載されている手順から派生しています。

<table><tbody><tr><td>488 nmレーザー</td><td>オミクロン Laserage</td><td>LuxX 488-150</td><td></td></tr><tr><td>642 nm レーザー</td><td>オミクロン Laserage</td><td>LuxX&nbsp;642</td><td></td></tr>カ<tr><td>ゼイン</td><td>シグマ</td><td>C7078-500G</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼウシ</td><td></td>バ<td>C40-500MG</td><td></td></tr><tr><td>クレアチンリン酸</td><td>シグマ</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>クレアチンホスホキナーゼ</td><td>シグマ</td><td>C3755-500UN</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>シグマ</td><td>G2133-50KU</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロジメチルシラン溶液</td><td>シグマ</td><td>40140-25ML</td><td>有毒</td></tr><tr><td>なジメチルスルホキシ</td>ド<td>シグマ</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>シグマ</td><td>D0632-5G</td><td>有毒</td></tr><tr><td>な食TI</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eGFP rkin430</td><td>ジョージバッチャンド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ</td><td>E4378-25G</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン50mL円錐形遠心分離管によって提供</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>シグマ</td><td>G0543-10KU</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン三リン酸</td><td>シグマ</td><td>G8877-10MG</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプデリケートタスクワイパーシ</td>グマファー<td>マシューティカル</td>ズ<td>8089</td><td></td></tr>塩化<tr><td>マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>メタ</td><td>ノールフィッシャーケミカル</td><td>A412</td><td>毒性</td></tr><tr><td>Milli-Q Water Purification System</td><td>Millipore Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nickel Sulfate</td><td>Sigma</td><td>656895-50G</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Sigma</td><td>T1912-5MG</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F108-NTA</td><td>Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular</td><td></td><td>PEG-PPG-PEG-NTA</td></tr><tr><td>Pluronic&nbsp;F-108</td><td>Σ</td><td>542342-250G</td><td>PEG-PPG-PEG</td></tr><tr><td>Thermo Scientific スナップキャップ ローリテンションマイクロ遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-403-190</td><td></td></tr><tr><td>トルエン</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>T324</td><td>有毒</td></tr><tr><td>チューブ、HiLyte647 標識</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL670M</td><td></td></tr><tr><td>UV オゾンプロクリーナー</td><td>BioForce Nanosciences</td><td>PC440</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp;Puradiscシリンジフィルター</td><td>Sigma</td><td>WHA67840402</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCMOSカメラ</td><td>Andor Technology</td><td>sCMOS 4.2</td><td></td></tr></tbody></table>

キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

このプロトコルでは、弱いと可逆、キネシンの表面に接続とキネシン分子シャトルを作成する方法について説明します。このシステムで、以前のプロトコルとは異なり微小管はキネシン モーター蛋白質溶液からを募集し、表面の上に置きます。キネシンが、ターンでは、こうして再び募集に利用される一括ソリューションに放出する前に表面に沿って微小管の滑走を促進します。この継続的なアセンブリおよび分解は、一時キネシンによる微小管の滑走コースの形成など、システムの動的挙動を印象的につながります。
この実験を通して説明するいくつかの実験手法: 紫外可視吸光光度法、試薬の溶液の濃度を決定するため、coverslips にオゾンと紫外線 (UV) 治療およびシラン処理される最初フロー セル、および全内部反射蛍光にマウントする前に (TIRF) 顕微鏡はキネシン ・微小管のフィラメントを同時にイメージに使用されます。

これらの実験で使用して、1,000 倍の希釈セクション 1.3.2 で作製した微小管の。キネシン濃度は 20 nM、および ATP 濃度 1 mM であった。全反射蛍光顕微鏡を用いたイメージングを行った。キネシン モーター グライダー微小管をイメージしました別途: 微小管が 647 nm レーザー (図 1赤)、励起による表示され GFP キネシンは 488 nm レーザー (図 1緑) 興奮すると表示されていた。赤と緑の光で励起間の時間はより小さい 1 s。フレームの間の時間は、10 s. 微小管表示安定したグライダーでした。平均微小管の滑走速度 approximatively 800 nm/s であった。微小管の表面密度 400 mm-2であった。数 μ m の微小管 (赤) の末尾を超えて拡張するキネシン (緑) のトラックが登場しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59068/59068fig1.jpg"> 図 1: 弱表面結合キネシン モーターによって推進される微小管を滑空します。微小管が前方に移動と彼らはキネシン モーター ソリューションから蓄積されます。これらのモーターを交互に 2 つの状態: 微小管に単一バインドとダブル バインド、微小管と表面の両方に。ダブル バインドされたモーター、微小管の終わりに達すると、モーターは後ろに残っているし、オフ率が約 0.1 s-1の表面からゆっくりとムレない。その結果、キネシン モーターのトレイルは微小管の後ろに残る。一番上の行: 赤 (微小管) チャネル。中段: グリーン (キネシン) チャンネル。最下行: 赤 (微小管) と緑 (GFP キネシン) チャネルを結合します。スケール バー: 20 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59068/59068fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

表面付着キネシン モーター蛋白質が色素標識微小管を推進分子シャトルを構築するためのプロトコルを提案します。表面とキネシンの弱い相互作用は、それへのリバーシブルの愛着をできます。これは、動的アセンブリとそのコンポーネントの機能を維持しながら分解を表わすナノスケール システムを作成します。

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

このプロトコルは、動的平衡状態にあるナノスケールの生物学的システムの設計におけるさらなる調査への扉を開くため、重要である。この技術は、私たちが呼ぶことができるもの、自己治癒」または分子成分の動的置換を可能にするので、設計された構造と自然な構造の間のギャップの一部を埋めます。この手法を初めて試す際の最も重要なアドバイスは、実験者がすべての安全プロトコルに従っていることを確認することです。まず、テキストプロトコルで概説されているように、ストックソリューションを準備します。小さいマイクロ遠心分離管にBRB80緩衝液のピペット21.8マイクロリットル。塩化マグネシウムストック溶液1マイクロリットル、GTPストック溶液1マイクロリットル、DMSOストック溶液1.2マイクロリットルを加え、微小管成長バッファーの調製を完了します。微小管重合を開始するには、6.25マイクロチューブ成長バッファーを凍結乾燥チューブリンの20マイクログラムアリコートに直接加え、647ナノメートルで励起されるように標識します。40 RPSで5秒間渦を起用。氷の上のアリコートを5分間冷やします。その後、摂氏37度で45分間インキュベートする。微小管安定化を開始するには、490マイクロリットルのBRB80バッファーに、アリクォートパクリタキセル溶液5マイクロリットルを加えます。30 RPSで10秒間、溶液をボルテックスします。マイクロチューブのインキュベーションの45分がアップしたら、その溶液の5マイクロリットルをBRB80に加え、パクリタキセル混合物を加えてMT100溶液を作成します。まず、291マイクロリットルのBRB80バッファーに9.0マイクロリットルのジクォートカゼイン溶液を加えます。新しい6ミリリットルマイクロ遠心分離管にBRB80カゼイン溶液のピペット83マイクロリットル。D-グルコース、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、DTT、クレアチンリン酸、ホスホキナーゼを1マイクロリットル加えます。次に、1マイクロリットルのストックATP溶液を運動性溶液に加える。フリック、または均質に化学物質を分配するアリコートを渦。次に、1マイクロリットルの調製キネシン溶液を運動性溶液に加え、最終的な濃度が20ナノモルとなる。運動性溶液にMT100溶液の10マイクロリットルを加えます。フローセルの場合は、大きなカバースリップと小さなカバースリップの両方を使用します。すべてのカバーリップをエタノールで2回、超純水で2回リンスします。洗ったカバーリップを超純水で5分間超音波処理します。その後、50〜75°Cの温度でオーブンでカバーリップを乾燥させます。UV-オゾンクリーナーを使用して、各カバースリップの片側を室温および通常の大気条件で15分間処理します。ピンセットを使用して、各カバースリップを反転し、同様に未処理の側面を治療するためにUVオゾンを使用しています。処理されたカバーリップを超純水で5分間超音波処理します。その後、50〜75°Cの温度でオーブンで乾燥させます。次に、テキストプロトコルで概説されているように保護具を着用します。各カバースリップを生理液に15秒間浸します。カバーリップをトルエンで2回、メタノールで3回洗います。加圧窒素を使用してカバーリップを乾燥させます。カバースリップが乾燥したら、2センチメートルの両面テープを2.5センチメートル切ります。この部分を2つの1センチメートルに2.5センチメートルのストリップに垂直に半分にカットします。繊細なタスクワイパーに大きなカバースリップを置き、テープストリップをエッジに沿って長さ方向に貼り付け、テープの破片の間に1センチメートルx 2.5センチメートルの領域を作成します。テープストリップの上に小さなカバースリップを貼り付けて、フローセルアセンブリを完成させます。まず、約20マイクロリットルのPEG-PPG-PEG溶液を組み立てられたフローセルに流します。溶液を表面に5分間吸収させ、その後、この溶液を20マイクロリットルのBRB80バッファーと交換し、バッファーを3回流した。20マイクロリットルの運動性溶液をフローセルに流す。この後、計画実験が1時間以上の場合に蒸発を防ぐために、フローセルの端をグリースで密封します。客観的型全内部蛍光顕微鏡を用いてイメージングを行う。目的に浸漬油の滴を置きます。次に、フローセルを顕微鏡プラットフォームに置きます。目的とフローセル上の油との接触が起きるまで目的を持ち上げます。顕微鏡のインターロックカバーシステムを使用して、すべてのレーザー光を逃がすのをブロックします。次に、レーザーをオンにし、マイクロチューブを画像化するために642ナノメートルレーザーを使用してフローセルの下面に焦点を当て、GFPキネシンモーターを画像化するために488ナノメートルレーザーを使用します。関心のある画像や動画を記録します。フローセルに運動性がある限り画像を記録できます。本研究では、独自のトラックを構築するために弱く結合するビルディングブロックを自己組み立てるアクティブナノスケールシステムが提示される。tirf顕微鏡を使用して、滑空微小管はキネシンモーターから別々に画像化されます。微小管は647ナノメートルのレーザーと励起時に見える。そして、GFPキネシンは488ナノメートルのレーザーで励起されると目に見える。励起と赤と緑の光の間の時間は1秒未満でした。見られるように、滑空微小管は溶液からキネシンモーターを蓄積し、表面に堆積させる。キネシンモーターは、溶液に戻る前に、マイクロチューブの後に短時間残ります。運動性溶液の抗フェード中に試薬の正しい濃度を有することは非常に重要であり、そうでなければ、光の漂白は実験が失敗する原因となる。この技術は、ナノスケールのエンジニアシステムにおけるプロテインモータのより効率的な使用への道を開きます。このように、より複雑なナノ構造の設計と研究が可能となる。

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工学

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