中大脳動脈から膜電位を記録する微小電極浸入法
July 2nd, 2019
この記事の主な目的は、マイクロ電極衝撃法を用いて中大脳動脈から膜電位(V m)を記録する方法の詳細を提供することである。カニューアル化された中大脳動脈は、筋原性のトーンを得るために平衡化され、血管壁は、高抵抗マイクロ電極を使用して突き刺さる。
このプロトコルは、正常および疾患を有する血管の膜電位を測定し、膜電位、血管調子、および血流を調節する薬理学的薬剤を評価するために使用することができる。血管内の血管平滑筋はシンチウムにあるため、この技術から生じる膜電位は生理学的範囲に近い。手順を開始する前に、デュアルチャンネル差動電気計アンプを、容器室の近く、所望の場所に置きます。
BNC-BNCケーブルを使用して、アンプチャンネルAまたはBの出力をデジタイザのチャンネル入力に接続します。マイクロマニピュレーターにプローブを取り付け、マイクロマニピュレーターを顕微鏡に向け、ミオグラフを振動のないテーブルに向けます。マニュアルに記載されているように、アンプの前面にあるノブとスイッチを実験に適した位置に配置します。
次に、適切な電極でアンプの回路グランドにバスグランドを接続し、ケージがアンプのシャーシに接地されていることを確認します。ホウケイ酸ガラスマイクロ電極を調製するには、標準的なプーラーを使用して、直径が1マイクロメートル未満の短い、緩やかな8〜10ミリメートルのテーパーを達成し、より高い抵抗と小さな先端のために2回ループします。マイクロファイバーのシリンジを使用してマイクロ電極を塩化3モルカリウムで満たし、注入中にプランジャーをゆっくりと引き込み、液体が満杯になるスペースを可能にし、マイクロ電極内に気泡が形成されるのを防ぎます。
完全に装填されたマイクロ電極をマイクロ電極ホルダーに置き、慎重に、しかししっかりと退屈な穴を通してホルダーに電極シャンクを押し込みます。ラボ組織で余分な液体を取り除き、電極ホルダーアセンブリをアンププローブに接続します。電極試験を実施して、電極抵抗を測定します。
次に、記録ソフトウェアを開き、ファイルに名前を割り当て、後で分析するためにファイルを保存します。次に、蒸留水でミオグラフチャンバーを数回リンスしてから、正常な生理塩溶液(PSS)の5ミリリットルでチャンバーをロードします。5または10ミリリットルのシリンジを使用して、気泡を導入することなくガラスカニューラと付属のチューブの両方を濾過された通常のPSSで満たし、鈍い鉗子を使用して2つの10-0モノフィラメントナイロン縫合糸で半結び目を作ります。
次に、解剖顕微鏡の下で解剖鉗子を使用して、部分的に閉じた縫合糸結び目を先端からわずかに離れた両方のカニューレに置く。中大脳動脈分離の場合は、スプリングハサミと鉗子を使用して、ラット脳の内径100~200マイクロメートルの中大脳動脈の枝切れのない部分を識別して解剖する。細かい鉗子を使用して中大脳動脈をガラスカニューラに取り付け、縫合糸を締めてカニューレに動脈を固定します。
遠位カニューレを閉じて、動脈内に流れがないようにし、流入ピペットをPSSの貯留層に接続します。逆顕微鏡とイメージングソフトウェアに取り付けられた電荷結合デバイスカメラを使用して、カニュール中大脳動脈を視覚化します。MCA の軸方向の長さを、剛性もフラクシッドにも表示されないよう、おおよその長さに設定します。
37°Cで95%の酸素と5%の二酸化炭素と浴液を平衡化します。アンプのグラウンドをミオグラフのPSSに浸します。容器チャンバーを照らし、顕微鏡を通して浴液中のマイクロ電極の先端を可視化する。
マイクロマニピュレーターを使用して、血管の外壁近くにマイクロ電極の先端を移動し、記録を開始します。微小電極の先端を容器に向かってゆっくりと動かし、容器の中心を目指す。先端が容器に近いところに来たら、筋肉の膜を妨げるために1つの急速な動きで電極を前進させる。
膜が浸透すると、膜電位の変化が観察される可能性があります。膜が突き刺さったらマイクロマニピュレーターに触れないでください。膜電位変化が記録されたら、マニピュレータを使用して1回の急速な動きで微小電極を取り除き、記録を停止してからデータファイルを保存します。
不浸透は、負の値に対する急速なたわみがあり、膜電位が最低30秒間安定し、電極を取り外すと電圧が突然ゼロミリボルトに戻ると成功したと考えられます。正常な不浸透および膜電位安定化の後、目的の薬物は、浴中に浸透することができ、膜電位の変化を記録することができる。この代表的な実験では、塩化カリウムによる灌流は膜を約6ミリボルト分極し、カルシウム活性化カリウムチャネルのカルシウム依存性活性化剤を灌流しながら、ほぼ4ミリボルトで膜を超分極させた。
覚えておくべきことは、直径が1マイクロメートル未満の短い段階的なテーパーを持つ耐性の高いマイクロ電極を引っ張るということです。
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概要
この記事では、マイクロ電極挿入法を使用して中大脳動脈から膜電位（V m）を記録するためのプロトコルを詳述します。この技術により、正常および病変のある血管の膜電位を測定することができます。
主要な研究要素
科学分野
- 電気生理学
- 血管生物学
- 薬理学
背景
- 中大脳動脈は脳血流に不可欠です。
- 膜電位を理解することは血管緊張を評価する上で重要です。
- この方法は血流に影響を与える薬理作用物質を評価できます。
- 膜電位は血管平滑筋シンチチウムのため生理学的範囲に近いです。
研究の目的
- 膜電位を測定するための詳細なプロトコルを提供すること。
- 薬理作用物質の血管緊張への影響を評価すること。
- 健康と疾患における血流調節の理解を深めること。
使用方法
- 二重チャンネル差動電位計アンプの使用。
- アンプをBNC-BNCケーブルでデジタイザに接続。
- 正確な位置決めのためにマイクロマニピュレータにプローブを装着。
- 実験マニュアルに従ってアンプ設定を調整。
主要な結果
- 中大脳動脈における膜電位の測定に成功。
- 正常および病変のある血管の両方に適用できる技術の適用可能性の証明。
- 記録された膜電位の生理学的関連性の検証。
- 薬理作用物質による血管緊張の調節に関する洞察。
結論
- マイクロ電極挿入法は血管生理学の研究に効果的です。
- このプロトコルは血管疾患を対象とする治療薬の評価に役立ちます。
- さらなる研究により血管健康における膜電位の影響を拡大できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of vascular smooth muscle membrane potential enables mechanistic de-risking of ion channel modulators in preclinical cardiovascular and cerebrovascular programs. This method supports target validation by linking electrophysiological readouts to vascular tone and blood flow regulation, providing predictive confidence for lead optimization. It bridges discovery biology with translational assessment of pharmacological agents affecting cerebral perfusion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on ion channel and electrogenic pump function in vascular smooth muscle.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating membrane potential changes with vascular tone modulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that depolarize or hyperpolarize membrane potential in resistance arteries.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (cannulated middle cerebral artery) for compound screening with stable membrane potential baselines.
- Quantitative Output: Generates reproducible membrane potential measurements in millivolts, enabling dose-response analysis of pharmacological agents.
- Screening Reproducibility: Standardizes impalement technique across vessels to ensure consistent electrophysiological readouts for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to diseased vessel models to assess ion channel dysfunction in hypertension, stroke, or vascular inflammation.
- Translational Continuity: Connects electrophysiological mechanism to functional outcomes like cerebral blood flow regulation.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on membrane potential shifts induced by test compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to functional validation in resistance arteries, supporting lead identification and preclinical efficacy assessment.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses about ion channel contribution to resting membrane potential in vascular smooth muscle.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with stable impalement recordings for compound library screening.
- Analytics: Provides quantitative membrane potential readouts (mV) that enable comparison of compound effects on vascular excitability.
- Translational Research: Links electrophysiological modulation to downstream functional assays of vascular tone and perfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for multiple vascular beds and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular pharmacology by directly measuring electrophysiological consequences of target modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible membrane potential data across laboratories and vascular preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying off-target electrophysiological effects early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of compounds with favorable vascular safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microelectrode preparation, vascular dissection, and electrophysiology recording.
- Depends on low-noise electrometers, digitizers, micromanipulators, and vibration-free imaging setups.
- Necessitates standardization of impalement success criteria (e.g., 30-second stability, return to zero) across users.
- Adaptation to other resistance arteries (e.g., mesenteric, coronary) may require vessel-specific cannulation and tone equilibration.
- Limited by technical success rate of impalement and susceptibility to movement artifacts during recording.
