Name: 中大脳動脈から膜電位を記録する微小電極浸入法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学ぶ微小電極浸入法による中大脳動脈の膜電位記録技術。正常および疾患血管での電位測定と薬理学的評価に適用でき、血管張力調節メカニズムの解明に貢献します。

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この研究は、UMMCの内部支援研究プログラム(IRSP)からの助成金、マリカルジュナ・R・パビディに授与されたAHAサイエンティスト開発助成金(13SDG14000006)の助成金によって一部支援されました。

オスのラットはUMMCの動物ケア施設に収容され、実験動物ケア協会(AAALAC)の評価と認定が承認されています。動物は研究を通じて食べ物と水に自由にアクセスできました。動物は、24±2°Cの温度、湿度レベル60〜80%および12時間の光/暗いサイクルで制御された環境で維持された。すべてのプロトコルは、UMMCの動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 設備の準備
<ol><li>二重チャネル差動電気計アンプ(材料の表を参照)を容器室の近くおよび所望の位置に置きます。</li>
	<li>アンプチャネルAまたはBの出力をBNC-BNCケーブルでデジタイザのチャンネル入力に接続します。</li>
	<li>マイクロマニピュレータにプローブを取り付け、顕微鏡とミオグラフの近くに置きます。記録設定は、振動のないテーブルに取り付けなければなりません。</li>
	<li>説明されているように、アンプの前面にノブとスイッチを置き、この実験用に設定する位置に置きます。</li>
	<li>適切な電極を介してアンプの回路地面に浴場の接地を接続します。同様に、ケージがアンプのシャーシに接地されていることを確認します。</li>
</ol>2. マイクロ電極の調製と組み立て
<ol><li>
ホウケイ酸塩ガラスマイクロ電極(材料の表を参照)を使用し、8-10ミリメートルテーパ、<1 μmの直径と3 M KClで満たされたときに80-120 MΩの抵抗を持つためにガラス先端を引っ張ります。
	<ol>
<li>次の設定を使用して、標準のプーラーを使用して短い段階的テーパを実現します: 熱 = 650。速度 = 20;プル = 25;時間= 250とより高い抵抗と小さな先端のために2回ループします。設定は器具固有のものとして、材料の表を参照してください。 注:先端の直径<1 μmは、突き刺されたときに細胞への損傷を最小限に抑えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
マイクロファイバーシリンジを使用してマイクロ電極を3M KClで充填します(材料の表を参照)。
	<ol>
<li>マイクロ電極に3M KClを注入しながらマイクロファイバーシリンジのプランジャーをゆっくりと引き上げ、流体が充填するスペースを確保し、マイクロ電極内部の気泡の形成を防ぎます。</li>
		<li>マイクロ電極を満タンにし、マイクロ電極ホルダーに入れる前に気泡がないことを確認してください。気泡が存在する場合は、指でマイクロ電極を軽くタップして気泡を取り除きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ケアを行使し、しっかりと退屈な穴を通してホルダーに電極シャンクを押し込みます。余分な液体が存在する場合は、組織でそれを削除します。</li>
	<li>電極ホルダーアセンブリをアンププローブに接続します。電極試験を行い、入力オフセットを調整し、ゼロ設定を確認し、アンプマニュアルに応じてプローブ入力漏れを確認します。</li>
	<li>表 1に示すように、電極試験を使用して電極抵抗を測定します。</li>
	<li>作動電極は、チャネル出力で1 mV/MΩの正のDC電圧シフトを表示します。一方、チャンネル出力とメーターに大きな電圧が現れた場合、これはブロック電極または壊れた電極を示します。</li>
	<li>記録ソフトウェアを開き、ファイルに名前を割り当て、保存ソフトウェアで将来の分析のために保存します。</li>
</ol>3. 中大脳動脈の分離とカネレーション
<ol><li>
試薬を調製する。
	<ol>
<li>表2に記載されているように、正常および低カルシウム生理塩溶液(PSS)を調記する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
筋グラフを準備します。
	<ol>
<li>ミオグラフ室(材料の表を参照)を蒸留水で何度もすすいで、破片をなく。通常のPSSの5 mLでチャンバをロードします。</li>
		<li>5-10 mLシリンジを使用して濾過された通常のPSSで両方のガラスカニューレを充填します。気泡を入れずにカニューレ全体と付属のチューブを注意深く充填してください。</li>
		<li>鈍い鉗子を使用してそれぞれ半結び目で2つのモノフィラメントナイロン縫合糸(10-0、0.02ミリメートル)を準備します。</li>
		<li>解剖顕微鏡下で解剖鉗子を使用して先端からわずか離れた両方のカニューレに部分的に閉じた縫合結び目を置きます。後でこれらの結び目は滑り落ち、容器をしっかり止めるためにカニューレの動脈の端に注意深く結びつくだろう。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
中大脳動脈を分離し、カニューレする。
	<ol>
<li>2~4%吸入イソファルランを用いてスプラーグドーリーラットに深い麻酔を誘導する。</li>
		<li>深い麻酔下でギロチンを使用してラットを切断します。</li>
		<li>骨カッターとはさみを使って頭蓋骨を慎重に取り外します。</li>
		<li>頭蓋骨から脳を取り出し、氷の上に低カルシウムPSSの5 mLに置く。</li>
		<li>スプリングハサミと鉗子を使用して、脳から内径100~200μmのラット中脳動脈(MCA)の分岐していない部分を同定し、解剖する。</li>
		<li>MCAを細かい鉗子を使用してガラスカニューレに取り付け、通常のPSSを含む筋グラフの縫合糸を締め付けることによって安全にする。</li>
		<li>遠位カニューレを閉じて、MCA 内に流れが入らないようにします。</li>
		<li>流入ピペットをPSSを保持する貯水池に接続して、インライン圧力トランスデューサで監視される内ルミナル圧力の制御を可能にします。</li>
		<li>電荷結合デバイスカメラ(材料表を参照)を使用して、カニューテッドMCAを反転顕微鏡とイメージングソフトウェアに取り付けたカヌラリゼーションMCAを視覚化します。</li>
		<li>MCA の軸長を、剛体またはフラクシッドで見えないおおよその長さに設定します。</li>
		<li>O 2(95%)で浴液を平衡化CO2 (5%)37 °Cで十分な酸素化、温度を提供し、7.4でpHを維持する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
インパール(細胞血漿膜に浸透)血管平滑筋細胞。
	<ol>
<li>地上電極を接続し、ミオグラフのPSSに浸しておきます。</li>
		<li>容器室を照らし、顕微鏡を通して、浴室溶液中のマイクロ電極の先端を可視化します。 注:あるいは、イメージングソフトウェアを有するコンピュータ上のMCAおよびマイクロ電極を可視化することができる。</li>
		<li>マイクロマニピュレータのコントロールを使用して、微小電極の先端を血管の外壁に近づけます。マイクロマニピュレータとマイクロ電極の先端は、組織に対して安定した位置にある必要があります。 注:実験を開始する前に、膜電圧が安定していることを確認してください。測定電圧が不安定な場合、電極とセルとの間の接続はシールされず、漏れを示す。</li>
		<li>録音を開始します。</li>
		<li>マイクロ電極の先端を容器に向かってゆっくりと動かし、マイクロマニピュレータのコースまたは細かい制御を使用して容器の中心を目指す。 注:時折、マイクロ電極先端が筋線膜に接触すると、記録中の小さなたわみが観察されることがある。</li>
		<li>先端が血管に近接しているとき、マイクロマニピュレータを使用して電極を前方に進め、筋肉の膜を突き刺す。</li>
		<li>この時点で、記録されているVmの変化を観察し始めることができます。マイクロ電極が細胞の膜を押し付けるときは、マイクロマニピュレータに触れないでください。 注:記録電極と基準電極の電圧差は、血管内圧またはその他の興奮性または抑制刺激のレベルに応じて、0 mV から -40 mV から -75 mV の間に減少します。これらの測定値は、現在の細胞の膜電位差を特徴付します。</li>
		<li>正確な測定を得るためにVSMCを傷つけることなく、容器の異なる領域の単一の容器に複数の衝撃を行います。</li>
		<li>記録後、マニピュレータを使用して、マイクロ電極を1つの迅速な動きで除去します。</li>
		<li>記録を停止し、さらなる分析のためにデータファイルを保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, M. T., Quayle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+and+properties+of+potassium+channels+in+arterial+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle.</a> American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).</li>
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<li>Ganitkevich, V., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+modulates+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Ca2%2B+transients+in+guinea-pig+coronary+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes.</a> Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).</li>
<li>Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+channel+openers%2C+cromakalim+and+Ki4032%2C+inhibit+agonist-induced+Ca2%2B+release+in+canine+coronary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedeberg%27s+Archives+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).</li>
<li>Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRL+38227+%28levcromakalim%29-induced+hyperpolarization+reduces+the+sensitivity+to+Ca2%2B+of+contractile+elements+in+caninse+coronary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedeberg%27s+Archives+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).</li>
<li>Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+of+the+conducted+electrical+response+in+arterioles+of+hamster+cheek+pouch+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro.</a> American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).</li>
<li>Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks in smooth muscle.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

この記事では、カニューレト容器調製物からVmを記録するために鋭いマイクロ電極の衝撃法を使用する方法に関する必要な手順を提供します。この方法は広く使用され、実験的な質問の広い範囲に答えるVmの高品質で一貫した記録を提供しています。
メソッドを確実に成功させるために、いくつかの重要な考慮事項とトラブルシューティング手順について説明します。マイクロ電極の品質(その鮮明さと抵抗)とそれが浸透する細胞プロセスは、Vmの安定性と精度に影響を与えます。信号が連続的にドリフトする場合、またはアンプの記録範囲の上または下にある場合は、電極がブロックされているか、先端が壊れている可能性が最も高いです。衝撃が部分的、不十分、またはセルに損傷を与えるだけの場合、記録された電位は0 mVに戻り、不安定な信号または信号なしになります。場合によっては、セルの内容物が非常に高い抵抗電極を遮断することもできる。これらの問題はすべて、電極を新しい電極に置き換えるだけで克服できます。
成功した衝撃を...

細胞の膜電位(Vm)とは、血漿膜全体のイオン電荷の相対的な差と、これらのイオンに対する膜の相対的な透過性を指す。Vmはイオンの微分分布によって生成され、イオンチャネルおよびポンプによって維持される。K+、 Na+、および Clなどのイオン チャネルは、休止 Vmに実質的に寄与します。血管平滑筋細胞(VSMC)は、4種類以上のK+チャンネル1、2種類の電圧ゲートCa2+チャンネル(VGCC)2、2種類以上のCl-チャネル3を発現する。4,5、店舗運営Ca2+チャネル6、ストレッチ活性化陽イオンチャネル7、8、および電気原性ナトリウム-カリウムATPaseポンプ9は、その全てがプラズマ膜内にあり、そのすべてがVmの規制に関与する.
VSMCのVmは内気圧に依存する。非加圧血管では、Vmは-50から-65 mVまで変化しますが、加圧動脈セグメントでは、Vmは-37から-47 mV10の範囲です。血管内圧の上昇は、VSMCが脱分極11を引き起こし、VGCC開口の閾値を減少させ、筋因性トーン12の発症に寄与するカルシウム流入を増加させる。逆に、受動血管または非加圧血管において、膜過分化は、高いK+チャネル活性に起因して、VGCCが開くことを防ぎ、その結果、カルシウム入り口が限られ、細胞内カルシウムの減少に寄与し、血管の調子13.したがって、内気圧の変化によるVmは血管緊張発達に重要な役割を果たしているように見え、VGCCおよびK+チャネルの両方がVmの調節において重要な役割を果たしている。
Vmは、血管の種類と種によって異なります。Vmは、モルモット優れた腸間膜動脈ストリップ14、60mmHgルーメン圧力12におけるラット中脳動脈における-45±1 mV、および-35±1 mVのラット・パレンキマル動脈における40mmHgルーメン圧15における-54±1mVである。伸ばされていないラットリンパ筋に記録された残りのVmは、-48±2 mV16である。脳VSMCのVmは末梢動脈よりも陰性である。これに対し、ネコ中脳動脈は約-70mVのVmを持つことが報告され、腸間膜および冠動脈はそれぞれ-49と-58 mV、それぞれ17、18を持つことが報告された。血管床間のVmの違いは、イオンチャネルおよび電気原性ナトリウムカリウムポンプの発現および機能の違いを反映しうる。
Vmの増減は、それぞれ膜脱分極および過分極と呼ばれる。Vmにおけるこれらの変化は、イオンチャネルゲーティング、細胞シグナル伝達、筋肉収縮、作用電位伝播を含む多くの生理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たす。一定の圧力では、K+チャネルを活性化する多くの内因性および合成血管拡張化合物が膜過分極を引き起こし、その結果、血管拡張1、13を生じる。逆に、持続的な膜脱分極は、アゴニスト誘発または受容体媒介血管収縮19において不可欠である。Vmは、VGCC13を介して Ca2+流入を規制するだけでなく、内部ストア 20、21およびCa2+の感度から Ca2+のリリースに影響を与える重要な変数です。収縮装置22.
異なる細胞タイプからVmを記録する方法はいくつかありますが、カニュート容器のマイクロ電極衝撃法から収集されたデータは、単離されたVSMCから得られたデータよりも生理学的であるように見えます。現在のクランプ法を用いて単離されたVSMCから記録された場合、VmはVSMC24における自発的過過極極と見なされる。分離されたVSMCはシンシチウムに含まれ、シリーズ抵抗の変化はVmの振動挙動に寄与する可能性がある。一方、Vmが無傷の血管から記録された場合、振動挙動は観察されず、おそらく動脈内の同期体であり、安定したVmにつながる血管全体に要約されるVSMC間の細胞接触によるものである。24.したがって、標準的なマイクロ電極衝撃技術を用いて加圧容器からのVmの測定は、生理学的条件に比較的近い。
カニュート血管からのVmの記録は、同期しているVSMCのVmが血管の緊張と血流の主要な決定要因の1つであり、Vmの変調が拡張する方法を提供することができるので、重要な情報を提供することができます。血管を収縮させる。したがって、Vmの記録に関わる方法論を理解することが不可欠である。本論文では、微小電極浸漬法を用いた中脳動脈(MCA)からのVmの細胞内記録について述べている。このプロトコルは、MCA、マイクロ電極を調作し、電気計をセットアップし、Vmを記録する衝撃法を実行する方法を説明します。また、代表的なデータ、この方法を使用する際に発生した一般的な問題、および潜在的な問題について説明します。

<table><tbody><tr><td>解剖器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aneshetic Vaporiser</td><td>Parkland scientific</td><td>V3000PK</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Nikon Instruments Inc., NY</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Guillotine Type 7575</td><td>Harvard Apparatus, MA</td><td>73-198</td><td></td></tr><tr><td>Littauer Bone Cutter</td><td>Fine science tools</td><td>16152-15</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC40 超微細鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ シャープ ブラント</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>縫合</td><td>ハーバード 装置</td><td>72-3287</td><td></td></tr><tr><td>バンナス スプリング ハサミ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>電気生理学 機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電荷結合素子 カメラ</td><td>Qimaging, , BC</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>差動電位計 増幅器</td><td>WPI</td><td>FD223A</td><td></td></tr><tr><td>インライン圧力トランスデューサ</td><td>Harvard Apparatus,</td><td>MA1 72-4496</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Thor labs</td><td>PCS-5400</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrodes</td><td>Warner Instruments LLC, CT</td><td>G200-6、</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフィル(マイクロファイバーシリンジ)</td><td>WPI</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ電極ホルダー</td><td>WPI</td><td>MEH1SF</td><td></td></tr><tr><td>筋グラフ</td><td>リビングシステム計装、VT</td><td>CH-1-SH</td><td></td></tr><tr><td>プーラー</td><td>サッター インストゥルメント、カリフォルニア州サンラファエル</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>振動フリー テーブル</td><td>TMC</td><td>3435-14</td><td></td></tr><tr><td>SoftwaresClampex</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p Clamp 10</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフト</td><td>ニコン, NY</td><td>NIS-elements</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 </td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Σ</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>グルコース Σ</td><td></td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr></tbody></table>

中大脳動脈から膜電位を記録する微小電極浸入法

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

血管平滑筋細胞の膜電位(Vm)は血管の緊張を決定し、したがって臓器への血流を決定する。イオンチャネルおよび疾患状態でVmを調節する電気原性ポンプの発現および機能の変化は、Vm、血管緊張、および血流を変化させる可能性がある。したがって、電気生理学の基本的な理解と、健康な状態や病気状態でVmを正確に記録するために必要な方法が不可欠である。この方法は、Vmを復元するために異なる薬理学的薬剤を使用してVmを調節することを可能にする。いくつかの方法がありますが、それぞれ長所と短所がありますが、この記事では、マイクロ電極の衝撃法を用いて中大脳動脈などのカニューズ抵抗血管からVmを記録するプロトコルを提供します。中大脳動脈は筋次室内で筋原性のトーンを得ることが可能であり、血管壁は高抵抗のマイクロ電極を使用して突き刺さる。Vm信号は、電気計を介して収集され、デジタル化され、分析されます。この方法は、細胞を損傷することなく、膜抵抗を変更することなく、血管壁のVmの正確な読み取りを提供します。

提示された方法は、Vmをカニューレド容器に記録するために確実に使用することができる。MCAを脳から分離する方法を説明する簡単な手順を図1Aに示す。頭蓋骨から脳を分離した後、MCAを解剖し、低カルシウムPSSを含むペトリ皿に入れた。取り付けられた結合組織の一部も、分離中のMCAの損傷を防ぐためにスプリングハサミと鉗子を使用してMCAと一緒に解剖した。慎重に、結合組織も除去され、解剖されたMCAは筋グラフに移る準備ができていた。MCAはカニューレに取り付けられ、筋グラフのカニューレの両端に縫合結び目を使用して結ばれた。一般的なマイクロ電極インパレメント法の設定の概略図を図 1Bに示します。3M KClで満たされたマイクロ電極をプローブ内のホルダーを介して電気計に接続した。電気計のチャンネル出力は、BNC-BNCケーブルを用いてデジタイザのアナログ入力チャンネルに接続した。デジタイザ出力は、記録ソフトウェア内の信号を可視化するためにオシロ...

この記事の主な目的は、マイクロ電極衝撃法を用いて中大脳動脈から膜電位(V m)を記録する方法の詳細を提供することである。カニューアル化された中大脳動脈は、筋原性のトーンを得るために平衡化され、血管壁は、高抵抗マイクロ電極を使用して突き刺さる。

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

このプロトコルは、正常および疾患を有する血管の膜電位を測定し、膜電位、血管調子、および血流を調節する薬理学的薬剤を評価するために使用することができる。血管内の血管平滑筋はシンチウムにあるため、この技術から生じる膜電位は生理学的範囲に近い。手順を開始する前に、デュアルチャンネル差動電気計アンプを、容器室の近く、所望の場所に置きます。BNC-BNCケーブルを使用して、アンプチャンネルAまたはBの出力をデジタイザのチャンネル入力に接続します。マイクロマニピュレーターにプローブを取り付け、マイクロマニピュレーターを顕微鏡に向け、ミオグラフを振動のないテーブルに向けます。マニュアルに記載されているように、アンプの前面にあるノブとスイッチを実験に適した位置に配置します。次に、適切な電極でアンプの回路グランドにバスグランドを接続し、ケージがアンプのシャーシに接地されていることを確認します。ホウケイ酸ガラスマイクロ電極を調製するには、標準的なプーラーを使用して、直径が1マイクロメートル未満の短い、緩やかな8〜10ミリメートルのテーパーを達成し、より高い抵抗と小さな先端のために2回ループします。マイクロファイバーのシリンジを使用してマイクロ電極を塩化3モルカリウムで満たし、注入中にプランジャーをゆっくりと引き込み、液体が満杯になるスペースを可能にし、マイクロ電極内に気泡が形成されるのを防ぎます。完全に装填されたマイクロ電極をマイクロ電極ホルダーに置き、慎重に、しかししっかりと退屈な穴を通してホルダーに電極シャンクを押し込みます。ラボ組織で余分な液体を取り除き、電極ホルダーアセンブリをアンププローブに接続します。電極試験を実施して、電極抵抗を測定します。次に、記録ソフトウェアを開き、ファイルに名前を割り当て、後で分析するためにファイルを保存します。次に、蒸留水でミオグラフチャンバーを数回リンスしてから、正常な生理塩溶液(PSS)の5ミリリットルでチャンバーをロードします。5または10ミリリットルのシリンジを使用して、気泡を導入することなくガラスカニューラと付属のチューブの両方を濾過された通常のPSSで満たし、鈍い鉗子を使用して2つの10-0モノフィラメントナイロン縫合糸で半結び目を作ります。次に、解剖顕微鏡の下で解剖鉗子を使用して、部分的に閉じた縫合糸結び目を先端からわずかに離れた両方のカニューレに置く。中大脳動脈分離の場合は、スプリングハサミと鉗子を使用して、ラット脳の内径100~200マイクロメートルの中大脳動脈の枝切れのない部分を識別して解剖する。細かい鉗子を使用して中大脳動脈をガラスカニューラに取り付け、縫合糸を締めてカニューレに動脈を固定します。遠位カニューレを閉じて、動脈内に流れがないようにし、流入ピペットをPSSの貯留層に接続します。逆顕微鏡とイメージングソフトウェアに取り付けられた電荷結合デバイスカメラを使用して、カニュール中大脳動脈を視覚化します。MCA の軸方向の長さを、剛性もフラクシッドにも表示されないよう、おおよその長さに設定します。37°Cで95%の酸素と5%の二酸化炭素と浴液を平衡化します。アンプのグラウンドをミオグラフのPSSに浸します。容器チャンバーを照らし、顕微鏡を通して浴液中のマイクロ電極の先端を可視化する。マイクロマニピュレーターを使用して、血管の外壁近くにマイクロ電極の先端を移動し、記録を開始します。微小電極の先端を容器に向かってゆっくりと動かし、容器の中心を目指す。先端が容器に近いところに来たら、筋肉の膜を妨げるために1つの急速な動きで電極を前進させる。膜が浸透すると、膜電位の変化が観察される可能性があります。膜が突き刺さったらマイクロマニピュレーターに触れないでください。膜電位変化が記録されたら、マニピュレータを使用して1回の急速な動きで微小電極を取り除き、記録を停止してからデータファイルを保存します。不浸透は、負の値に対する急速なたわみがあり、膜電位が最低30秒間安定し、電極を取り外すと電圧が突然ゼロミリボルトに戻ると成功したと考えられます。正常な不浸透および膜電位安定化の後、目的の薬物は、浴中に浸透することができ、膜電位の変化を記録することができる。この代表的な実験では、塩化カリウムによる灌流は膜を約6ミリボルト分極し、カルシウム活性化カリウムチャネルのカルシウム依存性活性化剤を灌流しながら、ほぼ4ミリボルトで膜を超分極させた。覚えておくべきことは、直径が1マイクロメートル未満の短い段階的なテーパーを持つ耐性の高いマイクロ電極を引っ張るということです。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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