Name: ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学ぶ ペプチド濃縮と質量分析を用いたタンパク質ユビキチン化部位の検出法。粗分画と高度なフラグメンテーション設定により、ユビキチノームの網羅的解析を実現し、再現性の高い結果を提供します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、オランダ科学研究機構(NWO)が国家ロードマップの大規模研究施設(プロジェクト番号184.032.201)の一環として資金を提供するオランダ・プロテオミクス・センターのプログラム「プロテインズ・アット・ワーク」の一環です。).

ここに記載されているすべての方法は、エラスムスMCの制度的動物のケアと使用委員会(EDC)によって承認されています。
1. サンプル準備
<ol><li>培養細胞<ol>
<li>目的の細胞株(例えば、HeLaまたは骨肉腫[U2OS]細胞)を選択し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)および100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDulbeccoのミニマルイーグルミディアム(DMEM)の細胞を成長させます。</li>
		<li>定量的プロテオミクス実験の場合、アルギニンおよびリジンを欠いたDMEMの培養細胞。培地は、10%透析ウシ胎児血清(FBS)、100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシン、およびアラニン-グルタミンを添加する必要があります。従来のリジンとアルギニン('ライト'ミディアム)またはリジン-8(13C6)のいずれかを加えて、2種類のメディアを作ります。15N2) とアルギニン-10 (13C6;15N4)('ヘビー'ミディアム)、それぞれ。</li>
		<li>軽い媒体(すなわち、標識されていない)および重媒体(すなわち、標識されていない、SILAC)の細胞の培養バッチは、重媒体培養中のすべてのタンパク質が重い安定同位体を含む重い安定同位体で標識されていることを確認するために、拡張および処理前に少なくとも6倍の倍増を行うアミノ酸。</li>
		<li>プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブの10μMまたはDMSOの同等の体積を模擬処理として8時間の細胞を処理します。PBSで細胞を洗浄し、1%トリプシン/EDTAを使用して細胞を解約し、細胞をペレット化します。</li>
		<li>2 mLの氷冷50 mM Tris-HCl(pH = 8.2)で0.5%デオキシコール酸ナトリウム(DOC)で試験した条件ごとに1つの150 cm2培養プレートから細胞ペレットをlyseします。95°Cで5分間にライセートを沸騰させ、10分間超音波処理(材料表に記載されている超音波処理器の場合は「H」を設定)4°Cで沸騰させます。N-エチルマレイミド(NEM)などのデビキチナーゼ阻害剤の使用は、ペプチド同定を複雑にする望ましくないタンパク質修飾を導入する可能性があるため、お勧めしません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>インビボマウス脳組織<ol>
<li>生体組織で使用する場合、100 mM Tris-HCl(pH=8.5)、12 mMナトリウムDOC、および12 mMナトリウムN-ラウロイサルコシン酸ナトリウム17を含む氷冷緩衝液中の組織をライスする。4°Cで10分間のライセート(材料表に記載されている超音波処理器の「H」を設定)を超音波処理し、95°Cで5分間煮沸します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>着色吸光度BCAタンパク質アッセイキットを用いて、全タンパク質量を定量化します。タンパク質の総量は、正常なdiGlyペプチド免疫沈降(IP)のために少なくとも数ミリグラムでなければなりません。SILAC実験では、軽い標識タンパク質と重い標識タンパク質を、総タンパク質量に基づいて1:1の比率で混合します。</li>
	<li>50°Cで30分間5mM 1,4-ジチオスライトを使用してすべてのタンパク質を還元し、その後、暗闇の中で15分間10 mMヨードアセトアセトアミドでアルキル化します。Lys-C(1:200酵素対基質比)でタンパク質消化を4時間行い、続いてトリプシンによる一晩の消化(1:50酵素対基質比)を30°Cまたは室温(RT)で行います。</li>
	<li>消化したサンプルにトリフルオロ酢酸(TFA)を加えて、最終濃度の0.5%にし、遠心分離機を100分間10分間、すべてのg洗剤を沈殿させ、除去します。その後の分画のためにペプチドを含む上清を集める。</li>
</ol>2. オフラインペプチド分画
<ol><li>高pH逆相(RP)C18クロマトグラフィーをポリマー定常相材料(300Å,50 μM;材料表を参照)を空のカラムカートリッジに装填してトリプティックペプチドを分画します。定常相ベッドサイズは、分画されるタンパク質消化量に調整する必要があります。タンパク質消化の約10 mgのために、0.5 gの定常相材料で満たされた空の6 mLカラムカートリッジ(材料表を参照)を準備します。タンパク質の消化と定常相比は約1:50(w/w)である必要があります。</li>
	<li>準備したカラムにペプチドをロードし、約10カラムの体積0.1%TFAで洗浄し、続いてH2Oの約10カラム量を洗浄します。</li>
	<li>ペプチドを10mMアンモニウム・フォーマット溶液(pH=10)の10カラム量(pH=10)をそれぞれ7%、13.5%、50%アセトニトリル(AcN)で3つの分数に溶出します。すべての分画を完全に凍結乾燥させます。</li>
	<li>ユビキチン残骸モチーフ(K-ε-GG)抗体をタンパク質Aアガロースビーズに結合させ、diGlyペプチドの免疫強化のために使用してください。ビーズのバッチあたりの抗体の正確な量は、独自の情報であり、メーカーによって開示されていないので、混乱を避けるためにメーカーが行うビーズのバッチに同じ定義を使用することをお勧めします。これらのビーズ2xの1つのバッチをPBSで洗浄し、ビーズスラリーを6等分に分割します。実験計画の詳細については、図 1を参照してください。</li>
	<li>ステップ2.3で採取した3個のペプチド画分を、50 mM MOPS、10 mMリン酸ナトリウム、および50 mM NaCl(pH=7.2)からなるバッファーの1.4 mLに溶解し、破片をスピンダウンします。</li>
	<li>分画の上澄み物をdiGly抗体ビーズに加え、回転ユニットの4°Cで2時間インキュベートします。ビーズをスピンダウンし、上清を抗体ビーズの新鮮なバッチに移し、4°Cで2時間再びインキュベートします。</li>
	<li>その後のグローバルプロテオーム(GP)解析のために上清を保存します。</li>
	<li>すべての端数から200 μLピペットチップに、GF/Fフィルタープラグを装着してビーズを保持します。ピペットチップとビーズを入れて、遠心分離機の先端アダプターを装備した1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れます。200 μLの氷冷IAPバッファーでビーズ3を洗い、その後200 μLの氷冷ミリQ H2Oで3倍に洗い、洗浄ステップごとに2分間200 x gでカラムをスピンダウンしますが、カラムを乾燥させないように注意してください。0.15%TFAの50 μLの2サイクルを用いてペプチドを溶出する。</li>
	<li>C18段チップ(基本的には2枚のC18ディスクを持つ200μLピペットチップ)を使用してペプチドを脱塩し、真空遠心を使用して完全に乾燥させます。</li>
</ol>3. ナノフロー LC-MS/MS
<ol><li>ナノフローLCシステムに結合された感度の高い質量分析計でLC-MS/MS実験を行います。</li>
	<li>CSH130樹脂(3.5 μm、130 Å)を詰めた75 μmの内径を備えた社内梱包された50cm逆相カラムを使用し、120分以上の勾配を持つペプチドを120 nL/minで溶出します。たとえば、カラムオーブンを使用して列を50°Cに保ちます(資料表を参照)。</li>
	<li>質量分析解析を実行します。<ol>
<li>質量分析計は、データ依存型取得(DDA)モードで動作する必要があります。MS1質量スペクトルは、4E5の自動ゲイン制御(AGC)ターゲット設定とOrbitrap質量分析計の場合の最大射出時間50msの高分解能(例えば、120,000)で収集する必要があります。</li>
		<li>まず「最高強度第一」モードで質量分析を行います。このように、最も強いイオンが断片化のために最初に選択され、次に2番目に高いイオンが選択され、合計サイクル時間が3秒の最高速度法を使用します。続いて、「最低強度第一」モードでDDA MS解析の第2ラウンドを実行し、最も強いイオンが最初に選択され、次に2番目の最低イオンが選択されるようにします。この戦略は非常に低いバンドバンタンシーペプチドの最適な検出を保障する。</li>
		<li>前駆体イオンを充電状態(2~7電荷)とモノアイソトピックピーク割り当てに従ってフィルターします。前に尋問された前駆体を動的に除外し、4重極質量フィルタを1.6Thの幅に設定したペプチド前駆体を分離する。</li>
		<li>最大射出時間50 ms、HCD衝突エネルギー30%の7E3のイオントラップでMS2スペクトルを収集します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. データ分析
<ol><li>アンドロメダ検索エンジン18、19,19に基づいて自由に利用可能なMaxQuantソフトウェアスイートなどの適切な検索エンジンを使用して、質量分析生ファイルを分析します。MaxQuant で、以下に示すいくつかの適応を使用してデフォルト設定を選択します。トリプシンに酵素特異性を設定し、切断の最大数を3に上げる。リジンをdiGly残骸(+114.04 Da)、メチオニンおよびN末端アセチル化の酸化を可変的な修飾として設定し、システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定する。</li>
	<li>たとえば、Uniprot リポジトリ (<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">https://www.uniprot.org/downloads</a>) からダウンロードしたタンパク質配列を含む FASTA ファイルに対して、MaxQuant によって自動的に提供されるおとりと標準的な一般的な汚染物質データベースと組み合わせてデータベース検索を実行します。偽発見率(FDR)を1%に設定し、変更された(diGly)ペプチドの最小スコアを40(デフォルト値)に設定します。さらなる分析からC末端ジグライジン残基で同定されたペプチドを除外する。</li>
	<li>SILAC実験ファイルの定量分析では、多重度を「2」に設定し、ステップ4.2を繰り返します。</li>
	<li>MaxQuantソフトウェアスイートのペルセウスモジュール20で、すべての下流分析(統計、遺伝子オントロジー分析など)を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
<li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li>
<li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li>
<li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li>
<li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proteome-wide%2C+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li>
<li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li>
<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
<li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li>
<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
<li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

ここで説明するプロトコルは、培養細胞および生体組織などの様々な生物学的源からのサンプルに適用された。すべてのケースで、我々は、総タンパク質入力量が少なくとも1mgであることを提供し、数千のdiGlyペプチドを同定した。ユビキチン化タンパク質またはジグリーペプチドの濃縮手順が適用されていない場合、細胞全体のライセートから同定されたのは、100-150個の非常に低いジグリーペプチドだけであることを考えると、特異的抗体を用いた濃縮は非常に効率的です。明らかに、感度の高い質量分析は、多数のディグリー同定を得るための前提条件です。我々はいくつかの異なる質量分析計をうまく使用しましたが、オービトラップトリブリュモスは最高の収率を与えた最も敏感なものであることがわかりました。
高いpH溶出性を持つオフラインRPクロマトグラフィーは、IPが実行される前にテストする必要があります。ペプチド同定の観点から画分間の重複は、最適な実験のために可能な限り低くすべきである。IPの後、分画の1つはユビキチン自身のK48修飾トリプティックディグリーペプチドLIFAGK(GG)QLEDGR(m / z 730.39...

ユビキチンからタンパク質への結合は、プロテアソームによる分解を示すものであり、プロテオスタシスにおいて重要なプロセスです。ユビキチンのC末端カルボキシル基は、標的タンパク質11,22のリジンε-アミノ基とイソペプチド結合を形成する。また、ユビキチンは他のユビキチンモジュールに付着することができ、その結果、均質(すなわち、K48またはK11)または分岐(すなわち、不均質または混合)のポリウビキチン構造11、33の形成をもたらす。ユビキチンの最もよく知られた機能は、プロテアソーム分解におけるその役割であり、K48結合ポリウビキチンによって媒介される。しかし、モノ-とポリユビキチン化の両方が、プロテアソームによる分解とは無関係な多くのプロセスにおいて役割を果たしていることも明らかになっている。例えば、K63連結鎖は、細胞内密売、リソソーム分解、キナーゼシグナル伝達、およびDNA損傷応答44,55において非分解的役割を有する。他の6つのリンケージタイプはあまり豊富ではなく、その役割は依然としてほとんど謎めいているが、細胞内のそれらの機能に関する最初の徴候は、主にリンケージ特異的検出66、77を可能にする新しいツールの開発のために出現している。
質量分析はプロテオーム解析に欠かせないツールとなっており、現在では、事実上あらゆる生物学的源から数千種類の異なるタンパク質を1回の実験で同定することができます。複雑さの追加の層は、タンパク質活性を調節することができるタンパク質の翻訳後修飾(PTM)のタンパク質(例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化)によって提示される。PTMを含むタンパク質の大規模同定は、質量分析分野の発展によっても可能となっています。PTMを持つペプチドの比較的低い化学測定は、その非修飾の対応物と比較して技術的な課題を提示し、一般的に質量分析の前に生化学的濃縮ステップが必要です。過去20年間、PTMの分析のためにいくつかの異なる特異的な濃縮方法が開発されました。
細胞内のタンパク質ユビキチン化の多面的役割のため、タンパク質8上のユビキチン化部位の検出のための分析方法の開発に大きな需要がある。,質量分析法の適用は、フルーツフライ、マウス、ヒト、および酵母タンパク質,,9、10、11、12、13、1410,中の9同定されたユビキチン化部位の数の爆発に至った。111213主要なステップは、K-ε-GGレムナントモチーフ('diglycine'または「diGly」とも呼ばれる)に対する抗体を用いたペプチドレベルでの免疫沈降ベースの濃縮戦略の開発によって提示された。これらのdiGlyペプチドは、プロテアーゼ15、16,16としてトリプシンを使用してユビキチン化タンパク質の消化時に産生される。
ここでは、眼窩質量分析法による免疫精製とその後の検出を用いて、diGlyペプチドを濃縮するための最適化されたワークフローを提示する。既存のワークフローのいくつかの変更の組み合わせを使用して、特にサンプル調製および質量分析段階で、プロテアソームで処理されたHeLa細胞の単一サンプルから23,000以上のdiGlyペプチドを日常的に同定できるようになりました。阻害剤および、治療されていないHeLa細胞から〜10,000。このプロトコルは、細胞培養中のアミノ酸による標識のない安定同位体(SILAC)のHeLa細胞と脳組織などの内因性サンプルの両方に、このプロトコルを適用しました。
このワークフローは、深いユビキチノメを明らかにするために、ユビキチン化部位の分析のためのツールのレパートリーに貴重な追加を提示します。次のプロトコルは、ワークフローのすべての手順を詳細に説明します。

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td><td>Supelco</td><td>66883-U</td><td>製品は Supelco で製造中止になりました。CDS Analyticalは新しいメーカーです(https://www.cdsanalytical.com/empore)</td></tr><tr><td>ギ酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130樹脂、3.5 & μ;メートル、130&Aring;</td><td>ウォーターズジ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF/F フィルタープラグ</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>リジン、アルギニン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リジン-8(13C6;15N2)、Arginine-10 (13C6;15N4)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr><td>NanoLCオーブン</td><td>MPI design, MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos質量分析計</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S (300 &Aring;, 50 &micro;m) 高分子逆相粒子</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan ユビキチン残骸モチーフ (K-&epsilon;-GG) キット</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac カートリッジ</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT036790</td> カートリッジに PLRP-S デオキシコール酸ナトリウム Sigma-Aldrich 30970 を<td>充填する前に、カートリッジから tC18 材料を取り出し</td></tr>ます<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, TPCK Treated</td><td>ThermoFisher</td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

ユビキチンの小さなタンパク質によるタンパク質の翻訳後修飾は、多くの細胞イベントに関与しています。ユビキチン化タンパク質のトリプティック消化後、リジンのイプシロンアミノ基に結合したデグリシン残骸を有するペプチド('K-ε-diglycine'または単に「diGly」)を使用して、元の改変部位を追跡することができます。質量分析による感度検出と組み合わせたdiGlyペプチドの効率的な免疫精製は、最新のユビキチン化部位の数を大幅に増加させた。濃縮手順の前に、ペプチドのオフライン高pH逆相分画、イオンルーティング多極に、より高度なペプチド断片化設定を含めることなど、このワークフローにいくつかの改良を加えました。また、抗体ビーズを保持するためにフィルタベースのプラグを使用したサンプルのクリーンアップがより効率的に行われるため、diGlyペプチドに対する特異性が高くなります。これらの改善は、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)細胞の細胞リセートから23,000以上のdiGlyペプチドを細胞内のプロテアソーム阻害時に日常的に検出する結果となる。我々は、脳組織などのいくつかの異なる細胞型およびインビボサンプルのユビキチノメプロファイルの詳細な分析のためのこの戦略の有効性を示す。本研究は、深い細胞ユビキチノメを明らかにするためのタンパク質ユビキチン化分析のためのツールボックスにオリジナルの追加を提示します。

ユビキチン化されたタンパク質は、タンパク質がトリプシンで消化されると、標的リジン残基に114.04ダジグリシン残骸を残します。このモチーフによって引き起こされる質量差は、質量分析実験においてユビキチン化の部位を明確に認識するために用いられた。ここで説明する戦略は、ナノフローLC-MS/MSによるdiGlyペプチドの濃縮とその後の同定のための最先端の方法である(図1A)。本研究では、培養細胞と生体内物質の両方をタンパク質の生物学的供給源として使用したが、このプロトコルはタンパク質の任意の供給源と互換性がある。プロトコルの手順に従って、タンパク質入力の2〜20 mgから10,000-25,000 diGlyペプチドを同定することは簡単であるべきです。細胞中のユビキチン化の程度を増大させるために、ボルテゾミブまたはMG132のようなプロテアソーム阻害剤は、細胞を収穫する数時間前に添加することができる。プロテアソーム阻害剤を使用しなかった場合、同定されたジグリペプチドの数は有意に低い(3...

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

ユビキチンの小タンパク質によるタンパク質の翻訳後修飾は、細胞内の多くの事象に関与している。本研究は、タンパク質ユビキチン化分析のためのツールボックスに独自の追加を提示します。深いユビキチノメを発見するために濃縮技術と質量分析を使用しています。ユビキチン化タンパク質由来のdiGlyペプチドの分析を幾つか改善しました。これらには、濃縮前の粗ペプチド分画、およびOrbitrapにおけるより高度なペプチド断片化設定の適用が含まれる。全体として、ユビキチノメのより大きなカバレッジになります。プロトコルのいくつかの側面は、言葉で記述することは困難です。いくつかの重要なステップの視覚化は、異なるラボで異なるオペレータによってこれらの分析を繰り返すことができるように不可欠です。この手順は、私の研究室の上級技術者であるカレル・ベスタロスティによって実証されます。実験のために培養細胞またはマウス脳組織を準備することから始めます。細胞を使用する場合は、150センチメートル平方の培養プレートから1つの150センチメートルの2ミリリットルの氷冷、50ミリモルトリスHCL、0.5%デオキシコール酸ナトリウムを含む分解します。95°Cで5分間煮ます。その後、摂氏4度で10分間超音波処理します。生体内マウス脳組織を使用する場合は、100ミリモルトリスHCL、12ミリモルナトリウムデオキシコール酸12ミリモルモルナトリウム、12ミリモルモルナトリウムN-ラウロイルスカルソシネートを含む氷冷緩衝液でライスする。4°Cで10分間、ライセートを超音波処理します。その後、摂氏95度で5分間沸騰させます。次に、BCAタンパク質アッセイキットの熱量吸光度を用いて全タンパク量を定量し、これは、正常なdiGlyペプチド免疫沈降のために少なくとも数ミリグラムでなければならない。SILAC実験では、軽い標識タンパク質と重い標識タンパク質を、総タンパク質量に基づいて1対1の比率で混合します。5ミリモルDTTですべてのタンパク質を摂氏50度で30分間減らします。そして、その後、暗闇の中で15分間10ミリモルヨウアセトアミドでそれらをアルキル化します。その後、Lys-Cで4時間タンパク質消化を行います。そして、トリプシン消化は摂氏30度、または室温で一晩。翌日、サンプルを2本のミリリットルエペンドルフチューブに分け、消化されたサンプルにTFAを加え、10,000倍のGで10分間0.5%遠心分離機の最終濃度にして、すべての洗剤を沈殿させ、除去します。その後の分画のために上清を含むペプチドを収集する。高pH逆相C18クロマトグラフィーを使用して、トリプティックペプチドを分画します。約10ミリグラムのタンパク質消化のために0.5グラムの定常相材料で満たされた空の6ミリリットルカラムカートリッジを準備します。準備したカラムにペプチドを積み込み、約10ボリュームの0.1%TFAで洗浄し、続いて10ボリュームの水を洗浄します。ペプチドを、それぞれ7、13.5、50%アセトニトリルを有する10ミリモルアンモニウムシギマの10カラム量を用いて3つの分数に溶出する。その後、すべての分数を点灯します。タンパク質Aアガロースビーズスラリーに結合したユビキチン残骸モチーフ抗体の1つのバッチは、6等分に分割される。原稿の方向に従って3つのペプチド画分を溶解し、破片を回転させます。氷の上に他の3つの画分を保ちながら、ビーズスラリーに3つの分数の上澄み物を追加します。そして、回転器ユニット上の摂氏4度で2時間インキュベートします。次に、ビーズを回転させます。上清を新鮮なビーズのバッチに移します。残りの3つのビーズスラリー画分でインキュベーションを繰り返します。その後のグローバルプロテオーム解析のために上清を保存します。そして、GFFフィルタープラグを装備した200マイクロリットルピペットチップにビーズを移します。遠心分離機の先端アダプターを装備した1.5ミリリットルのチューブにチップを入れ、200マイクロリットルの氷冷IAPバッファーでビーズを3回洗浄し、続いて氷冷精製水で3回洗浄します。200回Gで200倍の柱を回転させ、2分間、カラムを乾燥させないようにします。最終洗浄後、0.15%TFAの50マイクロリットルで2サイクルでペプチドを溶出します。C18段先端でペプチドを脱塩し、真空遠心分離で乾燥させます。ナノフローLCシステムに結合された感度の高い質量分析計でLC-MS/MS実験を行います。列は原稿の方向に従って設定され、摂氏50度に保たれる。データ依存取得モードで質量分析計を操作します。4E5の自動ゲイン制御ターゲット設定と50ミリ秒の最大射出時間で、MS1マススペクトルを高解像度で収集します。最も強烈な第 1 モードで質量分析分析を実行し、合計サイクル時間 3 秒の最高速度法を使用します。次に、DDA MS分析の第2ラウンドを最も強い第1モードで行い、低量のペプチドの最適な検出を確実にします。前駆体イオンを電荷状態とモノアイソトピックピーク割り当てに従ってフィルターします。そして、以前に尋問された前駆体を60秒間動的に除外します。4重極質量フィルターを 1.6 トムソンの幅に設定したペプチド前駆体を分離します。その後、最大射出時間50ミリ秒の7E3の自動ゲイン制御でイオントラップ内のMS2スペクトルを収集し、HCD衝突エネルギーを30%にして、アンドロメダ検索エンジンに基づいて自由に利用できるMaxQuantソフトウェアスイートなどの適切な検索エンジンを使用して、質量分析生ファイルを分析します。MaxQuant を開き、適切な生データ ファイルを選択します。プロセッサの数を設定し、グループ固有のパラメータタブをクリックします。消化を選択し、3つの切断を逃すことを可能にします。次に、変更を選択し、変数の変更に diGly を追加します。グローバルパラメータタブを選択し、正しいタンパク質配列データベースを追加します。他の設定をデフォルトのままにして、start キーを押してデータベース検索を実行します。SILAC実験ファイルの定量分析では、多重度を2に設定し、重いアミノ酸ラベルを選択します。検索が終了したら、テキスト ファイルを Perseus にインポートします。このプロトコルは、ナノフローLC-MS/MSを用いたdiGlyペプチドを検出することによって、培養細胞およびインビボ材料からタンパク質中のユビキチン化部位を同定するために使用された。既存のプロトコルにいくつかの改良が加えられたため、検出されたdiGlyペプチドの数が多くなりました。免疫沈降前に3つの画分に粗分化を行った。画分の1つはユビキチン自身のK48修飾トリプティックジグリペプチドを含み、LCクロマトグラムの広いピークを特徴とする。さらに、ペプチド断片化レジームを調整し、LC-MSランをデータ分析手順における最も高い第1および最低の最初の断片化レジーレジーと組み合わせ、4,000個以上のユニークなdiGlyペプチドを生成した。23,000以上のdiGlyペプチドは、プロテアソーム阻害剤で処理されたHeLa細胞の単一サンプルから日常的に同定することができる。3つの生物学的複製スクリーンで同定されたすべてのdiGlyペプチドのうち、9,000以上が3つの全てに存在し、17,000以上が3つの複製のうち少なくとも2つ中存在していた。ペプチド同定の数は、入力材料の量に非常に依存しています。同定されたdiGlyペプチドの数は出発物質によって期待できますが、これらの数値は推定のみであり、使用される質量分析計の種類にも依存します。このプロトコルを実施する際には、質量分析ベースのプロテオミクス法と微量サンプル量の取り扱いと分析に関する以前の経験が確実に有利であろう。MaxQuantソフトウェアは、他のデータベース検索アルゴリズムに置き換えることができます。また、異なるタイプの質量分析計を使用してもよい。ペプチド同定の観点からは結果が若干異なる場合がありますが、これは質量分析法ベースのプロテオミクスアッセイに典型的です。ユビキチンは、媒介タンパク質分解の進行において重要であるが、細胞内の他の多くのプロセスにおいても役割を果たしている。翻訳後修飾としてのユビキチンのより深い知識は、その機能をよりよく理解するために重要です。

detection-protein-ubiquitination-sites-peptide-enrichment-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM -...

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

このビデオでは、ペプチド混合物からリン酸化ペプチドの抗体ベースの免疫沈降を実演します。濃縮されたリン酸化ペプチドは真空濃縮され、下流の分析のために保存されます。...

リン酸化ペプチド濃縮:複雑なペプチド混合物から特定のリン酸化ペプチドを分離するための抗体ベースの免疫沈降技術

このビデオでは、複雑なペプチド混合物から残留ジグリシンペプチドを含むユビキチン化ペプチドを抽出し精製する方法について説明しています。提示された方法は、タンパク質中の元のユビキチン化部位を同定するのに役立つ可能性があります。...

ユビキチン化ペプチドの免疫親和性ベースの抽出:精製ペプチド画分からユビキチンタグ付きペプチドを選択的に抽出する技術

このプロトコルでは、抽出し、前立腺癌細胞株あるいは質量分析を用いたプロテオミクスによるリン酸化プロテオーム解析のためのティッシュから調製したカゼインホスホペプチドを豊かにする手順について説明します。...

前立腺癌におけるリン酸化プロテオームを調べる定量的ラベル無料質量と相まってリン酸化ペプチド濃縮

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

CENP-Aのユビキタスは、細胞分裂間の二量体化によって受け継がれ、細胞の生存率に不可欠なセントロメレでのCENP-A沈着にとって重要な要件です。ここでは、EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A)...

EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

このプロトコルは、例としてp53腫瘍抑制タンパク質を使用して哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製するための段階的な方法を記載している。ユビキチン化p53タンパク質を、ストリンジェントな非変性および変性条件下で細胞から精製した。...

哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

学ぶ ペプチド濃縮と質量分析を用いたタンパク質ユビキチン化部位の検出法。粗分画と高度なフラグメンテーション設定により、ユビキチノームの網羅的解析を実現し、再現性の高い結果を提供します。

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

さらに動画を探す