微結晶の時間分解フェムト秒シリアル結晶学 x 線レーザーのための高粘度押出を改善
2019年2月28日
シリアル フェムト秒の時間分解構造解析実験の成功は、効率的なサンプル配信に依存します。ここでは、我々 は高粘度 404 マイクロ押出しインジェクターからバクテリオロドプシン微結晶の押し出しを最適化するためにプロトコルを説明します。方法論は小説 3 ウェイ カプラー サンプルの均質化と高速度カメラによる可視化に依存しています。
このプロトコルは、時間分解された連続結晶学的実験で頻繁に発生する問題がデータ品質を損なわないことを保証するために設計されています。この方法の大きな利点の1つは、個々の結晶系への適応性である。高速カメラ押出テストにより、押出安定性を直接測定することもできます。
まず、注射の約30分前に100マイクロリットルシリンジに50マイクロリットルの結晶積モノオレインベースLCPをロードする。真空環境への注入の場合は、MAG 7.9の5マイクロリットルと液体パラフィンの5マイクロリットルを2番目のシリンジの背面にロードします。注射器を縦に持ち、シリンジから気泡を排出します。
マグ7.9とパラフィンとシリンジを標準的なシリンジカプラーに接続します。そして、混合物の小さなボリュームがカプラー針の先端に見えるまで、プランジャーを静かに押してカプラーから空気をパージします。サンプルの注射器を、サンプルに空気を入れないように車を取るシリンジカプラーに接続します。
サンプルをカプラーを通して複数回通過することにより、脂質とパラフィンを混ぜます。次に、別の100マイクロリットルシリンジに20マイクロリットルのプレミックスLCPをロードする。カプラーから空の注射器を取り出し、標準的なシリンジカプラを使用してシリンジを含む結晶にプレミックスLCPを取り付けます。
次いで、カプラーを通してサンプルを100回通過する。サンプルを立方位相に入れ、モノオレインを3マイクロリットル加え、50回混ぜます。透明相が形成されるまで、この手順を繰り返して、過剰なモノオレインを避けます。
サンプル剛性および押出し性の予備試験として、空のシリンジをシリンジカプラから取り外し、注射器を垂直に保持し、カプラーを通して少量のサンプラーを絞る。押し出されたサンプルが直立円柱を形成する場合、サンプルは押し出しテストの準備ができています。予備のLCPを加えて、サンプルの総体積を100マイクロリットルに調整します。
サンプルシリンジと2つの空の注射器を3方向のシリンジカプラーに取り付けます。サンプルの半分を2番目の注射器に入れ、サンプルの半分を3番目の注射器に同時に押し込んで、少なくとも50回混ぜます。混合サンプルを含むシリンジをステレオ顕微鏡の下に置き、結晶の均質な分布を確認します。
HPLCポンプとすべての水線をパージして、流量が正確であることを確認します。次に、インジェクタの油圧ステージをパージします。次に、カメラの電源を入れ、付属のソフトウェアに接続します。
ライブビデオをビジュアルフィードバックのために実行し、ノズル先端をフレームの中央に配置し、3 軸ステージでフォーカスを合わせます。カメラのフレームレートを 1,000 フレーム/秒に設定します。次に、解像度を 512 x 512 ピクセルに設定します。
露出時間がフレームレートで設定されるようになったので、ノズルが見えるまで照明レベルを調整します。ノズル先端を左から右に中央に配置し、フレームの上の 3 分の 1 に位置するように位置を変更します。カメラをタイムラプスモードで設定します。
間隔を 30 秒に設定し、繰り返しを 40 回に設定します。トリガーモードをランダムに設定します。1,000 に記録するフレーム数を入力します。
次に、テストサンプルの20マイクロリットルで貯蔵所をロードし、毛細管ノズルを取り付けます。充填されたリザーバをインジェクタに取り付けます。次に、ノズルのポートにガスラインを取り付け、ガスの流れを開始します。
これに続いて、同時にポンプとカメラの記録を開始します。ポンプ圧力が予想終了時間付近に急激に上昇するまで押し出しを監視します。その後、記録を停止し、ポンプを遮断し、リリーフバルブを開いてシステム圧力を通気する。
これに続いて、解析ソフトウェアでビデオファイルを開き、測定ツールをキャリブレーションします。押し出しで表示されるトラッキング可能な機能があるビデオ内のフレームを検索します。フレーム番号を記録します。
次に、同じフィーチャが表示されているが、前の手順で位置から移動したフレームにビデオを進めます。フレーム番号を記録します。直線測定ツールを使用して、解析測定を使用してフィーチャの始点と終点からの距離を測定します。
ビデオの各セグメントに対して、上記の手順を数回繰り返します。最後に、データ系列をプロットします。ここで説明する手順の理想的な出発材料は、インジェクタ用の粘性キャリア媒体に組み込まれた微結晶の高密度です。
タンパク質結晶は、プロトンポンプ細菌ロドプシン上のTRSFXデータを収集するために使用され、光子吸収後に起こる超高速変化を明らかにした。三方カプラーを用いたサンプル調製後、シリンジ中の材料の目視検査はサンプル均質性を示す。顕微鏡画像とは結晶の密度を確認できる。
サンプルは、送達媒体が透明で粘性がある場合に立方位相である。濁った混合物は、サンプルがスポンジまたはラメラ相であることを示すものであるが、高い結晶密度がLCPの明瞭さを覆い隠す可能性があるため、決定的ではない。スポンジ相を識別するための低圧試験は、サンプルからシリンジプランジャーを引き離すことによって行うことができます。
ジェット試験中、サンプルはほぼ一定の速度で移動するLCPの長い連続列を押し出す必要があります。滴下モードで実行されるサンプルは、粘度が低すぎることを示します。列を形成するサンプルからのデータは、押し出しが実験パラメータによって指示される最小速度を超えていっていることを示す必要があります。
このプロトコルを使用して最適化した後、時間解決シリアル結晶図データは、専門家の施設で収集することができます。これにより、タンパク質全体の立体構造の変化が明らかになります。
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概要
このプロトコルは、時間分解能連続フェムト秒結晶解析のためのバクテリオロドプシンマイクロ結晶の押し出しを最適化する方法を記述しています。サンプルの供給と安定性を確保するために、高品質のデータを得ることの重要性を強調しています。
主要な研究要素
科学分野
- 結晶解析
- 生物物理学
- 構造生物学
背景
- 時間分解能連続結晶解析は、動的プロセスを研究するために重要です。
- 効率的なサンプル供給は、実験の成功に不可欠です。
- 高粘度のマイクロ押し出し注入器は、サンプル処理において課題となる可能性があります。
- 高速カメラなどの可視化技術が、サンプルの安定性を監視するために使用されています。
研究の目的
- マイクロ結晶の押し出しを強化するプロトコルを確立すること。
- 時間分解能結晶解析実験で一般的な問題に対処すること。
- 様々な結晶系への適応性を確保すること。
使用された方法
- 斬新な三方カプラーを使用したサンプルの均質化。
- 押し出し安定性を測定するための高速カメラテスト。
- シリンジでの結晶を含むモノオレインベースのLCPの調製。
- 特定の液体成分を用いた真空環境への注入。
主要な結果
- この方法は、押し出し安定性を直接測定することを可能にします。
- 異なる結晶系への適応性が実証されました。
- サンプルの完全性を損なうことなく、高品質のデータを達成できます。
結論
- 最適化されたサンプル供給は、成功した結晶解析実験にとって重要です。
- 開発されたプロトコルは、様々な実験セットアップに適用できます。
- 将来の研究は、より広範な応用のためにこれらの方法をさらに改良することに焦点を当てる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Optimizing high-viscosity extrusion of microcrystals is critical for maximizing data yield and structural insight in time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) at X-ray lasers. Reliable sample delivery directly impacts the predictive confidence of dynamic protein structure studies, supporting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This methodology enables high-throughput, reproducible workflows essential for advancing structural biology-driven drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein conformational changes following activation, informing target validation.
- Supports mechanistic de-risking by providing high-resolution, time-resolved structural data.
- Facilitates predictive confidence in structure-based drug design by ensuring data quality and reproducibility.
Screening & Assay Development
- Prepares homogenous, high-density microcrystal samples for downstream TR-SFX workflows.
- Standardizes extrusion and delivery conditions, improving assay reproducibility and quantitative output.
- Enables scalable, high-throughput screening of protein structural dynamics under controlled conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant protein states for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of molecular targets.
- Reduces risk in advancing candidates by clarifying dynamic structural mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This optimized extrusion protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting TR-SFX from early hypothesis testing through lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Enables robust hypothesis testing of protein function via time-resolved structural analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative extrusion outputs for comparative condition analysis.
- Analytics: Provides direct measurement of extrusion stability and sample homogeneity using high-speed imaging.
- Translational Research: Connects dynamic structural data to disease-relevant mechanisms when supported by protein system.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol supports a range of microcrystal systems and experimental setups across facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein target studies.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and delivery, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by ensuring high-quality structural data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on dynamic structural insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in crystallography, sample preparation, and high-speed imaging analysis.
- Needs access to specialized injectors, high-speed cameras, and analytical software for extrusion monitoring.
- Demands cross-team standardization of sample mixing and extrusion protocols for reproducibility.
- Adaptable to various microcrystal systems with protocol adjustments based on sample properties.
- Practical limitations include sensitivity to sample viscosity and the need for facility-specific injector compatibility.
