Name: 肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぶ肺胞マクロファージの貧食能解析とPseudomonas aeruginosaの細菌クリアランス評価法。マウスモデルを用いたin vitroおよびin vivo技術で免疫応答メカニズムを解明します。

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このプロトコルの制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 東バージニア医学校のガイドラインに従います。
1. 蛍光ビーズ貪食
<ol><li>マウスを安楽死させる (c57bl/6 j、6 週齢、女性) 動物の倫理的な安楽死のため IACUC プロトコルに従って CO2窒息により。</li>
	<li>ペーパー タオルで覆われて解剖基板上腹のマウスを置きます。その手足をイナバウアーで前足をダウンピンし、その気管がまっすぐ配置されて、戻ってくる、その頭をプルする前に歯とレベル下で文字列をフックします。</li>
	<li>マウスの喉、胸、腹を 70% エタノール消毒や毛皮がツールにくっつかないように濡れています。</li>
	<li>定期的な鉗子を使用すると、体の中心線で皮膚を引き上げ、喉の上に中心線を手術用はさみでカットします。</li>
	<li>標準的な外科はさみの鈍い端を使用して、慎重に喉の筋肉や結合組織を離れ、春はさみ (刀) を使用して、気管を公開します。</li>
	<li>軟骨輪を鉗子で把持、慎重に気管の心室の顔に、刀を用いた小切開 (~1.5 mm) を行い 18 G カニューレを気管に挿入します。</li>
	<li>優しく洗浄リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、一度に 1 mL を 3 mL。たびには優しく注射器と肺に reinfuse に、羊水を抜き取る連続 3 x。BALF を収集した後、安楽死できるように頚部転位を実行します。1,000 x g で 10 分間遠心チューブに気管支肺胞洗浄液 (BALF) で、収集された PBS (~2.8 mL) を転送し、ペレットを収集します。チューブと破片を洗浄し、ペレットの肺胞マクロファージを収集 10 分 1,000 x gで遠心分離機に新鮮な PBS の 1 mL を追加します。</li>
	<li>加湿雰囲気で 37 ° C でガラス底皿の上 2 日間ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 特性不活化ウシ胎児血清 (FBS) と同じメディアの文化主な肺胞マクロファージの 2 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>古いメディアを吸引、1 mL の PBS で洗浄し、新鮮なメディアの 2 mL を追加します。FITC ビーズ (ミクロス ラテックス ビーズ、直径 2 μ m、50 ビーズ/セル) を追加し、加湿雰囲気で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>細胞ビーズを削除する PBS (合計 5 つの洗浄のための時間で 1 mL) で広範囲を洗浄します。100 セルをランダムに画像し、細胞内のビーズでセルをカウント (488 nm)。 注: 貪食能インデックスは、マクロファージの数の合計で割った値摂取のビーズの数貪食細胞の割合は、マクロファージの16の合計数で割った値が少なくとも 1 つのビードを摂取するマクロファージの数です。<ol>
<li>また、ビーズで 1 時間培養後 3 ml の PBS のセルを洗浄して、処理する貪食能の定量化のためのフローサイトメトリー用。同様に、無染色の細胞または制御の細胞としてビーズしないで AMs を処理します。割合陽性を計算し、ソフトウェアでこれらのオプションを選択することによって流れ cytometry ソフトウェアを使用して蛍光強度を意味します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 媒介 FcγR と CR の貪食。
<ol><li>オプソニン、ウサギ抗 SRBC IgM の 50 μ L または室温11時 30 分の抗 SRBC IgG ウサギの 50 μ L を 2 × 108羊赤血球 (SRBCs) を孵化させなさい。</li>
	<li>37 ° C で 30 分間 C5 欠損 (C5D) ひと血清の 50 μ L で IgM コーティング SRBCs 上の C3b と発見及び C3bi 補体の断片を修正する SRBCs を IgM オプソニンを孵化させなさい。</li>
	<li>マウスのマクロファージ細胞 (MH S 細胞) を種子 (10,000 細胞/ウェル) 96 ウェル プレートで 〜 70% の合流点を得るために一晩を孵化させなさいと。MH S セルの各ウェルに SRBCs をオプソニン 1 x 107/mL の 100 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート洗浄は非常に迅速に SRBCs を非連結 (~ 1 分) アンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散バッファーの 100 μ L で。</li>
	<li>0.1 %sds の細胞を溶解し、50 μ L 2, 7-diaminofluorene (DAF) 3% 過酸化水素と 6 M 尿素を含むを追加します。620 でヘモグロビン触媒フルオレン系青色層の吸光度を測定 nm。</li>
	<li>SRBCs の知られている数と 620 nm の吸光度値に標準曲線を使用して、SRBCs の数を決定します。同様に、プロセス MH S 細胞リセプター SRBCs ネガティブ コントロールとして使用すると孵化します。</li>
</ol>3. PRR を介した貪食
<ol><li>手順 1.1 1.9 分離、マウス プライマリ肺胞マクロファージの培養するために従います。</li>
	<li>2 日後に、メディアを取り出し、1 ml の PBS のセルを洗浄して Alexa Fluor 488 共役ザイモザン A バクテリア (100 粒子/料理) を含む新鮮なメディアを 500 μ l 添加します。</li>
	<li>37 ° C で 1 時間インキュベートします。500 μ L の氷冷 PBS の追加によって貪食を停止します。</li>
	<li>PBS (合計 5 つの洗浄のための時間で 1 mL) で広範囲のセルを洗浄します。室温で 10 分間 4% パラホルムアルデヒドとセルを修正します。</li>
	<li>PBS (合計 5 つの洗浄のための時間で 1 mL) で広範囲のセルを洗浄して、500 μ L の PBS で細胞を保ちます。</li>
	<li>微分干渉コントラストと 488 で蛍光チャネルの下のセルを画像 nm。ザイモザン A バクテリアを含む AMs をカウントし、貪食の割合を決定します。</li>
</ol>4.生体内で肺胞マクロファージによる貪食
注: 寒天プレートに膿GFP を接種して、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の日に 2 mL 栄養流体培養基に単一のコロニーを接種して 37 ° C でバクテリアを一晩。
<ol><li>次の日は、100 mg/kg 10 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの腹腔内投与によるマウスを麻酔します。つま先のピンチに反応の欠如によって適切な anesthetization を確認します。</li>
	<li>上顎前歯部にゴムバンドで平らな板にマウスを置くし、腹側表面と上向き演壇 semirecumbent (45 °) の位置に配置します。鉗子を使用して、部分的に舌を引っ込めます。気管内投与管理、50 μ L (5 x 106コロニー形成単位 [CFU])17 膿GFP の麻酔下のマウスの肺に、microsprayer を使用して、します。</li>
	<li>後感染の 1 h は、1.1 から 1.7 の手順に従います。</li>
	<li>PBS および収集に細胞を再懸濁しますスライド ガラスにそれら (1,000 × g室温で 1 分)。</li>
	<li>製造元の指示に従って肺胞マクロファージ、好中球とリンパ球の cytospin スライドを特異的染色します。</li>
	<li>ランダムに 100 の AMs を選択、細胞内の細菌を含む AMs をカウント、貪食の割合を決定します。</li>
</ol>5.体内細菌クリアランスを使用して膿
<ol><li>膿分離寒天プレートの膿を接種し、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。ホストゲノム スープ (LB) 2 mL に単一のコロニーを接種し、37 ° C でバクテリアを一晩。次の数式を使用して、CFU を計算します。 CFU/mL = (x の希釈倍率のコロニーの数)/培養プレートのボリューム。 必要な CFU/mL を取得する PBS の文化を希釈します。</li>
	<li>トライアル 1 気管内注入 ~2.5 x 105 CFU/mL膿の致死線量麻酔下の野生型 (WT) と TRIM72KOマウス、4.2 の手順に記載されているようです。6 日間、毎日体重を測定します。</li>
	<li>トライアル 2 で試用 1 で生き残ったし、4 日間の体重を測定するマウスに膿(5 x 105 CFU/mL) の 2 回目を挿入します。</li>
	<li>マウスの異なるセットを使用して、試用版の 3 で膿の致死量 (3 x 107 CFU/mL) の WT と TRIM72 のKOマウスを注入し、注入の 2 日以内死亡率を記録します。動物は、有意な体重減少などの重度のストレスの兆しを見せて、呼吸困難や食欲不振、背を丸めてバック参加獣医によって評価されます。すぐに治療不可能な動物が犠牲になります。</li>
	<li>死または注射後 2 日目で安楽死した後、ピーク感染で肺の細菌負荷の定量化のため肺全体を収集します。</li>
	<li>肺の細菌負荷をテストするためには、肺組織に生理食塩水入りの 200 μ L を追加し、完全に細菌を壊すことがなく肺組織を混乱させる電子のホモジナイザーで以前にテストした設定を使用して、それらを均質化します。肺の 10 倍のシリアル希薄で緑膿菌分離寒天の溶解液の 1 mL とプレート 100 μ L に肺ホモジネートの総量を調整します。</li>
	<li>24 h の 37 ° C で版を孵化させなさいそして全肺あたり CFU を決定する細菌のコロニーをカウントします。</li>
</ol>6. 統計解析
<ol><li>学生のtを使用して、-2 つのグループ間の差の統計的有意性を調べるテスト。とき統計的に有意な違いを考慮するp < 0.05。(SEM) 平均値 ± 標準誤差を手段として、すべてのデータが掲載されています。</li>
</ol>

<ol><li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li>
<li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li>
<li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia%3A+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li>
<li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li>
<li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li>
<li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li>
<li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li>
<li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc%CE%B3+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).</li>
<li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li>
<li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li>
<li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li>
<li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ガス交換機能を実行している間肺永続的異物、病原体、およびアレルゲンを直面しています。AMs は、主な機能、すなわち貪食のおかげで防衛の最初の行を提供します。AMs はまた他の免疫細胞が病原体を破壊して炎症の解像度を調整します。ここでは、具体的にはマウス肺から分離された AMs によって貪食能を評価する方法について述べる。本稿で提示されたプロトコルは、マクロファージの機能と他の臓器に細菌クリアランスの勉強にも使えます in vivo と in vitro 貪食の詳細な研究を説明します。
説明の in vitro 貪食 FITC ビーズの血清治療の培養のシンプルなアイデアに依存しているまたはオプソニン貪食を開始する培養 AMs の SRBCs。このメソッドには、広範な洗浄の手順と背景を減らすために nonphagocytized 赤血球の溶解が含まれます。付着の AMs を切り離すことには、注意が必要です。ACK 換散ソリューションを含む洗浄ステップを行う必要があります 1 分以内として長く洗濯時間につながる大食細胞の換散。
また...

AMs は、休止期、1 つ認識を介して免疫反応の主要なプレーヤーと吸入の病原体や異物1,2の内面化、肺胞で主要な居住者食です。午前貪食の欠乏はしばしば呼吸の結果、AMs が膿やクレブシエラ肺炎3,4など多くの肺病原体の迅速なクリアランスに欠かせないことが報告されています。などの感染症、急性肺炎死亡率と罹患率を引き起こす。
AMs は、サイトカインやケモカイン TNF α、il-1、ケモカインを生成し、炎症性好中球、単球を集める歯槽の環境の他の細胞のクロストークなどを生産することによって肺で生得的な炎症反応を開始するも、肺5適応免疫細胞。たとえば、AMs によって生成される il-1 は主要な上皮細胞6から好中球ケモカイン CXCL8 のリリースに役立ちます。また、AMs はアポトーシス多形核白血球 (Pmn) の貪食能、周囲の組織、組織の損傷の結果、長期の炎症細胞内酵素の持続的な漏出につながる Pmn からの失敗に貢献します。7,8,9。
AMs が貪食は、AMs のパターン認識受容器 (PRRs)、オプソニン病原体の AMs の免疫エフェクター受容体との結合による病原体の表面に病原体関連分子パターンの直接認識によって媒介されます。10します。 後者の AMs は、Fcγ 受容体 (FcγR) で免疫グロブリン (IgG) とオプソニン ターゲットを認識できるまたは補体の断片、C3b と発見及び C3bi、補体受容体を介して病原体被覆 (CR)11。補体受容体の中で免疫グロブリン スーパーファミリー (CRIg) の CR は組織マクロファージ12で選択的に発現し、最近の知見膿肺炎のコンテキストで午前食から CRIg の役割を強調表示13。
元の多くの研究は、マクロファージ機能14,15の分子メカニズムを記述するのにマクロファージ貪食能を評価するのにメソッドを使用します。しかし、生体内で貪食能のようなメソッドは、貪食の正確な定量を必要です。ここで、かに (FITC) を使用して生体外でそして生体内で貪食能の詳細な方法については要約-ガラス ビーズと膿緑色蛍光タンパク質 (GFP)、それぞれ。さらに、PRR、CR、および FcγR を介した細胞貪食の間で区別する方法をについて説明します。最後に、P.緑膿菌肺炎に関してマウスにおける細菌クリアランスをキャラクタライズ手法を報告する.

<table><tbody><tr><td>18-G ニードル</td><td>ニプロメディカル&nbsp;</td><td>CI+1832-2C</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>2,7-ジアミノフルオレン (DAF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D17106</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>18C27B</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>細胞生物学グレード</td></tr><tr><td>ACK 溶解バッファー</td><td>Life Technologies</td><td>A10492</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Z23373</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>C5 欠損血清&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1163</td><td>生化学試薬</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Labnet International</td><td>C0160-R</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A78300101 Issue 11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Cell Culture Media</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Cell Biology grade</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Cell Biology grade</td></tr><tr><td>Flowサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo ソフトウェア</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>デュモン</td><td>0508-SS/45-PS-1</td><td>実験動物の解剖に最適</td></tr><tr><td>FITCカルボキシル化ラテックスビーズ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4530</td><td>細胞生物学グレード</td></tr><tr><td>GFP-P. aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>101045GFP</td><td>適しているfor&nbsp;細胞感染アッセイ</td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>細胞生物学グレード</td></tr><tr><td>高圧シリンジ</td><td>ペンセンチュ</td><td>リーFMJ-250</td><td>実験動物用に適しています</td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>オムニインターナショナル</td><td>TH-01</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H1009</td><td>分析グレード</td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン塩酸塩</td><td>Hospira</td><td>CA-2904</td><td>医薬品グレード</td></tr><tr><td>Shandon Kwik-Diff Stains</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>9990700</td><td>細胞生物学グレード</td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>フィッシャー Scientific</td><td>BP1425</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP1427</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>MicroSprayer エアロゾライザー</td><td>ペンセンチュリー</td><td>IA-1C</td><td>実験動物の使用に適した</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>細胞生物学グレードの</td></tr><tr><td>ウサギ 抗SRBC-IgG&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>免疫アッセイ</td></tr>ウサギ<tr><td>抗SRBC-IgM&nbsp;</td><td>シダーラインラボラトリ</td>ーズ <td>CL9000-M</td><td>免疫測定に適した</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>Miltex</td><td>5-2</td><td>実験動物の解剖に適した</td></tr><tr><td>小動物喉頭鏡</td><td>ペンセンチュ</td><td>リーLS-2</td><td>実験動物での使用に適した</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>分析グレードの</td></tr><tr><td>スプリングハサミ(Med)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15012-12</td><td>実験動物の解剖に適しています</td></tr><tr><td>春のはさみ(小)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91500-09</td><td>実験動物の解剖</td></tr><tr><td>に適した羊の赤血球(SRBC)&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55876</td><td>洗浄、保存された SRBC</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>キシラジン&nbsp;</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-110-20</td><td>医薬品グレード</td></tr></tbody></table>

肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

肺胞マクロファージ (AMs) は、肺の肺胞腔をガードします。AMs によって貪食病原体、死んだ細胞や異物の除去に侵入戦防衛で重要な役割を果たしている、炎症反応、組織改造の解像度では、処理の様々 な表面の受容器によって仲介されます。AMs。ここで、in vitro および in vivo アッセイおよび実験的戦略を使用してパターン認識受容体-、補体受容体 - と受容体を介した Fc ガンマを区別する AMs の貪食能の分析方法を報告します。貪食。最後に、我々 は確立し体内細菌クリアランスを評価するためにマウスで膿性肺炎モデルを特徴付ける方法をについて説明します。これらの試金は午前の機能を評価する最も一般的な方法を表し、マクロファージの機能と他の臓器に細菌クリアランスの勉強にも使えます。

まずマウスで貪食能を分析する実験を行った主な AMs。すべての解析を通して WT ・ TRIM72KOマウスから分離した AMs を比較しました。図 1Aのように、蛍光顕微鏡プライマリ AMs 発生 1 時間後のマウスで FITC ガラスビーズの貪食能を明らかにしました。図 1Bは、フローサイトメトリーによる貪食の分析を示しています。貪食能の定量化測定顕微鏡やフローサイトメトリーはそれぞれ図 1Cと図 1Dで表されます。図 2Aで MH S 細胞による貪食を媒介 FcγR と CR を表し...

ここでマウス肺胞マクロファージおよび肺から細菌クリアランスの貪食能を分析するための一般的な方法を報告します。これらのメソッドは、フルオレセイン イソチオ シアン酸ビーズの貪食および緑膿菌緑色蛍光タンパク質の生体内で貪食能を検討します。マウスで膿をクリアするための方法について述べる。

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

緑膿菌はBSL-2レベルの病原体である。この生物を取り扱うときに、BSL-2レベルの安全慣行に従うことを忘れないでください。ここでは、初代細胞単離、生体内食作用、貪食経路解析、およびマウスにおける生体内食細胞化および細菌クリアランス評価について説明する。成功した気管内出産は、習得する練習を必要とします。マイクロスプレイヤーが適切にロードされていること、針が2つのボーカルフォールドの間にあり、プランジャー速度が適切に制御されていることを確認してください。まず、ペーパータオルで覆われた解剖板に手足を広げて、マウスを上手にして、前歯の下にひもを引っ掛けて頭を引っ込め、気管がまっすぐで高く配置されるようにします。70%エタノールでマウスを消毒し、通常の鉗子を使用して身体の中心線で皮膚を引き上げます。外科的はさみを使用して腹部から喉の上まで皮膚を切り取ります。慎重に喉の筋肉や結合組織を解剖するために標準的な外科用ハサミの鈍い端を使用してください。胸部の下の腹壁を開きます。横隔膜を切り、胸部の下部を切り取って肺を部分的に露出する。スプリングハサミを使用して気管を露出させ、鉗子を使用して軟骨リングをつかみる。マイクロハサミを使用して、気管の腹側面に約1.5ミリメートルの切開を慎重に行います。気管の下に縫合糸の短い長さを注意深くひもでつなぎ、気管に18ゲージのカニューレを挿入します。カニューレが所定の位置にある場合は、1回の洗浄につき1ミリリットルの新鮮なPBSで肺を3回軽く洗い流し、液を注射器にそっと引き出してから3回連続して肺に再注入します。各洗浄の後、収集した気管支肺胞洗浄液またはBALFを15ミリリットルの円錐管に移し、全収穫された流体の遠心分離を行う。2回目の遠心分離のために新鮮なPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、洗浄された肺胞マクロファージを10%非熱不活化ウシ胎児血清を補充したダルベックコの修正イーグルス培地またはDMEMの2ミリリットルに再中断します。その後、細胞インキュベーターで摂氏37度で2日間培養するために、一次肺胞マクロファージをガラス底ペトリ皿に移します。48時間後、培養液を1ミリリットルのPBSで洗浄してから、2ミリリットルの新鮮な培地で培養を供給する。次に、直径50マイクロメートルのカルボキシラスラテックスFITC共役ビーズを培養液に加え、セルインキュベーターで摂氏37度で1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、洗浄ごとに新鮮なPBSを1ミリリットルで5回広範囲に洗浄し、細胞外ビーズを取り除き、細胞内ビーズを含む細胞を数える100細胞を無作為に画像化する。オプゾニンゼーションアッセイの場合、ウサギの抗SRBC免疫グロブリンMまたはIgMの50マイクロリットルを室温で30分間、8番目の羊の赤血球またはSRBC

alveolar-macrophage-phagocytosis-and-bacteria-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここで、我々は、肺に先天性免疫細胞を常駐し、無水物ナノ粒子との共培養に応答して活性化を検討しているマウスの肺胞マクロファージを採取するためのプロトコルについて説明します。...

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

マクロファージは、多くの組織の恒常性と病理学の中心的な役割を果たしています。ここで紹介するプロトコルは、マクロファージを枯渇させるための方法について説明します...

マウスのマクロファージの枯渇と再構成

出典: Nagre, N. ほか。 マウスにおける肺胞マクロファージの食いと細菌の除去。 J. Vis. Exp.

オプソナイズド赤血球を用いた補体媒介食噬のモデル化

マウスマクロファージの付着培養を例にとりましょう。テストはWnt5A(シグナル伝達分子)を含むバッファーで丁寧に処理し、対照群はバッファーのみで処理します。細菌性病原体に感染させて孵化します。テスト細胞では、Wnt5Aがシグナル伝達カスケードを活性化し、細胞骨格の再編成を促進して細菌のファゴソームへの取り込みを促進しますが、このシグナル伝達を欠く対照細胞は体内化する細菌の数が少なくなります。体内に入っていない細菌を除去するために洗浄し、その後抗生物質を含む培地で培養して残った細胞外細菌を除去します。Wnt5Aシグナル伝達は、細菌を含むファゴソームをリソソームと融合させる準備をし、細菌の分解を可能にします。一部の細菌はファゴリソームを破って逃げ出します。対照細胞では、ファゴソーム成熟が限られているため、逃げ出が増加します。決められた時間点で細胞を採取します。蒸留水を加えて浸透圧ショックを誘発し、細胞を溶解させて細胞内細菌を放出します。溶解液を寒天プレートに広げて培養します。Wnt5A処理細胞におけるより大きな時間依存性細菌減少を評価するためにコロニー数を数えます。...

Wnt5Aを媒介したマウスマクロファージにおける細菌クリアランスの増強

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。...

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

宿主と病原体の相互作用に関するin vitro研究は特定の免疫応答の特性評価を可能にしますが、複雑な反応の影響を観察するにはin...

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

ここでは、癌転移における肺胞マクロファージの機能を研究するためのモデルとアプローチについて説明します。転移におけるこれらの細胞の役割を実証するために、クロドロン酸リポソームによる肺胞マクロファージの枯渇と併せて乳がんの同系(4T1)モデルを使用しました。...

乳がんの転移における肺胞マクロファージの役割を学びます

いくつかの方法は、マウスにおける細菌性肺炎をモデル化するための文献に記載されています。ここで、我々は、中咽頭にピペット細菌接種の吸引（ すなわち 、吸入）を介して肺炎を誘導するための非侵襲性の、安価で迅速な方法を記載します。肺の先天性免疫応答を評価するための下流の方法も詳しく説明されています。...

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

この通信は、人間から肺胞大食細胞の分離と培養の方法論や実験用マウスのモデルについて説明します。...

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

この原稿は、大気汚染物質であるオゾンへの曝露が生体内の肺胞マクロファージエフェロサイト症を損なうかどうかを決定するためのプロトコルを記述する。このプロトコルは、一般的に使用される試薬および技術を利用し、肺胞マクロファージエフェロサイトシスへの影響を決定するために肺損傷の複数のモデルに適応することができる。...

オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

このプロトコルは、肺間質マクロファージ(IM)の単離と、特発性肺線維症(IPF)の in vivo...

IL-33刺激マクロファージのブレオマイシン誘導マウスモデルへの養子導入によるin vivo特発性肺線維症への影響の研究(英語)

学ぶ肺胞マクロファージの貧食能解析とPseudomonas aeruginosaの細菌クリアランス評価法。マウスモデルを用いたin vitroおよびin vivo技術で免疫応答メカニズムを解明します。

肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス

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