Name: 破骨細胞形成と培養破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶ マウス長管骨から骨髄を採取し、M-CSFとRANKLまたはTNF-αを用いて破骨細胞を誘導する方法。Anti-c-fms抗体が破骨細胞形成と前駆細胞増殖に与える影響を評価し、炎症性骨疾患治療への応用可能性を示す。

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この作品は、日本学術振興会科研費の一部によって支えられた (第 16 K 11776 H. k.、第 17 K ・ k ・ s、第 16 K ・ k ・ K、第 16 K m ・ s、第 18 K I. m 09862 20636 に 20637 17306。) 学術振興会から付与。

すべての動物の手続きや動物の世話は、東北大学の諸規則に従って行われました。
1. マウスの後肢の郭清と処理
<ol><li>解剖前にコンテナーのサイズによって α MEM の約 50 mL のプレートを埋める、氷の上に置きます。これはすべてのボーンの郭清が完了するまでコレクションのコンテナーとなります。これおよびそれに続く実験は 100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 IU/mL ペニシリン G、α MEM 含む 10% 牛胎児血清 (FBS) を使用します。</li>
	<li>5% イソフルランの過量の吸入による c57bl/6 j マウスを安楽死させます。</li>
	<li>手のひらと足と 70% のエタノールで十分にスプレーを貫通ピンを使用して仰臥位でマウスを修正します。</li>
	<li>滅菌外科はさみとピンセットを使用してヒップのレベルで皮膚切開を行い、筋肉を公開するフィートに拡張します。</li>
	<li>アタッチする大腿四頭筋腱とハムスト リング筋を骨に接続する腱をカットします。股関節と膝の両方を公開する筋肉をはがします。これらの腱の検索タグ軟部組織を離れることがなく、添付ファイルから両方の筋肉を解放を緩和します。骨にはカットしません。</li>
	<li>大腿骨頭と関節腔のはさみの位置し、大腿骨の解放が、骨を維持するそれに切る。これは骨髄を公開することのリスクのない骨の剥離を有効になります。</li>
	<li>同様に脛骨にアタッチする筋肉を切り取る。汚染を避けるためにそのまま骨を保つ足関節で脛骨の添付ファイルから自由をカットします。</li>
	<li>大腿骨と脛骨のはさみの刃とキムワイプを使用してから任意の残りの軟部組織をこすり、氷上に置いた α MEM とプレートに。</li>
</ol>2. マウスの後肢骨髄分離
<ol><li>Α MEM で 30 G の針の注射器を満たしなさい。</li>
	<li>脛骨と大腿骨、膝関節から外します。</li>
	<li>はさみを使って両側から長い骨の両端をカットします。</li>
	<li>ピンセットを使用してシャフトから骨を押し、骨の骨髄空間に針を挿入ゆっくりと 6 cm 培養皿に骨髄のコンテンツをフラッシュします。骨は、骨髄のすべてのコンテンツの抽出を示す白に表示されます。すべてのボーンを繰り返します。</li>
	<li>ひずみ、骨髄は、50 mL の円錐形遠心管に 300 x gで 5 分間遠心 40 μ m ナイロンストレーナ セルを使用して抽出します。</li>
	<li>上澄みを廃棄、α-MEM の 5 mL で洗浄し、遠心 300 x gで 5 分間で合計 2 回の繰り返し洗浄。</li>
	<li>
Α MEM の 10 mL にペレットを再懸濁します、次のように診断を使用してセル数を実行します。
	<ol>
<li>0.4% トリパン 1.5 mL チューブに青の 10 μ L に細胞懸濁液の 10 μ L の追加によって細胞懸濁液の 1:1 希釈を行うし、一度ピペットします。</li>
		<li>スライド カバー付き検定室をカバーし、染料懸濁液を検定に転送します。いっぱいになる、商工会議所をアンダーフィルや毛管作用によってチャンバーには、サスペンションを許可することが重要です。</li>
		<li>顕微鏡のステージに、検定を配置します。対物レンズ 10 倍を使用すると、中央の四角形に焦点を当てます。3 行でバインドされているすべてのセルをカウントします。セルが 2 回カウントされますしないことを確認するために、それぞれの正方形の上部と右コーナーをカウントします。死んだ細胞は、濃い青色が表示されます、これらのカウントから除外されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>下流のアプリケーションに応じて適切な培養容器に細胞を播きます。この実験では、セクション 3 を参照してください。</li>
</ol>3. BMM の世代
<ol><li>種子 1 x 107セル/10 mL 10 cm の皿を文化し、M-CSF 100 ng/mL を追加します。M 脳脊髄液の最終濃度が 100 ng/mL の培養液です。37 ° c、5% CO2 3 日間の文化を孵化させなさい。</li>
	<li>3 日後培養培地を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 非付着性のセルを削除したり、部屋の温度 0.02% トリプシン-EDTA の 5 mL を追加する 2 回の 10 mL で精力的に PBS で洗浄、37 ° c、5% CO2 5 分の間孵化させなさい。</li>
	<li>徹底的なピペッティングにより細胞をデタッチします。(セルは丸みを帯びたとメディアで浮動表示する) 顕微鏡の下で文化を観察することによって、セルが切り離されていることを確認します。セル接続されたまま、徹底的にそれらをデタッチするピペッティングを繰り返します。セルが切り離されている場合は、反応を不活化する α MEM の 5 mL を追加します。</li>
	<li>50 mL の円錐管と 300 × gで遠心する 5 分破棄、上清にセルを収集し、α MEM の 5 mL で洗います。</li>
	<li>5 分 300 × gで遠心し、α MEM の 10 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>2.7.1 の手順で前述したように細胞数を実行します。</li>
	<li>種子 1 x 106セル/10 mL 10 cm の皿を文化し、M-CSF 100 ng/mL を追加します。M 脳脊髄液の最終濃度が 100 ng/mL の培養液です。37 ° c、5% CO2 3 日間の文化を孵化させなさい。</li>
</ol>4. BMM から破骨細胞の破骨細胞前駆体として生成
<ol><li>3 日後次の手順 3.2 3.7、破骨細胞の前駆体として BMM を表す接続されたセルを収穫します。</li>
	<li>96 ウェル プレートで α MEM の 5 × 104セル/200 μ L でシード BMM は。100 ng/mL の最終濃度 50 ng/mL または TNF α の最終的な集中の RANKL を追加します。各ウェルに 100 ng/mL の最終的な集中の M-CSF を追加します。</li>
	<li>抗 c-fms 抗体を追加 (最終濃度 0、1、10、100、1000 ng/mL) 各ウェルに。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2の 4 日間で孵化させなさい。4 日間毎日メディアを変更します。</li>
</ol>5. 酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) 染色
<ol><li>培養 4 日後優しく各ウェルの培養液を吸い出しなさい。それぞれ室温 1 × PBS の 200 μ L にも一度洗います。</li>
	<li>固定のため各ウェルに 10% ホルマリンの 200 μ L を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。吸引、ホルマリンとも各 3 回を脱イオン水で洗います。</li>
	<li>それぞれに PBS でトリトン X-100 が透過性よく、室温で 1 時間インキュベート 0.2% の 200 μ L を追加します。トリトン X-100 を吸引、脱イオン水で 3 回もそれぞれを洗ってください。</li>
	<li>各ウェルにトラップ染色溶液 200 μ L を追加します。顕微鏡下で汚れを視覚化します。適切に開発に汚れの 10-30 分からかかるでしょう。</li>
	<li>汚れと洗浄 3 回、脱イオン水でよく、空気が乾燥を吸い出しなさい。詳細な観測で使用する室温で維持します。</li>
</ol>6. 拡散の試金
<ol><li>96 ウェル プレートで α MEM の 5 x 103セル/200 μ L で破骨細胞前駆体として種子 BMM は。各ウェルに 100 ng/mL の最終的な集中の M-CSF を追加します。</li>
	<li>抗 c-fms 抗体を追加 (最終濃度 0、1、10、100、1,000 ng/mL) と 37 ° C、5% CO2中変更することがなく 3 日間で孵化させなさい。</li>
	<li>3 日後 1 × PBS のセルを洗浄します。各ウェルに 100 μ L α MEM を追加します。</li>
	<li>キット ソリューションを数えるセルの 10 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2 2 時間インキュベート、450 各ウェルの吸光度を決定する nm マイクロ プレート リーダーを使用しています。</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

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本研究では RANKL による破骨細胞形成、TNF α による破骨細胞形成と M CSF による破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体を調べた。破骨細胞形成 RANKL による破骨細胞形成・ TNF α による破骨細胞形成・ M CSF による破骨細胞前駆細胞の増殖を阻害する抗 c fms 抗体の有効量は異なることがわかった。
RANKL は、M-CSF の in vitro での存在下での破骨細胞形成を仲介してランク null マウス経験15,このように RANKL は破骨細胞形成に必須のサイトカインでありを開発する破骨細胞の障害により重篤な大理石骨、骨代謝に重要な規定する役割。したがって、RANKL による破骨細胞形成を制御することができます、もし減少骨の質量を制御することができます。ただし、過度の抑圧が発生すると、骨の恒常性は維持されません。この実験では、高濃度 100 ng/ml RANKL による破骨細胞形成を減少できるようにする必要がありますその対策 c fms 抗体を示します。
<p ...

破骨細胞は専門性の高いセルであり、彼らは複数の破骨細胞前駆体の融合による造血幹細胞から区別します。彼らは健康な骨の改造のために不可欠であり、リウマチ性関節炎など歯周疾患1炎症性骨疾患に関連付けられている病的骨吸収に貢献。
破骨細胞形成と破骨細胞の機能は、2 つの重要要因によって仲介されます。マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体の活性化。M-CSF と RANKL は破骨細胞分化2にとって重要です。骨髄マクロファージからの破骨細胞形成を誘導するために示されているもう一つの要因は、腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α)3,4,5です。TNF α を介した破骨細胞形成関節リウマチ6、歯周疾患7、閉経後骨粗鬆症8などの破壊的な骨の病気で骨溶解のために重要であることが示されています。
C fms M CSF の膜受容体で、その作用を仲介します。C fms の役割が、ことを示したこと、c-fms (抗 c-fms 抗体) 抗体の完全に関節炎モデルにおける破骨細胞形成を逮捕し同様管理 TNF-α 誘導しながら骨びらんと文献に記載されています破骨細胞形成遠い炎症関節からまだ堅牢な9歳だった。抗 c-fms 抗体の投与マウス研究10同様 LPS 誘導性歯周炎モデル11.のようにリポ多糖 (LPS) による破骨細胞形成と骨吸収を抑制また、抗 c-fms 抗体抑制中矯正歯の移動だけでなく、矯正学的歯の移動12、機械的応力誘起歯根と骨の矯正学的歯の移動13に関連付けられています。
M-CSF は、宿主の免疫応答に不可欠な他の機能が報告されています。Op/op 細菌性肺炎でマウスの M-CSF の不在14肝細胞壊死と肝臓に細菌の散布や細菌の負担の増加に します。したがって、M CSF は感染症からの保護に免疫応答のために重要です。
本研究は、TNF α や RANKL M CSF に及ぼす抗 c-fms 抗体による破骨細胞形成の in vitro および M CSF による破骨細胞前駆細胞の増殖を示します。このプロトコルは、長い骨と破骨細胞前駆細胞とみなされる骨髄マクロファージ (BMM) を生成し、2 BMM の多核破骨細胞への分化を誘導する手順からマウス骨髄細胞の分離を示しますメソッド;RANKL または TNF α。プロトコルはまた、抗 c-fms 抗体を使用して両方の方法で破骨細胞形成の逮捕を比較します。
骨髄を抽出し、その後破骨細胞前駆体を生成するために使用するプロセスは、薬物検査など複数のダウン ストリーム アプリケーションで使用することができます純粋な破骨細胞文化の大量に生産で信頼性の高いです。このプロトコルでは破骨細胞形成を誘導する RANKL または TNF α の使用を区別する破骨細胞形成 (RANKL) の生理学的なプロセスとして破骨細胞形成から病理学的プロセス (TNF α)、順番をガイドする 2 つの代替手段を提供します。決定は 1 つが下流のアプリケーションで使用する試薬の面で優れています。このプロトコルはまた、我々 が適切な骨吸収と骨疾患に関連するその後の研究の安全に使用することができます反 c fms 抗体濃度を判断できますメソッドを提供します。

<table><tbody><tr><td>抗c-Fms抗体</td><td></td><td></td><td>AFS98、ラットモノクローナル、抗マウス、c-Fms抗体(IgG2a)</td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td></td><td></td><td>組換えマウスTNF-&α;当研究室で調製。TNF-&アルファ;RT-PCRによってクローニングし、pGEX-6P-I(Amersham Biosciences、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)にクローニングしてGST融合タンパク質を作製したcDNAフラグメント。GST-TNF-&アルファ;大腸菌BL21細胞細胞(Stratagene、La Jolla、CA)で発現しました。細胞は、非変性条件下で、GST-TNF-&alpha;グルタチオン-セファロースカラムで精製しました。GSTは、PreScission Protease(Amersham Biosciences)によってメーカーによって切断されました。の方向を示し、グルタチオン-セファロースカラムによって除去されました。</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td></td><td></td><td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&ndash;12細胞株培養上清(5x106&nbsp;10 cmの懸濁培養皿に細胞を入れます。</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>和光</td><td></td><td>L-グルタミンとフェノールレッド</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>ウシ胎児血清 フランス起源</td></tr><tr><td>培養皿</td><td>コーニング</td><td></td><td>100 mm x 20 mm スタイル皿</td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td><td></td>ック <td>ヌン クローン デルタ表面</td></tr><tr><td>細胞計数キット-8</td><td>熊本</td><td></td>県同人堂<td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Sunrise REMOTE;テカンジャパン、川崎、日本</td><td></td><td></td></tr>セル<tr><td>ストレーナー</td>コー<td>ニング</td><td></td><td>40 &mu;m ナイロン</td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>コーニング</td><td></td><td>50 mL セントリスターキャップ</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>和光</td><td></td><td>ポリオキシエチレン (10) オクチフェニルエーテル</td></tr></tbody></table>

破骨細胞形成と培養破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

骨リモデリングは複雑なプロセスで、沈着と吸収の期間が含まれます。骨は、骨はさまざまな刺激への応答で破骨細胞によって分解プロセスです。破骨細胞前駆体は、マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体活性化に応えて核破骨細胞に分化します。病理学的条件下でサイトカイン プロファイルが異なっており、炎症性サイトカインの混合物が含まれます。腫瘍壊死因子 α (TNF-α) は、炎症性融解に関与する領域に大量にある最も重要なサイトカインの一つです。このプロトコルの目的は、M-CSF と RANKL や TNF α 受容体抗体抗 c fms の線量の増加によってその後抑制が誘導を介して破骨細胞を生成する、骨髄に分離された方法を提供するにはM-CSF。この実験では、炎症性骨吸収の疾患における抗 c fms 抗体の治療上の価値を強調表示されます。

このプロトコルの目的は、RANKL や TNF α 存在下での破骨細胞形成に及ぼす抗 c-fms 抗体を評価し、M-CSF の破骨細胞前駆細胞の増殖に及ぼす影響を決定するためです。このプロトコルでは、純粋な破骨細胞文化の大量生成する信頼性の高いプロセスを実施しています。異なる培養条件下での破骨細胞の形成を阻害する抗 c-fms 抗体適切な濃度をテストする方法を行っています。
M の破骨細胞形成-CSF + RANKL 抗体抗 c fms 文化は図 1に示します。1、10 ng/mL 抗 c fms 抗体、コントロール (0 ng/mL) と比較して破骨細胞数の有意な減少はありませんでした。一方で 100、1,000 ng 対策 c fms 抗体、コントロールと比較して破骨細胞数の大幅な減少があった。抗 c-fms 抗体を持つ M CSF + TNF-α 文化における破骨細胞形成は<strong...

このプロトコルにはマウス長管骨および骨髄分離、骨髄のマクロファージを生成し、破骨細胞マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体活性化剤を使用するが含まれていますか腫瘍壊死因子 α (TNF-α) と M-CSF 受容体抗体抗 c fms によって彼らの逮捕。

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

この実験は、関節リウマチや歯腸炎などの炎症性骨破壊の疾患における抗c-fms抗体の治療価値を強調する。骨髄を抽出し、破骨前駆体を生成するために使用するプロセスは、複数の下流のアプリケーションで使用することができる純粋な破骨細胞を大量に生成します。このプロトコルは、RANKLリガンドまたはTNFアルファを使用して、骨切膜形成の2つの代替方法を提供する。それに加えて、この方法は、骨鎖骨形成に対する抗c-fms抗体の効果に関する洞察を提供する。この手順の視覚的なデモンストレーションは、解剖および大量の骨髄細胞を得るプロセスに研究者を理解しています。容器の大きさに応じて約50ミリリットルのアルファMEMを用いた回収容器となるプレートを充填し、氷の上に置きます。ピンを使用して安楽死させたマウスの手のひらと足を貫通して、スーピンの位置に固定し、70%エタノールで十分にスプレーします。無菌の外科用ハサミとピンセットを使用して、股関節のレベルで皮膚切開を行い、筋肉を露出させ、足まで伸ばします。四頭筋を付ける腱を見つけて切ります。筋肉を剥がし、腰のレベルで切ります。その後、骨にハムストリングの筋肉を取り付ける腱を見つけます。骨を露出する筋肉を剥がし、ハムストリングを付着から解放し、骨に切り込まないようにします。大腿骨の頭部と関節空間の間にはさみを置きます。大腿骨を解放するが、骨をそのまま維持し、骨髄を露出させるリスクなしに骨の剥離を可能にする。同様の方法で脛脛に取り付けられた筋肉を切り取ります。その後、汚染を避けるために骨をそのまま保ちながら、足首関節の付着から脛骨を切り取ります。はさみブレードとラボワイプを使用して、大腿骨と脛骨から残っている軟部組織を削り取り、氷の上に置かれたアルファMEMで準備されたプレートに入れてください。汚染を最小限に抑えるために、解剖は慎重に行われるべきである。そのため、徹底的な軟部組織除去と骨の局在化が重要です。アルファMEMで30ゲージ針の注射器を充填します。脛骨と大腿骨を膝関節から切り離し、はさみを使用して両側から長い骨の端を切断します。ピンセットを使用して、シャフトから骨を保持します。骨に骨髄空間に針を挿入し、ゆっくりと6センチメートルの培養皿に骨髄の内容を洗い流し、すべての骨のために繰り返します。骨は白色になり、すべての骨髄含有量の抽出を示す。40マイクロメートルのナイロンセルストレーナーを使用して、骨髄抽出物を50ミリリットルの円錐形遠心分離管に歪まします。チューブを5分間Gの300倍に遠心分離する。上清を捨てます。洗浄するには、5ミリリットルのアルファMEMをペレットに加えます。ピペット細胞を取り外し、遠心分離し、合計2回洗浄を繰り返します。これらの単離細胞を数えた後、原稿に記載されているように、10ミリリットル当たり1000万個の細胞を、10センチメートル培養皿に入れ、細胞にM-CSFを加える。37°C、5%の二酸化炭素で3日間培養します。培地を3日後に取り出し、10ミリリットルのPBSで細胞を2回激しく洗い、非接着性細胞を除去する。室温0.02%トリプシンEDTAとPBSの5ミリリットルを加え、摂氏37度、5%の二酸化炭素で5分間インキュベートします。細胞を徹底的にピペットして取り外します。顕微鏡で培養を観察し、細胞が剥離し、丸みを帯びて浮遊しているように見えるようにします。細胞が剥離したら、5ミリリットルのαMEMを添加して反応を不活性化する。5分間Gの300倍で50ミリリットル円錐形チューブと遠心分離機に細胞を収集します。上清を捨て、5ミリリットルのアルファMEMで洗浄し、遠心分離機をGの300倍で5分間再び洗浄します。アルファMEMの10ミリリットルでペレットを再懸濁します。10センチメートルの培養皿で10ミリリットル当たり100万個の細胞をシードし、M-CSFを加えます。37°C、5%の二酸化炭素で3日間培養します。BBMの生成中に以前に行われたように、3日後に破骨前駆体としてBBMを表す付加細胞を収穫する。BPMをアルファMEMの200マイクロリットルあたり50,000細胞に96ウェルプレートで播種します。各井戸に、所望の刺激を加える。そして、ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度のためのM-CSFを追加します。各ウェルに抗c-fms抗体を追加します。1日おきに4日間メディアを交換しながら、プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素を4日間インキュベートします。そして、原稿に記載されているように、染色およびアッセイを進める。M-CSFおよびRANKL処理培養における破骨細胞形成を、抗c-fms抗体を用いて、評価した。1ミリリットル当たり000ナノグラムの抗c-fms抗体を用いて、コントロールと比較して破骨細胞の数の有意な減少が観察された。一方、1ミリリットル当たり10ナノグラムに1個の抗c-fms抗体では、有意な減少はなかった。次に、M-CSFおよびTNFα中の破骨細胞形成を処理培養し、抗c-fms抗体を用いて、評価した。1ミリリットルの抗c-fms抗体あたり10,100,1,000ナノグラムでは、1ミリリットル当たり1ナノグラムで有意な減少を伴い、対照と比較して破骨細胞の数の有意な減少が認められた。M-CSF培養物とはミリリットル当たり1,10,100ナノグラムの抗c-fms抗体で、対照と比較して破骨前駆体の数に有意な減少はなかった。しかし、1ミリリットル当たり1,000ナノグラムでは、破骨細胞前駆体の数が有意に減少し、1ミリリットル当たり1,000ナノグラムの濃度が、破骨細胞前駆体の増殖を有意に阻害するために必要であることを示す。汚染の可能性を最小限に抑える骨をそのままにしたまま、ボンズを解放するようにしてください。

effect-anti-c-fms-antibody-on-osteoclast-formation-proliferation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ マウス長管骨から骨髄を採取し、M-CSFとRANKLまたはTNF-αを用いて破骨細胞を誘導する方法。Anti-c-fms抗体が破骨細胞形成と前駆細胞増殖に与える影響を評価し、炎症性骨疾患治療への応用可能性を示す。

破骨細胞形成と培養破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体

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