Name: メキシコの血脈遺伝子機能の操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学ぶTol2トランスジェネシス、CRISPR/Cas9ゲノム編集、モルフォリノノックダウンによるAstyanax mexicanusの遺伝子操作法。これらの技術は、洞窟魚と表層魚の表現型変異の遺伝的基盤を解明し、進化適応の理解を深めるために不可欠です。

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著者は Sunishka Thakur のジェノタイピングおよび図 2にoca2変異体の魚をイメージングで彼女の援助をありがちましょう。この作品は、国立科学財団 (NSF) 賞を受賞 1656574 A.C.K.、j. k.、A.C.K.、NSF 賞 1754321、A.C.K. と E.R.D. に国立衛生研究所 (NIH) 賞 R21NS105071 に支えられ

著者が明らかに何もありません。

ここでは、我々 は morpholinos、編集、CRISPR/Cas9 遺伝子および遺伝子導入方法論を用いた遺伝子機能を操作するための方法論を提供しました。遺伝子技術の富とゼブラフィッシュのこれらのシステムの最適化されます可能性が高い容易52 A. メキシコにこれらのツールの転送できます。最近の知見は、 A. メキシコでこれらのアプローチを使用しているが、彼らはこのシステム30,36,42で多様な形態的・発達・行動特性の調査で使用率の低いまま,53。
Morpholinos は、遺伝子の発現をノックダウンするゼブラフィッシュ研究で広く使用されています。アプローチは簡易式の堅牢なノックダウンであり。しかし、オフターゲット効果されて広く文書化された...

ダーウィンの種の起源1、以来科学者は洞窟生物2のおかげで、定義された環境および生態学的な圧力への応答では、形質が進化の過程で形づけられるに深い洞察力を得ています。メキシコのテトラ、 A. メキシコメキシコと南テキサス中の河川に生息する目の祖先 '表面' 集団シエラ ・ デル ・ アブラに生息する派生洞窟モーフの少なくとも 29 の地理的に隔離された集団の構成と北東メキシコ3の他の領域。A. メキシコ、変更された酸素消費量、色素脱失、目の損失餌と採餌行動4,5,6、変更などで識別された洞窟関連形質の数 7,8,9。独立して明確に定義された進化の歴史、生態学的環境の詳細な評価との存在により収斂進化のメカニズムを調査するための強力なモデル進化洞窟A. メキシコプレゼント人口10,11。血脈、目の損失などがある、睡眠の損失、餌、スクーリングの損失の増加、侵略を減少とストレス反応を減少、独立した起源は、しばしば活用を通じて複数回を進化している洞窟の派生形質の多く様々 な遺伝的経路間8,12,13,14,15の洞窟します。これには、 A. メキシコシステムの強力な側面は、どのように遺伝的システムのより一般的な質問への洞察力は似たような表現型を生成するため、提供して進化が繰り返されます。
ゼブラフィッシュにおける最近の進歩が魚の遺伝的技術開発の基礎を提供する遺伝子の機能解明のための遺伝子の技術のアプリケーションは、多くの魚種 ( A. メキシコを含む) に限定されている、しながら16、17、18、19,20。数多くのツールは遺伝子発現を操作するゼブラフィッシュで広く使用されて、これらの手順の実装を標準化されている長い間。たとえば、単細胞段階で morpholino oligos (MOs) の噴射は選択的に RNA をブロックし、開発21,22中簡単な時間窓の変換を防ぐことができます。さらに、遺伝子編集アプローチなど定期的にクラスター化された空間短い回文繰り返し (CRISPR) CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) と転写活性化因子のようなエフェクター ヌクレアーゼ (TALEN) に定義された削除の生成を可能にします。または、いくつかのケースでは、ゲノム19,20,23,24の再結合を挿入します。遺伝子は、細胞型固有の方法で安定した遺伝子発現または関数の操作に使用されます。メダカ Tol2システムを効果的に coinjecting トランスポサーゼによるトランスジェニック動物を生成する使用 transgene25,26を含んでいるメダカ Tol2 DNA プラスミッドと mRNA。メダカ Tol2システムは、安定した生殖細胞系遺伝子組換え construct17 の挿入を生成するめだかのメダカ Tol2転移を利用しています。メダカ Tol2遺伝子組み換えを生成するには、メダカ Tol2転移17メダカ Tol2統合サイトと mRNA が並ぶ遺伝子を含むプラスミドを coinjecting が含まれます。ゼブラフィッシュにおけるトランスジェニックは行の配列を生成するこのシステムを使用されているし、その使用は最近追加する創発モデル システム、シクリッド、メダカ、トゲウオなどに拡大し、もっと最近のメキシコ毒27、 28,29,30です。
血脈は形質の進化のメカニズム解明のための魅惑的な生物学的システムが、進化モデルとしてその完全な能力が完全に利用されてないです。これは部分的に遺伝子を操作することができないのためにされており、携帯機能直接31。複雑な形質を制御する候補遺伝子群は量的形質遺伝子座 (QTL) の研究を使用して識別されているが、これらの候補者の遺伝子の検証は困難な32、33,34。最近では、morpholinos、遺伝子 CRISPR と TALEN システムとメダカ Tol2の使用を使用して編集を使用して一時的なノックダウン-仲介された遺伝子の遺伝的基盤の特徴35、36、37の数を調査する使用されています。、38。定義された細胞集団の標識遺伝子機能の操作を含む、生物学的特性の分子・神経基盤の調査操作の実装とこれらの技術の標準化可能になると機能的な記者の式です。遺伝子や細胞の機能を操作するこれらの遺伝的ツールの実装を成功させる、創発モデル システムで実証されているに対し、詳細なプロトコルはまだA. メキシコに欠けています。
A. メキシコ環境の変化への応答の進化のメカニズムに重要な洞察力を提供する、多様な特徴を制御する新規遺伝子群を特定する機会を提示します。A. メキシコ研究室、ひな大型の魚を簡単に維持する能力を含む、確立された遺伝的モデルで現在利用可能な確立されたゲノム ツールの適用の非常に扱いやすいモデルである要因の数が提案します。透明性、配列されたゲノムと定義された行動アッセイ39。ここでは、morpholinos、遺伝子導入、遺伝子編集a. メキシコの表面と洞窟の集団での使用のための方法論について述べる。血脈と表層魚群の発達、生理学、行動の違いの進化の基礎となる分子プロセスに制御機構解明のためA. メキシコでこれらのツールの広範なアプリケーションになります。

<table><tbody><tr><td>魚の繁殖&卵供給</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fineメッシュフィッシュネット</td><td>ペンプラックス</td><td>BN4</td><td></td></tr><tr><td>魚のタンク</td><td>ヒーターAqueon</td><td>100106108</td><td></td></tr><tr><td>卵トラップカスタム</td><td>メイド</td><td>NA</td><td>卵を保護するためにタンクの底に置くプラスチック格子を設計し、作成します</td></tr><tr><td>ガラスピペットフィ</td><td>ッシャーScientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>ピペット電球</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>卵型</td><td>適応科学ツール</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Morpholino supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control Morpholino</td><td>Gene Tools, LLC</td><td>標準制御 olio</td><td></td></tr><tr><td>Custom Morpholino</td><td>Gene Tools, LLC</td><td>NA フェ</td><td></td></tr><tr><td>ノール レッド</td><td>シグマ Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><<tr><td>em>CRISPR supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Plasmid</td><td>AddGene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA ポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>KOD ホットスタート Taq</td><td>EMD Millipore</td><td>71-842-3</td><td></td></tr><tr><td>プライマー</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td>T7 Megascript キット</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T3 kit</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 transgenesis supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-zT2TP plasmid</td><td>Kawakami et al., 2004</td><td>Request from senior author</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF Restriction Enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SP6 mMessenger キット</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス キャピ</td>ラリー<td>チューブ サッター機器</td><td>BF100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ピコインジェクター</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>ワールド精密機器</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレータースタンドワールド</td><td>精密機器</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>ミクマニピュレーターベース</td><td>ワールド精密機器</td><td>鋼板ベース、10ポンド</td><td></td></tr></tbody></table>

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

洞窟動物は進化のメカニズムと遺伝的基盤で目の変性、白子症、睡眠不足、過食、感覚処理など、多数の複雑な特性の変化を調査するため説得力のあるシステムを提供します。世界中から毒の種は洞窟システム間共有の環境圧力のための形態および行動の特性の収斂進化を表示します。多様な種は、実験室の設定で研究されている.晴眼者と視覚障害者のフォームで、メキシコのテトラアステュアナクス メキシコ、複雑な形質の進化の基礎となる生物学的および分子プロセスのユニークな洞察を提供している、新興のモデル システムとしてふさわしい。多様な生物学的過程の進化を制御する候補遺伝子群は、A. メキシコで発見されている、しながら、個々 の遺伝子の役割を検証する機能が制限されています。遺伝子と遺伝子編集技術のアプリケーションには、この大きな障害を克服するために、複雑な形質の進化のメカニズムを調査する可能性があります。ここでは、 A. メキシコにおける遺伝子発現を操作するための別の手法について述べる。メダカ Tol2遺伝子、morpholinos の使用を組み込むし、遺伝子編集システム、頻繁に使用されるゼブラフィッシュと他の魚をモデルに、 A. メキシコで遺伝子の機能を操作します。これらのプロトコルには、タイミングの繁殖手順の詳細な説明、受精卵、注射、および遺伝子改変動物の選択のコレクションが含まれます。A. メキシコの多様な形質の進化の遺伝学的および神経メカニズムの調査のためこれらの方法論的アプローチになります。

洞窟住居a. メキシコの複数の集団は、減少睡眠とその海面にすむ個体14を基準にして覚醒/活動の増加を示しています。オレキシン/ヒポクレチン (HCRT) は覚醒を増加する行為は、非常に節約された神経ペプチドと人間および他哺乳類47,48HCRT 経路の異常引き起こすナルコレプシー。我々 は以前、洞窟を示しているA. メキシコは、このペプチドの発現増加が血脈38睡眠の損失の根底にあることを示唆している HCRT ペプチドの発現を増加しています。Hcrt式の MO のノックダウンは、直接血脈の睡眠の損失を媒介増加hcrt式の効果を調べるための強力なアプローチを提供します。
Hcrt式と睡眠との関係を調べる、翻訳ブロック morpholino を考案しました。ATG を含む 1 つは、エク...

進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos を使用して、式のノックダウンを使用してゲノムの対象となる操作。これらのツールは、表面と洞窟の住居形態の間変化を根底にある遺伝子の直接の調査を促進するべき。

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

洞窟動物は、多様な形態、発達、行動特性を調査するための説得力のあるシステムを提供します。しかし、このモデルシステムを確立する際の制限要因の1つは、遺伝子機能を操作できる遺伝的ツールの欠如です。ここでは、メキシコの洞窟魚、アスティアナックス・メキシカンスの遺伝子機能を操作するための3つの異なるアプローチを示します。これらのツールは、表面魚と洞窟魚の間の自然なバリエーションの根底にある遺伝子の調査と、それらが型素型とどのように関連しているかを調査することを可能にします。私の研究室の才能あるポスドクであるベサニー・スタールは、この手順をデモンストレーションします。手順を開始する前に、魚のシステムの水に溶解した暖かい3%アガロースで100ミリリットルのペトリ皿を充填し、慎重に45度の角度でアガロースに卵射出型を入れ、金型の下の空気をトラップしないようにアガロースにゆっくりと下げます。アガロースが固まったら、慎重にカビを取り出し、最大1週間、摂氏4度でプレートを保管してください。その後、ボロケイ酸ガラスの毛細血管とメーカーのガイドラインに従って電極針の引き手から針を引っ張ります。注射日には、ガラスピペットを使用して単一細胞の卵を注入プレートに移し、1行あたり30〜40個の卵で最大5列の注入プレートを充填します。少量の魚のシステム水で卵を水分補給してください。氷の上にモルフォリーノを解凍し、長いマイクロローダーピペットチップを使用するか、最後に2〜4マイクロリットルボーラスを追加することによって、卵あたり400ピコグラムのモルフォリノが注入されるように注入液を調製します。すべての針がロードされたら、鉗子を使用して注射針の先端から余分な長さをトリミングし、最初の針をピコリットルマイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付けます。次に、注射皿を解剖顕微鏡の下に置き、マイクロマニピュレーターを使用して各卵を針で浸透させ、モルフォリーノ注射液のナノリットルを直接黄身に注入します。CRISPR注射の場合、25ピコグラムのガイドRNAとCRISPR関連タンパク質9メッセンジャーRNAの300ピコグラムを混合し、得られたRNA溶液の2ナノリットルを各胚に注入します。Tol2トランスポザーゼとTol2横ばいプラスミド注射の場合、Tol2メッセンジャーRNAのマイクロリットル当たり25ナノグラムを、RNaseフリーウォーターのトル2プラスミドコンストラクトのマイクロリットル当たり25ナノグラムとフェノールレッドを組み合わせます。その後、ちょうど実証したように、各胚に1ナノリットルの溶液を注入します。モルフォリーノ注入動物を注射後4日でスクリーニングするには、目的の遺伝子に応じて、魚の幼虫をステレオ顕微鏡で可視化し、注射された動物の表現型を観察するか、またはビデオ記録に挙動を測定する。CRISPRインデルをスクリーニングするには、CRISPR注入胚をPCRチューブに移し、ポリメラーゼ連鎖反応またはPCR分析のための標準的なDNA抽出プロトコルに従ってDNAを抽出します。突然変異を評価するには、3%アガロースゲルで3%のアガロースゲルでPCR産物の5マイクロリットルを3時間実行します。野生型の非変異体化DNAは異なるバンドをもたらし、変異体DNAはスミアバンドをもたらす。洞窟 コントロールモルフォリーノを注入したメキシカンは、スクランブルモルフォリーノを注入した表面魚と比較して、24時間にわたって有意により多くの運動活動と睡眠の減少を示す。ヒポクレチンオレキシンモルフォリーノの注射は、対照注入魚と比較して表面魚の睡眠にほとんど影響を与えません.対照的に, モルフォリーノ注射によるヒポクレチンオレキシンノックダウンは、洞窟に住む魚の睡眠に大きな影響を与えます, ヒポクレチンオレキシン発現と睡眠喪失との間の直接的なリンクを提供.表面魚中のアルビニズム遺伝子OCA2のCRPSR媒介性変異誘発は、野生型OCA2陽性対立遺伝子の一部の個体にホモ接合をもたらし、また、CRISPR変異OCA2陰性対立遺伝子の2つのコピーを有する個人はアルビノであり、変異OCA2遺伝子とアルビンの間に直接的なリンクを提供する。安定したF1ラインを生成するために、トランスジーンを戻して野生のタイプに戻ってトランスジーンに送信するF0の正を選択します。これにより、生きたカルシウムイメージングが可能になり、神経活動の違いを明らかにし、洞窟環境の行動変化を媒介し、メキシカンスの遺伝子機能を特徴付け、操作するための多くの追加のトランスジーンの発現の基礎を築く。覚えておくべき最も重要なことは、卵をプレートにしっかりと積み込み、針を適切にトリミングし、マイクロインジェクションを最適化することです。遺伝的ノックダウン、トランスジーン統合、またはCRISPR媒介遺伝子編集に成功した後、これらの魚は発達、行動、および脳活動分析に使用することができます。

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JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオでは、洞窟魚の1細胞期にマイクロインジェクションされた翻訳ブロッキングモルフォリノスを使用した遺伝子ノックダウン技術について説明しています。モルフォリノは、標的mRNAの相補配列に結合し、タンパク質への翻訳をブロックするDNAオリゴヌクレオチドです。その結果、モルフォリノは、遺伝子の発現を一過性に停止または減少させるための分子ツールとして使用されます。...

モルフォリノ媒介遺伝子編集:単細胞洞窟魚卵におけるトランスレーショナルブロッキングモルフォリノオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子ノックダウン技術

本稿では、アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチドを​​用いて成体ゼブラフィッシュの終脳の心室細胞における遺伝子発現の操作のための方法を示しています。私たちは、大人の脊椎動物の脳の機能的な研究のために使用することができ、効率的かつ迅速なプロトコルとして、この方法を提示する。...

モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

私たちは、Branchiostomaのlanceolatumの未受精卵母細胞へのmRNA注入後、ここで蛍光タンパク質の堅牢かつ効率的な発現を報告している。この基底脊索動物におけるマイクロインジェクション技術の開発は、in vivoイメージングと遺伝子特異的な操作に含めて、この新たなモデル系で遠大な技術革新のための道を開く。...

蛍光タンパク質の発現において Branchiostoma lanceolatum未受精卵へのmRNA注入による

トランスジェニック操作およびゲノムの編集は、機能的遺伝子とシス -regulatory要素の役割をテストするために重要です。ここでは、ゲノム（Tol2の媒介蛍光レポーター導入遺伝子構築物を含む、TALENs、およびCRISPRs）の変更を生成するための詳細なマイクロインジェクションプロトコルが緊急モデルの魚のために提示され、イトヨ。...

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

遺伝子標的化突然変異誘発は、ゲノム編集の技術を使用して、生物の幅広いことが可能です。ここで、我々はアステュアナクスmexicanus、表面の魚や洞窟魚が含まれて魚の種におけるエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）などの転写活性化因子を用いて標的遺伝子の突然変異誘発のためのプロトコルを示しています。...

ゲノム編集中<em&gt;アステュアナクスmexicanus</em&gt;使用して転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）

このプロトコル我々 はアステュアナクス メキシコ大人を繁殖、幼虫を上げる手順をデモンストレーションし、表面の表現型を比較し、型の洞窟後仔魚にホール...

Post-larval 表現型解析およびホール マウント免疫組織化学のためメキシコ テトラアステュアナクス メキシコの調達

ここでは、行動と生体染色、メカノセンシング メキシコの血脈のシリーズの高スループット研究の手法を提示します。これらのメソッドは、動作研究実用的かつコスト効果の高い方法を提供するフリー ソフトウェアとカスタム...

行動追跡とメキシコの血脈の Neuromast イメージング

このプロトコルは、胚のアステュアナクス血脈遺伝子発現可視化を実現。 にします。このアプローチは非特異染色を最小限に抑えながら遺伝子式信号を最大の目標としてきた.

In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount

このプロトコルは、歩行動作とメキシコの血脈睡眠を定量化するための方法論を詳しく説明します。前の分析は、これら社会的収容魚の動作を測定するため拡張されています。このシステムは、睡眠と他の魚種の活動に関する研究に広く適用できます。...

睡眠とメキシコの血脈の自発運動の自動測定

体外受精は、ラボ集団を維持し、下流アプリケーション用に同期胚を生成するために、様々なモデル生物と一般的に使用される技術です。ここでは、メキシコのテトラ魚、アスティアナックスメキシコの異なる集団のためにこの技術を実装するプロトコルを提示します。...

アスティアナックスメキシコのガメテコレクションと体外受精

この記事では、発達および進化研究の新たなモデルであるメキシコの四元...

アスティアナックスメキシカンスにおける最大繁殖と産卵の昇温温度変化

学ぶTol2トランスジェネシス、CRISPR/Cas9ゲノム編集、モルフォリノノックダウンによるAstyanax mexicanusの遺伝子操作法。これらの技術は、洞窟魚と表層魚の表現型変異の遺伝的基盤を解明し、進化適応の理解を深めるために不可欠です。

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

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