Name: ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぶ脂質被覆ナノ粒子の急速注入法による作製とヒト間葉系幹細胞による取り込み。Falcarindiolを封入したナノ粒子の細胞内動態を蛍光・共焦点顕微鏡で観察し、がん治療への薬物送達システムとしての可能性を示す。

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著者らは、ヒト間葉系幹細胞を博士 Moustapha クファールカッセム (デンマーク、オーデンセ大学病院) をありがちましょう。著者は、デンマークの医療バイオ イメージング センターの顕微鏡へのアクセスをありがとうございます。著者は、カールスバーグと Villum (E.A.C.) に財政支援基盤をありがとうございます。著者は、ニールス ・ ボーア教授賞によるデンマーク国立研究財団からの金融サポートを認めます。

1 迅速な溶媒シフト法によるナノ粒子合成
<ol><li>ナノ粒子の準備のため、次のセットアップ: ブロック ヒーター/サンプル濃縮装置、乾燥器、磁気攪拌器、磁気ノミ (15 mm × 4.5 mm、円筒形で、12 mL のバイアル 1 mL ガラス製注射器デジタル調剤システムポリテトラフルオロ エチレン [PTFE] コーティング) ガラスの瓶と回転蒸発器の中。</li>
	<li>2.4 mL シンチレーション バイアル 70% エタノール水の混合物に溶解した 250 μ M falcarindiol 在庫を分配します。</li>
	<li>蒸発する液体成分分率、約 4 時間のサンプル コンセントレーターを使用して乾燥 falcarindiol を取得します。<ol>
<li>ブロック ヒーターのシンチレーション バイアルを挿入します。サンプル コンセントレーターは、サンプルを集中してステンレス鋼針を使用してサンプル上ガスを提供します。部屋の温度で蒸発します。熱を使用しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一度乾燥、上記シンチレーション バイアルに脂質のコーティングの次のコンポーネントを追加: 31.64 mm DSPC 16.3 μ L 原液、17.82 mM DSPE ペグ 2000年クロロホルム原液の 3.4 μ L、25 mM コレステロール クロロホルム株式 24 μ L のクロロホルムソリューション、および 4 mm DiI クロロホルム原液 6 μ L。交差汚染を避けるために各コンポーネントを追加した後、クロロホルムと注射器をきれい。 警告: すぐに脂質を含む溶媒がない蒸発し、濃度を変更により、バイアルを閉じます。発煙のフードで働いてください。 注: 化学サプライヤーまたは希釈のラボで作られたによってクロロホルム溶液の濃度は異なることができます。</li>
	<li>DiI を光から保護するためにアルミ箔でバイアルをラップします。クロロホルムを蒸発させるための乾燥器のサンプルを一晩おきます。</li>
	<li>DSPC、DSPE ペグ 2000年、コレステロール、0.43 mM、0.05 mM、0.5 mM、0.02 mM、DiI の最終濃度をそれぞれ与える 1.2 mL の最終巻に無水エタノールで乾燥試料を溶かします。このソリューションは、有機相を表します。</li>
	<li>12 mL バイアルを取る、9 mL の精製水でそれを埋めるし、水 9 mL のバイアルに磁気のノミを追加します。(図 1)、500 rpm で攪拌、マグネチックスターラーでバイアルを維持します。</li>
	<li>調剤システムに 1 mL ガラス製注射器を接続し、任意の汚染を避けるためにクロロホルムでそれをきれい。これにより、ゆっくりとガラス製注射器にクロロホルムを引っ張ってくると、集塵、少なくとも 10 集荷に手動で調剤します。 注意: これがヒューム フードの下で行う必要があります。</li>
	<li>エタノールを注射器を首相します。プライミング古い溶媒を置き換えるだけでなく、空気の泡を削除します。 注意: これがヒューム フードの下で行う必要があります。</li>
	<li>有機相の 1 mL を吸引シリンジを使用して、します。</li>
	<li>9 mL 透かしの中央にガラスの瓶に注射器を挿入し、(図 1に示すように)、バイアルの中に着実に管理します。</li>
	<li>調剤システム (図 2) の調剤ボタンを押して噴射 (833 μ L/s) の選択した速度で薬液を注入します。これは 10% のエタノールを含む水で 50 μ M 脂質被覆ナノ粒子 falcarindiol の 10 mL を生成します。 注: この射出速度は狭い粒度分布を得る最高級の粒子を達成するために発見されています。ソリューションを調剤するとき注射器センター、着実に、まっすぐであるかどうかを確認する重要です。</li>
	<li>注入後すぐに、攪拌からバイアルを削除し、サンプルを 50 mL の丸底フラスコ (RBF) に転送します。</li>
	<li>RBF を回転蒸発器に接続し、1 mL の室温回転蒸発器を用いて、有機溶媒を蒸発させます。余分な気泡を避けるため。 注: この手順は、〜 5 分かかります。</li>
	<li>別 12 mL バイアルに RBF からナノ粒子懸濁液を転送します。体積は 9 mL であることを確認します。2 つの 12 mL ガラスバイアル (put 各 4.5 mL) でサンプルを分割します。</li>
	<li>バイアルの一つ、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 他のバイアルに x 10 の 0.5 mL に 0.5 mL の超純水水を追加します。粒子サイズ計測用各サンプルの 1 mL を取り出してください。</li>
</ol>2 DLS 法を用いた粒度分析
注: サイズ測定は粒子径分布を決定する DLS アナライザーを使用して実施されました。662.2 の波長で動作する 100 mW のレーザーを備えている nm とアバランシェ フォト ダイオード検出器入射角を 90 ° の角度で配置。ビームはナノ粒子による散乱し、光検出器で検出されました。
<ol><li>DLS 音色をオンにし、それが安定するまで 20 ° c、所望の温度を設定します。</li>
	<li>計測器パラメーターを次のように設定: データ集録時間 = 4 s、買収の数 = 30、自動減衰関数、= と自動減衰時間制限 = 0。</li>
	<li>ナノ粒子懸濁液の 1 ml プラスチック キュベットを入力し、測定を開始します。</li>
	<li>使用される溶媒 (水または PBS) により測定したサイズを報告します。 注: セルを扱うときに培地で細胞の大きさのおおよそのアイデアを持っている PBS で測定が行われます。水に溶解したナノ粒子の細胞治療を行います。</li>
	<li>粒子凝集を確認する、合成後 24 h 測定を繰り返します。</li>
</ol>3. 細胞治療
<ol><li>最小必須培 (MEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、5% CO2と 37 ° C で腐植質室で hMSCs を育ちます。 注意: は、ステップ 3.1、3.2、3.3 のため滅菌の層流フードで動作します。</li>
	<li>以前絶対エタノール殺菌 #1.5 coverslips に約 30% の細胞密度を得るための種子約 50,000 セルは 6 ウェルに配置されます。各ウェルに 3 mL の最終的なボリュームを持つためにメモリを追加します。ステップ 3.1 のように同一の条件下で 24 時間インキュベートします。種細胞治療前に、24 h。 注: セルがセルが十分な合流点になっているかどうかを確認する、ナノ粒子治療前に少なくとも 24 時間をシードが重要です。</li>
	<li>メディアを削除せず追加の最終 falcarindiol 濃度 5 μ M のため、ナノ粒子溶液 3 μ L ステップ 3.1 のように同じ条件で 24 時間加温。 注: ナノ粒子の調製は粒子凝集を避けるために、細胞治療の日に実施されました。</li>
	<li>その後、治療の 24 h 後 2 セルを洗浄して、pbs x 4% ホルムアルデヒド、室温で 10 分間でそれらを修正し、PBS にイメージを作成するまでの数ヶ月まで 4 ° C で保存します。 注意: これがヒューム フードの下で行う必要があります。<ol>
<li>また、固定、4 ′ 後、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核染色が行えます。このため、固定セル後を permeabilize それら 0.1 %30 分トリトン X-100 は洗って、pbs 2 x 300 の 250 μ L で、それらを染色し、nM DAPI 5 分間、光から保護します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 顕微鏡
<ol><li>
蛍光顕微鏡
	<ol>
<li>電子乗算の CCD カメラを搭載した広視野蛍光顕微鏡を使用して、画像を取得します。NA 1.45 石油目的 x 150 と GFP LP チャネルを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
共焦点顕微鏡
	<ol>
<li>NA 1.4 石油目的、アルゴン レーザー x 63 を使用して、共焦点顕微鏡画像を取得 (514 nm)、DiI の 2 光子レーザー (780 nm) DAPI、セルにナノ粒子の吸収量を確認するため。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

単純な薬物送達のため脂質被覆ナノ粒子を製造するための詳しいプロトコル、溶剤の高速で再現性のある、かつスケーラブルな急速な注入方式は続いて27,28ととして本稿で提示されます。falcarindiol に適用されます。水相有機相の注入の速度を制御することにより、適切な濃度で falcarindiol コアをコートする膜脂質を使用して、正常にサブ 100 nm の範囲で粒を取得でした。単独で falcarindiol の沈殿物のための乱流混合の関与のための誘導多分散性の可能性は、コーティングの脂質の存在によって制御されました。これら脂質被覆ナノ粒子の構造類似 ApoB100 ネイティブ 500,000 kDa の排除と PEG 脂質の立体安定性のための追加の存在の例外と低密度リポタンパク質)。この受動的標的ドラッグデリバリー システムにより、幅広い特に疎水性医薬品や診断薬材料18,19免疫応答低減との集積量の...

脂質被覆ナノ粒子は、がん療法1の薬物送達システムとしてその機能に関する関心の高まりを見ています。変更後の脂質代謝リプログラミング2と3を増殖するコレステロールのための高められた必要性癌があります。彼らはノザン LDLs1し4ダウン行くことががん患者の LDL カウントを正常細胞よりもより多くの Ldl は。LDL の取り込みは、積極的な表現型5増殖と浸潤乳がんがん6の結果を促進します。LDL 受容体 (LDLRs) の豊富な転移の潜在的な7の予後指標です。がん細胞による吸収および LDL に触発され、新たな戦略と呼ばれています:癌の食品のような薬を作る8。したがって、これらの新しいナノ粒子薬物配信デザイン8,9,10は、抗がん剤を提供するためのメカニズムとして自然 LDLs11のコアと脂質安定デザインに触発されています。癌細胞。この受動的ターゲティング配信システムでは、特に、カプセル化、疎水性薬、経口剤では通常与えられるが、12彼らの期待された効果を制限するので、血流に薬の少量だけを提供をサポートしています。ステルス ・ リポソーム13、ポリエチレング リコール (PEG) コーティングの免疫応答を抑えるし、噂によって最適な腫瘍に対する血流の循環を拡張、強化された透過と保持 (EPR) の効果14,15しますただし、に、いくつかのインスタンス、循環の不安定性とシステム16、望ましくない分布にいくつかの障害、未解決のままそのようなナノ粒子は細胞によって取られるため、どのように、どの程度、など。彼らの細胞の運命。ここは特定の疎水性抗悪性腫瘍剤 falcarindiol、共焦点を使用して、落射蛍光イメージング技術のナノ粒子の取り込みが稿です。
研究の目的は falcarindiol の脂質被覆ナノ粒子を作製し、hMSCs の細胞内取り込み量を研究です。それにより、潜在的にその管理を安定化、配信に関連付けられている課題を克服して、バイオアベイラビリティを改善します。したがってこの抗がん剤の新しい配信システムを評価します。以前は、falcarindiol がされて投与経口高濃度精製 falcarindiol を介して食品サプリメント17として。しかし、この有望な新薬を提供するためのより構造化されたアプローチの必要性があります。したがって、falcarindiol ナノ粒子、リン脂質とコレステロール粒子のコアを構成する精製された薬による単分子膜をカプセル化する設計されていた。シフト、溶媒の急速な注入法は、最近ニーダムらによって開発本研究では8を使用して、ポリアセチレン falcarindiol をカプセル化します。
メソッドは、分子 (トリオレイン)27と薬 (オルリスタット、ニクロサミド ステアリン酸) テストし同様、診断イメージング エージェント18,19をカプセル化する脂質ナノ粒子の作製で以前使用されています8 ,,2728。右の分子を行った場合比較的単純な技法です。極性溶媒に溶解した非常に不溶解性の疎水性溶質の彼らの重要な核生成 (~ 20 nm の直径) の限界で、ナノ粒子を形成します。溶媒交換は antisolvent の過剰への有機的な解決策の急速な注入によって行われます (通常、1:9 有機液相: 水溶液の体積比)20,21。
ナノ粒子の組成の設計は複数の利点を生みます。DSPC:Chol コンポーネントは、非常にタイトなほぼ不浸透性、生体適合性、生分解性単分子膜を提供します。ペグは、細網内皮系 (肝臓と脾臓) と単核食細胞システムからの保護、防止、吸収を遅く免疫システムによるオプソニン化からの盾として機能する立体安定化インターフェイスを提供します、保存と免疫システムによる劣化の循環血液22で半分の時間を増やすためと。これにより、彼らは病気のサイトで extravasate までを循環する粒子粒子の受動的な蓄積を生じ、EPR 効果を許可する腫瘍、血管系が漏れなど。さらに、脂質コートその臨界核寸法27,28でコアを速度論的トラップによるナノ粒子のサイズのより良い制御することができます。脂質は、さまざまな表面プロパティ (まだこのプロジェクトのために利用できませんでした、ペプチドを含む)、純粋な薬物コアと低分散22,27,28を誘発します。粒度分析に使用する方法は、DL、研究者が同時に多数の粒子の大きさを測定することができる技術です。ただし、このメソッドはナノ粒子の単分散23ない場合大きなサイズを測定をバイアスすることができます。この問題は、脂質コート同様に評価されます。他出版物27,28では、これらの基本的なデザインの詳細とすべての特性の定量化を与えられています。
ナノ粒子でカプセル化された薬は、falcarindiol、セリ科の家族から植物に見られる食物ポリアセチレンです。脂肪族 C17ポリアセチレン型健康促進効果、抗炎症作用、抗菌作用、幅広い癌細胞株に対して細胞毒性などを表示するために発見されていることから二次代謝産物です。その高い反応性メルカプトおよびアミノ基24に対して非常に反応性のアルキル化剤として別の生体と対話する能力に関連しています。Falcarindiol は生物学的メカニズムはまだ不明ですが以前、コロンの17,25の腫瘍性病変の数を減らすために示されています。しかし、それは NF-κ B、COX1、COX-2 などの生体分子と相互作用し、腫瘍の進行と細胞増殖プロセス、細胞周期、小胞体 (ER) の逮捕につながるを阻害するサイトカインはストレス、思想とアポトーシス17,26がん細胞。Falcarindiol は、その抗がん剤の可能性と機構のため例の抗癌性の薬剤は、現在、検討されている、それは有望な抗がん効果を示していますので、本研究で使用されます。ナノ粒子の細胞内取り込み hMSCs でテストし、落射蛍光と共焦点顕微鏡を使ってイメージ化します。このセルの型は、顕微鏡に最適なサイズが大きいため選ばれました。

<table><tbody><tr><td>12 mLスクリューネックバイアル(透明ガラス、15-425スレッド、66 X 18.5 mm)</td><td>Microlab Aarhus A/S</td><td>ML 33154LP</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>EMD Millipore (VWR)</td><td>EM8.18760.1000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Rathburn Chemicals Ltd.</td><td>RH1009</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイスLSM510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップの厚さ#1.5</td><td>ポールマリエンフェルドGmbH &Co</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>セルフビルド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DLS</td><td>ベックマン・コールター</td><td>DelsaMAXpro 3167-DMP</td><td></td></tr><tr><td>DSPC (クロロホルムストック)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850365C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DSPE PEG 2000(クロロホルム原料)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>880120C</td><td></td></tr><tr><td>eVol XR</td><td>SGE分析科学、Trajan Scientific Australia Pty Ltd.</td><td>2910200</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>蛍光 miccroscope</td><td>olymous IX81</td><td></td><td>手動 TIRF および Andor iXon EMCCD</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>パナソニック&nbsp;</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックノミ</td><td>VWR ケミカル</td>ズ <td>15 x 4.5 mm</td><td>円筒形 PTFE コーティング</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>IKA</td><td>RT-10</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablets for cell culture</td><td>VWR Chemicals</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>VWR Chemicals</td><td>97063-708</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポ</td><td>レーターRotavapor、B&uuml;chi Labortechnik AG</td><td>R-210</td><td></td></tr><tr><td>試料濃縮器&nbsp;</td><td>スチュアート、コールパーマーインストゥルメントカンパニー、LLC</td><td>SBHCONC/1</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト間葉系幹細胞によって falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

ナノ粒子は、がん治療のための薬物送達システムの高められた興味の焦点です。脂質被覆ナノ粒子に触発され、構造およびサイズの低密度リポタンパク質 (Ldl) がん細胞、増殖しコレステロールのための高められた必要性があるし、これはがんに抗がん剤を提供するためのメカニズムとして悪用されているのでセルです。また、に応じて薬化学薬をカプセル化する、体内の循環の中に、薬物の分解を避けるために有利であります。したがって、本研究ではこのデザインは劣化に対してその化学構造を安定化し、改善のために falcarindiol の潜在的な新しい配信システムを提供する抗悪性腫瘍剤 falcarindiol の脂質被覆ナノ粒子を製造するため使用しますその。腫瘍によって吸収。Falcarindiol ナノ粒子、リン脂質とコレステロール単分子膜粒子の精製薬コアをカプセル化する設計されていた。脂質単分子膜のコーティングは、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol) 2000、コレステロール (哲)、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) で構成されています] (DSPE PEG 2000) 蛍光と共にラベル DiI (43:50:5:2 のモル比)。反溶媒交換の良い溶媒でナノ粒子を沈殿させる高速かつシンプルな手法である急速な注入法を用いたナノ粒子が製造されています。水性相をナノ粒子成分を含むエタノール溶液の急速静注で構成されています。蛍光ナノ粒子のサイズは、74.1 ± 6.7 nm 動的光散乱 (DLS) を使用して測定されます。ナノ粒子の取り込みは、ヒト間葉系幹細胞 (hMSCs) でテストし、蛍光と共焦点顕微鏡を用いたイメージングします。ナノ粒子の取り込みは hMSCs、そのような安定したドラッグデリバリー システム falcarindiol のための可能性が示唆で観察されます。

ナノ粒子作製、すなわち、純粋な falcarindiol と脂質コーティング falcarindiol ナノ粒子ナノ粒子の 2 種類.脂質やコレステロールの濃度を調べた。表 1のように、コーティングされていないナノ粒子水で形成され、PBS で測定 0.571 の分散インデックス (PDI) 71 ± 20.3 nm の直径があった。これらのパラメーターは、DLS アナライザーで測定しました。実験では, 使用など、蛍光染料、DiI、falcarindiol の脂質被覆ナノ粒子は、同様のサイズ、すなわち 74.1 ± 6.7 nm;しかし、比較的単に発見された、低い PDI 0.182 PDI がナノ粒子の人口のサイズ分布を表しますので小さい粒径分布を示すがあった。一般に、ナノ粒子を医薬用製造時、0.3 以下 PDI が望まれます。
次の作製、粒径 3 h、24 h の細胞培養へのナノ粒子添加に必要な遅延時間測定しました。...

この資料では、脂質被覆 74 nm ナノ粒子の falcarindiol のカプセル化について説明します。脂質液滴に人間の幹細胞を用いたナノ粒子の細胞内取り込みは、蛍光と共焦点イメージングによって監視されます。シフト、溶媒の急速な注入法によるナノ粒子を作製しのサイズは動的光散乱法で測定します。

ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

迅速な注射法による脂質被覆ナノ粒子の製造は、癌治療のための安定した薬物送達システムを提供する。この技術は、疎水性薬物をカプセル化するナノ粒子製造のためのシンプルで高速でスケーラブルで再現可能な技術です。この技術は、いくつかの疾患条件で有効に使用することができる水化材料からの診断および治療用ナノ粒子を製造するために適用可能である。この製造技術は、DLSとともに、脂質、タンパク質、ポリマーなどの疎水性物質の核化および成長を研究するために使用することができる。ナノ粒子を作製する前に、薬物物質の物理的な化学的性質を知ることは重要です。また、必ず正しい濃度のコーティング脂質を使用してください。この方法の視覚的なデモンストレーションは、製造技術のシンプルさを示し、ナノ粒子としての薬物の細胞への正常な送達を示すために重要である。クロロホルムやホルムアルデヒドを使用する場合は注意が必要であり、ヒュームフードの下で作業する必要があります。まず、2.4ミリリットルの250マイクロモルファルカリンジオールストック溶液をシンチレーションバイアルに70%エタノールに溶解します。サンプル濃縮器を使用して、液体分画を約4時間蒸発させて乾燥ファルカリンジオールを得る。サンプル濃縮器を使用して、試料を室温で通し、サンプルを濃縮します。乾燥したら、ここに示す成分をヒュームフードのシンチレーションバイアルに加え、クロスコンタミネーションを避けるために各成分を添加した後、クロロホルムでシリンジを洗浄してください。次に、すぐに溶媒が蒸発しないように脂質を含むバイアルを閉じ、それによって濃度を変更します。光からDiIを保護するためにアルミホイルでバイアルを包み、クロロホルムを蒸発させるためにデシケータに一晩サンプルを残します。翌日、乾燥したサンプルを絶対エタノールに溶解し、最終体積は1.2ミリリットルにする。この溶液は有機相を表す。12ミリリットルのガラスバイアルを取り、精製水の9ミリリットルでそれを埋めます。その後、9ミリリットルの水を含むバイアルに磁気ノミを加えます。バイアルを磁気スターラーに置き、500 rpmでかき混ぜます。次に、1ミリリットルのガラス注射器を分配システムに取り付け、クロロホルムをガラス注射器の中に少なくとも10回ゆっくりと引き出します。クロロホルムを毎回廃棄物コレクタに分配します。クロロホルムで注射器を洗浄することで、汚染を防ぐことができます。今度は注射器にエタノールを盛り付けろ。プライミングは、古い溶媒を置き換えるだけでなく、任意の気泡を除去します。注射器を使用して、有機相の1ミリリットルを吸引し、9ミリリットルのウォーターマークの真ん中までガラスバイアルに注射器を挿入する。バイアルの中央で安定して維持し、分配システムの分配ボタンを押すことによって毎秒833マイクロリットルで溶液を注入する。これは、10%エタノールでファルカリンジオールの50マイクロモル脂質被覆ナノ粒子の10マイクロモルの10マイクロリットルを生成する。この注入速度は、狭い粒度分布を有する最も優れたナノ粒子を達成することが分かった。注射中に、針が安定してまっすぐに中央に挿入されていることを確認することが重要です。注射の直後に、攪拌機からバイアルを取り出し、サンプルを50ミリリットルの丸い底フラスコに移します。フラスコをロータリーエバポレーターに攻撃し、室温で有機溶媒を1ミリリットル蒸発させる。過剰なバブル形成を避けるために注意してください。ナノ粒子懸濁液をフラスコから別の12ミリリットルガラスバイアルに移します。ボリュームが9ミリリットルであることを確認し、2つの12ミリリットルガラスバイアルにサンプルを分割します。その後、バイアルの1つに0.5ミリリットルの超純水を加え、もう10倍のリン酸緩衝生理食塩水を他のバイアルに0.5ミリリットル加えます。デジタル光散乱器をオンにし、安定するまで温度を摂氏20度に設定します。次に、次に示すように計測器のパラメータを設定します。プラスチックキュベットにナノ粒子懸濁液を1ミリリットル充填し、測定を開始します。使用した溶媒に応じて測定サイズを報告する。種子は滅菌1.5カバースリップに約50,000個の細胞を6ウェルプレートに入れ、約30%の細胞密度を得るために、各ウェルに3ミリリットルの最終体積を有するために培地を添加する。標準的な培養条件下で24時間培養します。翌日、ナノ粒子溶液の3マイクロリットルを加えて、最終的なファルカリンジオール濃度の5マイクロモルを加える。その後、細胞を24時間培養器に戻す。24時間処理した後、PBSで細胞を2回洗浄し、室温で10分間4%ホルムアルデヒドに固定します。固定後、0.1%トリトンX-100で細胞を30分間透過させる。その後、PBSで2回洗浄し、光から保護された300ナノモルDAPIの250マイクロリットルで5分間染色します。PBS を使用して、スライドにカバー スリップを置きます。150x主観に回し、電子乗算CCDカメラを搭載した広視野蛍光顕微鏡のステージにスライドを移します。GFP-LP チャネルを使用した画像セル。さらに、数値開口1.4の63x油目的を使用して共焦点顕微鏡画像を撮影することにより、ナノ粒子の細胞への取り込み検証を行います。画像DiIは、514ナノメートルのアルゴンレーザーと780ナノメートルの2光子レーザーを用いたDAPIを使用した。水中で形成され、PBSで測定されたファルカリンジオールの未コーティングナノ粒子は、PD指数0.571で高い多分散性を示した。この値は、粒子サイズの広い分布と不均一な分布を示します。これに対し、本ビデオで作製したファルカリンジオールの脂質被覆ナノ粒子は、0.182の多分散指数を有する74.1ナノメートルであり、粒度の比較的単分散および均一な分布を示した。細胞内のナノ粒子の最初の観察として、24時間の治療後に蛍光顕微鏡画像が取得された。ナノ粒子は白色の明るい点として視覚化され、核を取り巻く細胞の中にナノ粒子が位置していると仮定することができます。ファルカリンジオールナノ粒子が細胞に入ったことを確認するために、細胞上でも共焦点顕微鏡を行った。ここには多数のナノ粒子が示され、細胞質中に全ての細胞に散在する。これらの結果は、ナノ粒子がファルカリンジオールの安定した薬物送達システムとして機能することを示している。この手順を試みている間、適切な混合を確実にするために、正しい注入速度で溶液を注入し、シードを安定させ、中央に保つことが重要です。この手順は、治療用ナノ粒子を処方する任意の疎水性薬物または癌などの様々な疾患条件で使用することができる診断ナノ粒子を製剤化するためのイメージング剤に使用することができる。この技術により、ナノ粒子が細胞に取り込まれるメカニズムや、生細胞イメージングや薬物の抗癌効果の研究に関する研究が可能になりました。

uptake-new-lipid-coated-nanoparticles-containing-falcarindiol-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

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