Name: 二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学ぶ 共焦点レーザー顕微鏡を用いて、否定的な感覚のRNAウイルスにおける二本鎖RNAとパターン認識受容体の相互作用を可視化する方法です。単一細胞レベルでウイルス免疫応答を解析し、新たな治療戦略開発に貢献します。

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顕微鏡支援のための UTMB イメージングの中核施設とマキシム ・ イワニコフに感謝したいと思います。
この作品は、公衆衛生サービスによって支えられた RO1AI093445 と RO1AI129198 受賞に SP、ch、UTMB コミットメント基金 P84373 と EM を T32 AI007526 を付与します。

1 作成 A549 細胞と JUNV 感染症
<ol><li>ポリ-D-リジン (PDL) に種子 2 x 10 の5ひと肺上皮 A549 細胞は、感染前に 24 時間で 12 ウェルのプレートにガラス coverslips をコーティングしました。</li>
	<li>1.0 プラーク ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 培地 2% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリンとストレプトマイシン (P/S で希釈したセルごとユニットを形成 JUNV13感染症 (MOI) の乗算での 150 mL の因数を準備します。).</li>
	<li>細胞培養からメディアを削除します。各上も含むウイルスの接種材料を追加し、37 ° C で 1.5 時間インキュベートプレート 15 分毎を振る。</li>
	<li>ウイルスの接種材料を削除 5 %fbs と 1% P DMEM の 1 mL を追加/s. 希望の時間ポイントの 37 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>2. 固定・染色
<ol><li>メディアを吸い出しなさい。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) カルシウムとマグネシウム各ウェルに補足の 1 mL を追加することによって、細胞をすすいでください。</li>
	<li>PBS を削除します。-20 ° C であらかじめ冷やして 1 mL のメタノール (メタノール) を追加し、-20 ° c またはドライアイス 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>メタノールを削除します。</li>
	<li>各ウェルに 1 mL の PBS を追加し、4 ° C で 5 分間穏やかな揺動洗浄サンプルは合計 4 回の洗浄を繰り返します。</li>
	<li>穏やかなロッキングの 4 ° C で 5 分間 0.2% t octylphenoxypolyethoxyethanol 1 ml coverslips に固定セルを洗浄します。</li>
	<li>1 mL の PBS を各ウェルに加えます。穏やかな揺動と 5 分のための 4 ° C でサンプルを洗います。合計 4 回の洗浄のステップを繰り返します。</li>
	<li>DsRNA と MDA5 を検出するためには、3% ウシ血清アルブミン (BSA) で希釈した一次抗体の 200 mL のサンプルをインキュベートします。1:2 希釈反 dsRNA 9 5 抗体を希釈し、抗 MDA 5 抗体を希釈します。穏やかなロッキング 4 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	<li>一次抗体を外し、それぞれ洗浄穏やかな揺動した繰り返しこの洗浄 4 回以上分の 1 mL の PBS とも。</li>
	<li>3 %bsa で希釈した二次抗体 (1:2, 000 希釈) の 200 mL を追加し、RT で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>二次抗体を外し、それぞれ洗浄穏やかな揺動した繰り返しこの洗浄 4 回以上分の 1 mL の PBS とも。</li>
	<li>JUNV 核タンパク質 (NP) を検出してリグ-、追加 3 %bsa の希釈に活用された抗体の 200 mL。縮尺で共役反 JUNV NP (AG-12) を希釈し、穏やかな揺動で常温 2 時間サンプルをインキュベートします。共役アンチ-RIG-I 抗体 1: 500 でを希釈し、4 ° C 穏やかな揺動と一晩で孵化させなさい。</li>
	<li>活用された抗体を外し、それぞれ洗浄穏やかな揺動した繰り返しこの洗浄 4 回以上分の 1 mL の PBS とも。</li>
	<li>室温穏やかな揺動と 3 分のために DAPI (1:1, 000) coverslips を counterstain します。</li>
	<li>洗って、coverslips 3 回 0.5 %t-octylphenoxypolyethoxyethanol 室温穏やかなロッキングの 1 mL で 5 分間ずつ</li>
	<li>室温穏やかな揺動をするたびに 5 分の 1 mL の PBS で 2 回洗う</li>
	<li>DdH2O RT、穏やかに揺れるで 1 分間の 1 つの mL で一度洗います。</li>
	<li>メディアをマウントを使用してスライド ガラスに coverslips をマウントします。夜間治療をしましょう。</li>
	<li>マニキュアとスライドを密封し、空気乾燥 1 時間。</li>
	<li>60 x と共焦点顕微鏡画像/1.42 開口油侵のレンズの各サンプルに対して同じレーザー排出量を使用して。</li>
	<li>必要に応じて、データの分析している場合の明るさとコントラストのすべてのサンプルの同じ線形調整を使用して調整を行います。</li>
</ol>

<ol><li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+RNA+viruses%3A+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li>
<li>Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 6(2006).</li>
<li>Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+direct+interaction+of+MDA5+and+the+dsRNA+replicative+intermediate+form+of+positive+strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses.</a> Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).</li>
<li>Onomoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+an+antiviral+stress+granule+containing+RIG-I+and+PKR+in+viral+detection+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity.</a> PLoS One. 7, e43031(2012).</li>
<li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+is+detected+by+immunofluorescence+analysis+in+RNA+and+DNA+virus+infections%2C+including+those+by+negative-sense+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li>
<li>Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+double-stranded+RNA+colocalizing+with+pattern+recognition+receptors+in+arenavirus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells.</a> Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251(2018).</li>
<li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).</li>
<li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+interferon+in+Argentine+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever.</a> The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).</li>
<li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+endogenous+interferon+and+the+clinical+evolution+of+patients+with+Argentine+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever.</a> Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+pathogenic+new+world+and+old+world+human+arenaviruses+induce+distinct+interferon+response+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells.</a> Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junin+virus+infection+activates+the+type+I+interferon+pathway+in+a+RIG-I-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659(2012).</li>
<li>Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+pathogenic+new+world+arenavirus+infection+activates+the+pattern+recognition+receptor+protein+kinase+R+without+attenuating+virus+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells.</a> Journal of Virology. 91, 20(2017).</li>
<li>Emonet, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+from+cloned+cDNAs+and+in+vivo+characterization+of+recombinant+pathogenic+Romero+and+live-attenuated+Candid%231+strains+of+Junin+virus%2C+the+causative+agent+of+Argentine+hemorrhagic+fever+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease.</a> Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).</li>
<li>Child, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+the+protein+kinase+R+pathway+in+human+cells+by+Rhesus+Cytomegalovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus.</a> Journal of Virology. 92, 6(2018).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

肯定的な感覚の RNA のウイルスは、dsDNA ウイルス dsRNA は J2 アンチ dsRNA の広く使用される抗体を容易に検出されます。ただし、否定的な感覚の RNA のウイルスは、低または2同じ抗体を使用して検出のレベルの下の dsRNA を生成すると考えられています。したがって、ウイルスの RNA と PRR の相互作用の多くの側面は否定的な感覚の RNA のウイルスの明確な主ではありません。J2 抗体を用いたアレナ ウイルス感染における dsRNA のステインを試みたなかった蛍光信号微分可能モックの感染症に比べています。DsRNA の特定と J2 抗体5より敏感に Mab パン エンテロ ウイルス検出は、もともと 9 5 が見つかりました。この抗体は陰性意味プロトタイプ アレナ ウイルス科リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス5,6,14を含む RNA ...

生得の免疫反応の誘導の最初のステップは二本鎖 (ds) RNA によって、パターン認識の受容器 (PRRs) レチノイン酸などの宿主認識 (リグ-私) 受容体 (RLRs) リグが好き-私と黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA-5)1。肯定的な感覚の RNA のウイルスの dsRNA 容易に検出できる J2 または K1 アンチ dsRNA のモノクローナル抗体 (Mab)2を使用しています。DsRNA と PRRs のピコルナ ウイルスなどのプラス鎖 RNA ウイルスの相互作用は、共焦点顕微鏡3を使用して特徴づけられています。ただし、否定的な感覚 RNA ウイルス、PRR と dsRNA の相互作用の可視化とによって妨げられている dsRNA に敏感な抗体の欠如。RNA 蛍光そのままの交配 (魚) は、ウイルスの RNA と PRRs4の可視化に適用されています。それにもかかわらず、魚方法論はターゲット RNA シーケンスの知識が必要です、PRR は共同染色と互換性がない可能性があります。最近、9 5 パン エンテロ ウイルス感染症の診断のため開発された、Mab 見つかり J2 モノクローナル抗体よりも高感度が容易に否定的な感覚の RNA ウイルス感染症5,6に dsRNA を検出します。したがって、Mab 9 5 が斬新で、ウイルスの複製と PRR および否定的な感覚の RNA ウイルスのウイルスの RNA 間の相互作用を検討するときに役立ちます。
アレナは、単一座礁させた、否定的な感覚の RNA ウイルス、ラッサ ウイルス (LASV)、フニン ウイルス (JUNV)、Machupo ウイルス (MACV)、人間7に重度の出血熱の病気を引き起こすなど、いくつかの人間の病原体を含む家族です。JUNV 新世界アレナ ウイルスによって引き起こされるアルゼンチン出血熱の重症や死亡するケースから臨床データを表わす血清 IFN α8,9の異常に高いレベル。病原性の NW アレナ (JUNV、MACV) がない、病原性旧世界アレナ ウイルス科、LASV、型を誘発することを示した私10ひと単球由来樹状細胞におけるインターフェロン (IFN) 応答します。さらに、リグ-私は、センサーの一つを仲介する I 型 IFN の応答 JUNV 感染細胞11。DsRNA 認識のため伝統的に知られている蛋白質キナーゼ (PKR) R 受容体が病原性 NW アレナ ウイルス感染12でアクティブであることが分かった。アレナ ウイルス感染ウイルスに特有な IFN 応答のメカニズムをさらに理解するには、dsRNA ウイルスと細胞質の PRRs の相互作用を視覚化するためのプロトコルの開発を目的とします。
病原性 JUNV、MACV LASV と感染実験は、バイオ セーフティにおける行いますレベル 4 (BSL-4) 施設。したがって、アレナ ウイルス感染で形成された dsRNA のおそらく低レベル、に加えてバイオセイフティ要件を満たす別技術課題ですこれらの高病原性ウイルスのイメージングを行う際。9 5 を用いた抗体と JUNV の Candid1 # ワクチン株、共焦点顕微鏡ベースのプロトコルは dsRNA ウイルス蛋白質、PRR のアレナ ウイルスによる感染細胞で同時に視覚化に正常に使用されているこのレポートに記載されています。BSL2 実験室。プロトコルは、dsRNA と PRR BSL4 施設における病原性アレナ ウイルス感染時に細胞内に分布の可視化に適しています。

<table><tbody><tr><td>APEX Alexa Fluor 647 抗体ラベリングキット</td><td>Invitrogen</td><td>A10475</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td><td>1:2,000 希釈;ロット#:1454437</td></tr><tr><td>Dulbeccoの修正されたイーグルの媒体</td><td>コーニング</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>アトランタバイオ</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-550-15</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗マウスアレクサフルーア488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td>1:2000希釈;ロット#:1874804</td></tr><tr><td>ヒト肺上皮A549細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィ</td><td>ッシャーA412-20</td><td>°Cで保存;C</td></tr><tr><td>マウス MAb 抗 JUNV NP</td><td>BEI</td><td>NA05-AG12</td><td>Alexa-647 に 1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>マウス MAb 汎エンテロウイルス 9D5 試薬</td><td>ミリポア シグマ</td><td>3361</td><td>即使用可能; 1:2 に希釈;ロット #:</td></tr><tr><td>3067445 PBS Ca および Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>PDL コーティング カバースリップ</td><td>Neuvitro</td><td>H-12-1.5-pdl</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止</td>剤 <td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit MAb MDA-5</td><td>Abcam</td><td>ab126630</td><td>1:250 希釈;ロット#:GR97758-7</td></tr><tr><td>recombiant Candid#1株のJUNV</td><td>Lab生成</td><td>ラボ生成 参考文献</td><td>13で前述したように、</td>ラボ生成。</tr><tr><td>Alexa-594</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-376845</td> 1:1000希釈に結合したRIG-IマウスMAb<td>;ロット#:AO218</td></tr><tr><td>トライトンX-100</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

二本鎖 rna と否定的な感覚の rna のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

二本鎖 (ds) RNA が RNA ウイルス感染複製中間体として生成されます。レチノイン酸などには、[ホストのパターン認識の受容器 (PRRs) による dsRNA の認識 (リグ-私) 受容体 (RLRs) リグが好き-私と黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA-5) は、生得の免疫反応の誘導に 。形成と肯定的な感覚の RNA ウイルス感染における dsRNA の細胞内分布をよく顕微鏡によって特徴づけられています。多く否定的な感覚の RNA のウイルスなどいくつかのアレナは、感染時に生得の免疫反応をトリガーします。しかし、否定的な感覚の RNA のウイルスは dsRNA ウイルス dsRNA の PRR 認識のイメージング研究を妨げるの低レベルを生成すると考えられました。さらに、高い封じ込めバイオ セーフティ レベル設備 (BSL-4) で高病原性アレナでの感染実験を行う必要があります。高病原性 RNA ウイルスのウイルスの RNA と PRRs の相互作用は主研究者は BSL 4 施設に直面する必要がある追加の技術的な課題のため知られています。最近では、もともとパン エンテロ ウイルス検出用モノクローナル抗体 (Mab) (クローン 9 5) は特に伝統的な J2 または K1 アンチ dsRNA の抗体よりも高い感度で dsRNA を検出する発見されています。9 5 を用いて、抗体、dsRNA ウイルス蛋白質、アレナ ウイルスに感染した細胞で同時に PRR を視覚化するために正常に使用されている共焦点の顕微鏡検査プロトコルについて述べる。プロトコルの dsRNA の PRR BSL4 施設における病原性アレナ ウイルス感染細胞分布のイメージングにも適しています

このプロトコルは、配布し、RLRs の間の共存の研究に応用された (リグ-私は、MDA 5) と JUNV 感染細胞における dsRNA。図 1と図 2のように、ウイルス感染の進行につれて dsRNA の蓄積が増加します。MDA-5 (図 1) とリグを集中-(図 2) 信号は、NP、dsRNA の点状の構造の結果発見されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59095/59095fig1.jpg"> 図 1: dsRNA と JUNV NP 形成と MDA 5 の分布の経時します。JUN...

二本鎖 RNA ウイルス RNA の複製中に生産は、生来の免疫応答を誘導するパターン認識受容体によって認識できます。否定的な感覚の RNA のウイルスの低レベルの dsRNA と PRRs の相互作用は不明します。アレナ ウイルス科 dsRNA と個々 の細胞における PRR を視覚化する共焦点顕微鏡法を行った。

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

従来の二本鎖RNA検出アッセイは、通常、陰性感覚RNAウイルス感染で形成された二本鎖RNAを検出するのに十分な感度ではない。したがって、二本鎖RNAと宿主パターン認識受容体との相互作用は、これらのウイルスにとってほとんど不可解なままである。このプロトコルを利用して、ウイルス核タンパク質、二本鎖RNA、陰性感覚RNAウイルスの単一細胞レベルでPRRをホストする間の相互作用を可視化し、特徴付けることができる。これは、個々の細胞における二本鎖RNAと2つのウイルスまたは宿主タンパク質標的の同時染色を可能にする多重アッセイである。RNA-FISHアッセイとは異なり、この技術はRNA配列に依存せず、通常はタンパク質標的の抗体検出と互換性があります。感染の24時間前に、200,000個のヒト肺上皮A549細胞をポリ-D-リジンコーティングガラスカバースリップに12ウェルプレートに播種し、37で成長させることで開始します。

confocal-imaging-double-stranded-rna-pattern-recognition-receptors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

このビデオでは、SARS-CoV-2サブゲノムRNAの空間分布を可視化するためのHybridization Chain Reaction(HCR)-Fluorescence In Situ...

Immuno-RNA Fluorescence In Situ ハイブリダイゼーションを使用した SARS-CoV-2 の可視化

我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。...

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

表面へのビリオンの付着は、超解像蛍光イメージングまたは原子間力顕微鏡(AFM)による単一のビリオンイメージングの要件です。ここでは、AFMおよび超解像蛍光イメージングでの使用に適したガラス表面へのビリオンの制御接着のためのサンプル調製方法を示す。...

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

ウイルス感染に対する自然の防御はパターン認識受容体（PRR）によってトリガされます。ウイルスシグネチャのRNA、変更高次構造、オリゴマー化する2細胞質のPRR、RIG-IおよびPKRに結合し、抗ウイルスシグナル伝達を活性化する。方法は、都合のコンホメーションスイッチングと、これらの細胞質のPRRのオリゴマー化をモニタリングすることを可能にする記述されている。...

抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化

ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D...

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

ここで紹介するのは、蛍光イメージングアプローチのためのプロトコルであり、DNA、RNA、およびpロテイン(MICDDRP)の究極の蛍光immuno蛍光c...

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

ここでは、その蛍光におけるRNA蛍光をその蛍光(RNA-FISH)と免疫蛍光と組み合わせて、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化する簡単な方法を説明する。このプロトコルは、単一細胞レベルでのSARS-CoV-2...

SITUハイブリダイゼーションにおける免疫RNA-蛍光を用いたSARS-CoV-2の可視化

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

学ぶ 共焦点レーザー顕微鏡を用いて、否定的な感覚のRNAウイルスにおける二本鎖RNAとパターン認識受容体の相互作用を可視化する方法です。単一細胞レベルでウイルス免疫応答を解析し、新たな治療戦略開発に貢献します。

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

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