Name: 核磁気共鳴化学発癌剤誘発マウス膀胱腫瘍の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: 学ぶMRIプロトコルを用いたマウス膀胱腫瘍の評価法。BBN発がん剤で誘発したC57BL/6マウスの腫瘍サイズと進行段階を高スループットで正確にイメージングし、がん治療研究に貢献します。

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J. j. m. は、退役軍人の健康管理のメリットによって資金を供給 BX0033692-01 を付与します。J. j. m. もロバート H. Lurie 包括的がんセンターの北西大学癌研究のためのジョン p. ハンソン財団によってサポートされています。MRI の買収を提供し、処理のトランスレーショナル イメージングを中心を感謝いたします。資金源は、原稿や文書の提出する決定の書面では役割をなかった。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ノースウェスタン大学によって承認されています。
1. BBN と共に腫瘍の誘導
<ol><li>男性 C57/BL6 マウス、それぞれ少なくとも 6 週齢を取得します。 注: 雄マウスは、迅速かつ一貫して雌マウス14,15より膀胱癌を開発します。</li>
	<li>飲料水には、0.05% の線量で N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) アミン (BBN) を追加します。不透明な容器に保管し、マウス16に飲料水として自由を提供すること。 注: 明確なコンテナーに BBN ソリューションを格納すると、発がん性物質17が低下します。</li>
	<li>週 2 回 0.05 %bbn 水を変更します。</li>
	<li>固まり、しっかり膀胱、血尿など膀胱腫瘍に関連付けられている苦痛の兆候を調べることによって、動物を監視します。週 2 回またはローカル IACUC ガイドラインに従ってマウスを検査します。</li>
	<li>露出1816 ~ 24 週の間に腫瘍を期待してください。</li>
</ol>2. MRI セットアップ
<ol><li>滅菌生理食塩水の皮下注射を行う (0.1 – 0.2 mL 25-27 G 針と 1 mL 注射器を使用して) MRI 膀胱充填を容易にする前に 10 分。</li>
	<li>100% O2とイソフルラン (2%-4% に応じて) のガス混合物各マウスを麻酔します。続行する前に引っ込め反射 (つま先ピンチ) をテストすることによって麻酔の適切な面を確認します。動物に生殖不能の眼軟膏を適用します。</li>
	<li>吸入イソフルラン (0.5%-3%) の配信のためノーズが整って画像ホルダーにマウスを転送します。</li>
	<li>体温と呼吸生理学的記録のコンピューターに接続されている直腸温度プローブを使用して監視します。 注: 正常な体温 (36-37 ° C) は動物氏ホルダーに組み込まれているお湯の循環回路を使用して維持されます。温度は直腸のセンサーを測定し、専用の生理学的な監視ソフトウェアを使用して生理学的モニター コンピューターに記録。同じシステムを使用して、胸郭と 3 誘導心電図電極を介して下に置かれる空気の枕を測定した呼吸、心電図信号を記録します。呼吸信号も MRI で集録をトリガーと呼吸運動に関連付けられている成果物を減らすのために使用されます。</li>
</ol>3. MRI 画像の取得
<ol><li>励振用直交体コイルを利用します。</li>
	<li>興味の地域から信号の最適化された検出を有効にするスキャンされているマウスの下腹部に 4 チャンネルの受信コイルを配置します。</li>
	<li>三軸セット全体のマウス体内の画像を取得する統合イメージング ソフトウェアによって自動的に調整を開始します。この参照から画像のセットを (この場合は膀胱の領域) に関心の領域を識別します。</li>
	<li>放射線のフレームの参照を使用して軸、冠状および矢状面に沿った直交スライス画像の 3 つのセットを取得します。</li>
	<li>次の MR パラメーターで true FISP シーケンス (統合イメージング ソフトウェアの機能の 1 つとして含まれている) をイメージングを活用: TR = 900 ミリ秒、TE = 2 ミリ秒、FA = 70、14 平均。 注: このパラメーターのセットにより、良質診断、T1 ・ T2 の重みを含む急速なイメージングのため < マウスあたり 10 分。</li>
	<li>空間分解能・ スライス厚は、統合された画像処理プラットフォームのグラフィカル インターフェイスを通じてユーザーによって選択された幾何学的なパラメーターによって決定されます。平面内の分解能には 0.148 mm 厚さ 0.5 mm の全体膀胱全体のスライスのシリーズでこの結果します。</li>
</ol>4. MR 画像の解析
<ol><li>0.5 mm 厚のスライス、面内分解能全体の膀胱をカバー 0.148 mm のセットを識別します。</li>
	<li>医用画像解析ソフトウェアにエクスポートするには、分析フォーマットの対応する画像のフォルダーを選択します。</li>
	<li>生成されたイメージをスクロールし、膀胱は、膀胱壁と内腔の可視化では、中間点でスライスを識別する定量分析のため膀胱の中心に「代表的な軸表示」を選択します。 注: 中央のスライスは最大径で選ばれた 1 つをする必要があります。</li>
	<li>(BLAを) 膀胱の外側のエッジと膀胱の内部ルーメン (BLAで) の周囲の境界を手動で追跡することで利益 (率 ROI) の領域を慎重に描く (図 2の回路図と代表的な図参照)選択した代表的な軸のビュー。</li>
	<li>膀胱壁のサーフェス領域を計算する外側のエッジからの内部ルーメンを減算します。 壁BLA BLAをBLAで= 注: ない腫瘍コントロール膀胱の表面積は、膀胱腫瘍のそれよりも小さいをされる予定です。</li>
</ol>5. 安楽死と膀胱の解剖
<ol><li>BBN 露出の 20 週間後ローカル IACUC ガイドラインに従って標準操作手順を使用してマウスを安楽死させます。</li>
	<li>70% エタノールで、切開部をきれいし、つかみ、鉗子と腹壁皮膚を持ち上げます。</li>
	<li>剣状突起に恥骨から正中切開を行います。</li>
	<li>鋭く鉗子で把持し、ハサミで切開で腹腔内を切開します。</li>
	<li>正中線の下腹部に位置する膀胱を識別します。</li>
	<li>特定し、腹壁、臍と膀胱ドームを接続する正中臍靱帯を切ってください。</li>
	<li>中指を提供、周辺構造、精嚢、直腸、脂肪などから膀胱を解剖し鉗子で膀胱のドームを把握します。</li>
	<li>尿管が膀胱に入るを識別し、膀胱の近くにハサミでカットします。</li>
	<li>膀胱を頭の方に持ち上げ、尿道をハサミでカットし、膀胱を削除します。</li>
	<li>すぐに PBS で洗浄後、膀胱の重量を量る。</li>
</ol>6. 膀胱組織の病理
<ol><li>36-48 時間室温 (RT) で 10% 中性緩衝ホルマリンの膀胱組織を修正します。</li>
	<li>組織をパラフィン ブロックに埋め込む、その後の検査のためのスライドをカット、ヘマトキシリンとエオシン顕微鏡検査のためのスライドを染色19,20を前述のよう。</li>
	<li>低マウス膀胱の顕微鏡検査を実行 (2.5 倍と 10 倍) と (20 x、40 x) 高倍率、肉眼病変、過形成、上皮内癌、乳頭腫、乳頭状腫瘍、浸潤性腫瘍19の検証,21。</li>
</ol>

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</ol>

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腫瘍モデルの正確な画像は、適切な事前の安楽死のステージングと実験的な治療の開始前に動物のランダム化に必要です。ここに示す手順を使用して、(1) BBN 発癌物質を用いた膀胱腫瘍を生成し、(2) 膀胱腫瘍の負担大幅に氏 MR 派生領域測定 (BLA壁) 相関を使用して階層化する方法を紹介します。膀胱重量前のヴィヴォ、病理学的腫瘍の段階と関連付けられる。
高空間分解能 (true FISP) と質の高い診断に短いアクイジション時間で急速なイメージングのアプローチを採用し、ランダム化治療前の腫瘍の開発の中間段階でマウスの高スループット試金を実施できます。当社の報告書は事前報告と一致して氏腫瘍行ベースのイメージング9,12をインプラントし、大きな教科番号薬物を最適化するためのツールとしてその可能性を確認します。
この MRI プロトコルの完全な膀胱腫瘍、膀胱内腔間の相違点を記述し...

膀胱癌は 5 番目に多い癌で全体的に、約 80,000 の新規症例と 2017年1にアメリカ合衆国で 16,000 の死の責任があります。膀胱がん2全身治療の著しい進歩なし約 30 年後最近アンチ PD 1 とアンチ PD L1 チェックポイント阻害剤試験は、高度な患者の刺激的で、時折耐久性反応を示しています。尿路上皮癌3,4,5。患者のおよそ 20% を示すこれらの治療に奏効し、さらなる研究は、膀胱癌患者における免疫療法の効果的な利用を拡大する必要が。
マウス膀胱癌モデルは、新しい治療法6、7の前臨床評価に重要なツールです。さまざまな治療法にマウスをランダム化する際、腫瘍サイズの制御するために腫瘍の負担が評価され、治療グループ間制御する必要があります。以前の研究では、同所性同種細胞ライン ベースの膀胱癌モデル8,9,10,11を評価するのに超音波や生物発光を使用しています。しかし、両方の方法は、いくつかの欠点を提示します。超音波測定は、オペレーターのスキルの影響し、三次元機能と高空間分解能不足します。発光方法は腫瘍細胞の半定量的評価を提供できるだけと膀胱解剖学および形態の可視化を可能にしません。さらに、発光はヘアレス マウスや、白いコートを持つマウスの発光遺伝子を発現する細胞ライン ベース モデルでのみ使用できます。
磁気共鳴画像 (MRI) は、他の一方で、幅広い組織コントラストは正確な可視化を可能にすると腫瘍負荷の定量的評価、高解像度の解剖学的画像の取得にユニークな柔軟性を提供します。生物発光の性質を表現することがなく。MR 画像は適切な解析パイプラインをより簡単に再現可能であり、膀胱の 3次元可視化を保証します。MRI の最大の制限は、検討と高コスト高スループット試金を制限するために必要な時間の長さです。しかし、いくつかの研究は、氏シーケンスが効果的に検出およびセル行ベースの膀胱腫瘍を監視するために使用できる高品質な診断画像を提供できることを示しています。したがって、彼らは、ハイスループット分析9,12の使用可能性があります。
ここでは、確実にかつ効率的にマウスで発がん物質による膀胱腫瘍の特性評価に非侵襲的氏ベース手法について述べる。これを達成するために検出と膀胱の測定のため、高品質と高空間分解能 (~ 100 ミクロン) 提供して短いスキャン セッションを保証する定常摂動氏技術 (true FISP) による高速イメージングを使用します。腫瘍13。さらに、この非侵襲性の MRI 測定の精度を確認するため腫瘍の病理組織学的確認の段階と同様、MRI 派生パラメーターおよび前のヴィヴォ膀胱重量との相関関係をについて説明します。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>664</td><td>マウス</td></tr><tr><td>N-ブチル-N-(4-ヒドロキシブチル)ニトロソアミン発がん物質 (BBN)</td><td>TCI アメリカ</td><td>B0938</td><td>発がん性物質</td></tr><tr><td>0.9% 生理食塩水</td><td>ホスピーラ社</td><td>NDC 0409-488-02</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ピラマル ヘルスケア</td><td>60307-120-25</td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>7Tesla ClinScan MRI</td><td>ブルカー</td><td>NA</td><td>専用小動物イメージングMRI</td></tr><tr><td>シンゴ</td><td>シーメン</td><td>スNA</td><td>MR統合イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>モデル1030モニタリング&ゲーティングシステム</td><td>Small Animal Instruments, Inc. (SAII)</td><td>NA</td><td>小動物生理モニタリング</td></tr><tr><td>ホルマリン、中性緩衝液、10%</td><td>シグ</td><td>マ HT501128</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>エオシン Y</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>NC1093844</td><td>組織学的染色剤</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-245651</td><td>組織学的染色剤</td></tr><tr><td>ジム7</td><td>シナプスシステム</td><td>NA</td><td>医用画像解析ソフト</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v7.04</td><td>Graphpad</td><td>NA</td><td>グラフ作成ソフト</td></tr><tr><td>R v3.4.2</td><td>統計計算のためのRプロジェクト</td><td>NA</td><td>統計ソフト</td></tr><tr><td>Rパッケージ pROC v1.10.0.</td><td>統計計算Rプロジェクト</td><td>NA</td><td>ROC解析</td></tr></tbody></table>

核磁気共鳴化学発癌剤誘発マウス膀胱腫瘍の評価

Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors

マウス膀胱腫瘍モデルは、新たな治療選択肢の評価のために重要です。N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ニトロソアミン (BBN) 発癌物質と膀胱腫瘍は細胞ライン ベース モデル上有利な密接に人間の腫瘍の遺伝子プロファイルの複製、細胞モデル、異種移植片とは異なり彼らを提供するため、免疫療法の研究のための良い機会。ただし、膀胱腫瘍の世代は異質です。したがって、ランダム化実験的な治療の前に腫瘍負荷の正確な評価が必要です。ここで説明は BBN マウス モデルと膀胱癌腫瘍負担評価生体内で高速かつ信頼性の高い磁気共鳴 (MR) シーケンス (true FISP) を使用するためのプロトコルです。このメソッドは、シンプルで信頼性の高いので、超音波とは異なり氏はオペレーターに依存して、単純な買収後画像処理とレビュー。腫瘍、膀胱壁に沿って、関心の領域の解析膀胱の軸のイメージを使用すると、膀胱壁と腫瘍領域の計算を可能にします。この測定は前のヴィヴォ膀胱重量と相関 (rs= 0.37、p = 0.009) と腫瘍の段階 (p = 0.0003)。結論としては、BBN は異種腫瘍免疫療法の評価に最適なを生成し、MRI は迅速かつ確実に実験的治療群にランダム化前に腫瘍量を評価します。

記述されているプロトコル (図 1) を使用して、膀胱腫瘍は C57/B6 雄マウスに誘導されました。16 週間で MRI を行いマウスは、20 週間で安楽死されました。前のヴィヴォ膀胱重量 (BW) それぞれについてマウスを記録しました。ヘマトキシリンとエオシン、スライド染色や腫瘍の段階のすべての組織スライドをレビューしました。
膀胱壁 (BLA壁) の厚さを計算する外部ルーメン (BLAを) の膀胱壁から減算された膀胱壁の内部ルーメン (BLAで) 氏を使用して腫瘍負荷を分析する (図 2)。代表的な true FISP MR 画像、膀胱壁の 3次元再構成、およびコントロール マウス (すなわち、ないの腫瘍) の病理画像は、<strong clas...

マウス膀胱腫瘍は N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ニトロソアミン発がん性物質 (BBN) で誘導されます。膀胱腫瘍の世代は異質です。したがって、ランダム化実験的な治療の前に腫瘍負荷の正確な評価が必要です。腫瘍の大きさおよび段階を評価する高速で信頼性の高い MRI プロトコルをご紹介します。

Murine bladder tumor models are critical for the evaluation of new therapeutic options. Bladder tumors induced with the N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ...

この方法論は、BBN発がん性物質を用いて膀胱腫瘍を再現的に生成し、MRIを介して膀胱腫瘍の負担の大きさと拡張を画像化するために使用することができる。この技術は、高い診断品質で短時間の取得時間を持つオペレータに依存しない迅速なイメージングアプローチを使用して、腫瘍発生の中間段階でマウスのハイスループットアッセイを実施します。膀胱癌腫瘍形成を誘導するには、不透明な飲料水容器に0.05%BBNを加え、6週齢のC57黒6匹のマウスに温水を提供する。次に、週に2回、地元のIACUCガイドラインに従って膀胱腫瘍に関連する苦痛の徴候を監視する。暴露後16~24週、100~200マイクロリットルの無菌生理食塩水を備えた25~27本のゲージ針を装着した1ミリリットルの注射器をBBN処理動物に注入する。10分後、マウスを磁気共鳴画像装置の画像ホルダーに移し、生理学的記録コンピュータに接続された直腸温度プローブを挿入して、動物の体温を監視します。次に、マウスの下腹部に4チャンネルの直交レシーバーコイルを置き、統合されたイメージングソフトウェアで自動調整を開始し、マウス本体全体の3軸画像セットを取得します。この参照画像から、対象領域を特定し、軸、冠状、矢状の平面に沿って 3 組の直交スライスされた画像を取得します。定常進行イメージングシーケンスを使用して、TRを900ミリ秒、TEを2ミリ秒に、FAを70、14平均に設定します。次に、イメージングプラットフォームソフトウェア内で適切な幾何学パラメータを選択し、0.5ミリリットルの厚さの膀胱全体の一連のスライスと0.148ミリメートルの面内解像度を取得します。すべての画像が得られたら、膀胱全体を覆うスライスのセットを適切な医療画像分析ソフトウェアプログラムにエクスポートし、生成された画像をスクロールして膀胱の中間点にスライスを見つけ、膀胱壁と内腔の視覚化を可能にし、定量分析のために膀胱の中心にある代表的な軸索図を選択します。次に、膀胱の外側のエッジと内側の内腔の周囲の境界をトレースして、選択した代表的な軸方向のビュー内の対象領域を慎重に描き、外側の端から内腔を引いて膀胱壁の表面積を計算します。BBN曝露後20週間、70%エタノールで切開部を清掃し、鉗子を使用して腹壁の皮膚を持ち上げます。陰部のシンフィシスからxiphoidプロセスへの中線切開を行い、腹膜を把握して腹膜腔の鋭い切開を可能にする。正中線下腹部の膀胱を特定し、鉗子を使用して膀胱のドームを把握する。精嚢、直腸、脂肪を含む周囲の構造から膀胱を解剖する。膀胱のドームを臍と腹壁に接続する臍帯の中央値を切断します。膀胱の近くに尿管を切り、膀胱の頭蓋を持ち上げ、膀胱を取り除くために尿道を切る。次に、切除された膀胱をPBSですすいで、すぐにバランスで組織を計量します。ここで、膀胱壁3D再構成の安定した進行磁気共鳴画像を有する代表的な真の高速画像化および腫瘍を有するマウスおよび腫瘍を有しない対照マウスの病理画像が示されている。磁気共鳴画像に由来する膀胱壁厚は、毎週、元生体が得た膀胱重量測定と相関する。MRI由来膀胱壁厚および元生体取得膀胱体重データの検査は、腫瘍段階と同様に、非筋肉浸潤性膀胱癌および筋肉浸潤性膀胱癌による病理を階層化する際の関連も示している。完全な膀胱を持っているとき、マウスの画像を取得するのが最善であることを覚えておいてください。膀胱腫瘍のMRイメージング後、マウスは、適宜、同様の腫瘍特性を有するコホートに分割することができる。この技術は、研究者が私たちの患者の結果を改善するために新しい免疫療法やその他の治療法を探求することを可能にします。BBNは発がん性物質であり、この化合物を取り扱う際には常に適切な予防措置を講じるべきであることを覚えておくことが重要です。

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