Name: 酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶ Saccharomyces cerevisiaeを用いた神経変性疾患におけるヒストン翻訳後修飾変化の解析手法。ウェスタンブロットでエピジェネティック変化を検出し、診断マーカーと治療標的の発見に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

技術的なヘルプ、Royena Tanaz、Huda ユーサフと Sadiqa Taasen に感謝します。試薬およびスクロース チューニング実験の設計における知的支援の寛大な提供のため教授ジェームズ ・ ショーターに非常に感謝しております。酵母プラスミドだった (; 303 Gal FUS を含む教授アーロン ワシントンからの寛大な贈り物Addgene プラスミド # 29614)。ブルックリン大学、高度の科学研究センター (CUNY)、NIH NINDS 高度なポスドク遷移賞 (K22NS09131401) は郵政省をサポート

1. 神経変性認知症予備関連タンパク質の構造と出芽酵母の変換
<ol><li>酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YPD) スープ 30 ° C に (200 rpm) を振動で一晩で野生型 (WT) 303 酵母を育てる</li>
	<li>12−16 成長の h 後、希釈 600 光学密度酵母 YPD で 0.25 nm (外径600)。酵母液の培養の 10 mL は、各変換に必要となる、50 mL の液体培養の酵母のネガティブ コントロールの変換と同様、FUS、TDP 43、シヌクレインとベクトルのみ (ccdB) 構成要素に対応する 5 つの変換の準備します。なしの DNA。</li>
	<li>0.60 と 0.80 の間 OD600に到達するまでは、30 ° C で撹拌で酵母を育てます。これは一般に 4−6 h を取る。</li>
	<li>酵母の増殖が完了する前に 30 分では、プラスミドの構造をリニア化します。 注: ここで使用されるプラスミドの構成要素は、ゲノムに直接統合する必要があります、それゆえ線形変換前に必要。<ol>
<li>金額を計算プラスミド ストック量を引くこのボリュームは、1 μ g にヌクレアーゼ フリー H2O の必要量を計算する 44 μ L から。</li>
		<li>微量遠心チューブにヌクレアーゼ フリー H2O、10 x 制限酵素バッファー (材料表) の 5 μ L、NheI 制限酵素 (材料表) の 1 μ L、プラスミド (1.4.1 で計算されるステップ) の適切な量を追加します。上下ピペッティングにより徹底的に混合し、37 ° C、15 分インキュベートします。プラスミッドは、現在線形補間との準備ができての変換です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イースト菌文化 0.6 から 0.8、50 mL の円錐管でスピンダウン 850 x g 3 分破棄上清の 4 ° c で収穫細胞の OD600に達すると。</li>
	<li>細胞ペレットを 10 mL の滅菌 H2O の 3 分破棄上清の 4 ° C で 850 × gで遠心分離機に洗ってください。4 つの洗浄の合計の 3 倍を繰り返します。</li>
	<li>第 3 洗浄の開始時解凍し、サケ精子 DNA 変換反応暖房のブロック上で 5 分間ごとの 10 μ L を沸騰します。</li>
	<li>DH2O 変換あたりの 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁し、マイクロ遠心チューブ用の適切な数に分割します。5 変換 500 μ L の dH2O にペレットを再懸濁し、5 つの独立した遠心管に均等に分割します。</li>
	<li>常温 (RT) 850 x gで 5 分間遠心し、残りすべての水を削除します。</li>
	<li>滅菌 H2O、240 μ L 50% ポリエチレング リコール (PEG) の 1 M LiAc、サケ精子 DNA の 10 μ L、線形プラスミッド DNA の 20 μ L (変換制御なしの DNA のヌクレアーゼ フリー水) 36 μ L の 50 μ L を次の順序で追加します。混和後、それぞれ渦簡潔に変換のすべてのコンポーネントを追加した後。</li>
	<li>20 分の 42 ° C で変換反応を孵化させなさい。 注: より一貫性のある温度制御の水風呂でこのインキュベーションを行います。</li>
	<li>470 x g常温 5 分破棄上澄みで遠心し、滅菌 H2O を 200 μ L で各細胞ペレットを再懸濁します</li>
	<li>酵母懸濁液の選択培地プレート上にプレートし、ローリング ビーズまたは拡散機で 。30 ° C で 2−3 日間インキュベート プレート 注: 合成定義 (SD)-ここで説明されているプラスミッドのため彼のプレートを使用します。</li>
</ol>2. 測量グリセロールのコロニー成長抑制・
<ol><li>2% ラフィノースを添加した培地の 5 ml 変形プレートからシングル コロニーを接種します。一晩 30 ° C でシェーカーで育ちます。変換ごとに少なくとも 12 の植民地を選択します。 注:"ないの DNA"変換制御板の植民地は必要ありません。</li>
	<li>エタノール、炎が続くとピン フロッガーを滅菌します。</li>
	<li>カルチャごとに、96 ウェル プレートの最初の行で飽和細胞懸濁液 100 μ L 分注。隣接するよく列のすべてのウェルに 200 μ L 滅菌 H2O を追加します。1:5 のシリアル希薄、マルチ チャンネル ピペットが背後にある隣接する列が最初の列から 50 μ L を追加します。ピペッティングで徹底的にミックスします。50 μ L、2 列目から 3 列目とのミックスにして追加ピペッティングします。板の残りの部分についてこの手順を繰り返します。</li>
	<li>96 ウェル プレートにフロッガーを配置し、やさしく均等に培地プレート ガラクトースと押しによって、プレス プレート酵母。30 ° C で 2−3 日間インキュベートします。 注: SD 彼と SGal 彼のプレートは、ここで説明したプラスミドに使用されます。</li>
	<li>FUS、TDP-43、およびシヌクレイン、変換、ガラクトースの存在下でほとんど成長抑制を表示するコロニーを識別します。SD 彼のプレートからこの植民地を選択し、一晩成長の 2% ラフィノースを添加した培地 10 mL に接種します。ベクトル制御のコロニーのガラクトースの存在下で増殖抑制を表示されないようにするを選択します。</li>
	<li>グリセロールを準備するには、50% のグリセロールの 0.5 mL と飽和させた液体文化の 0.5 mL を組み合わせます。上下にピペッティングして混合し、-80 ° C で凍結 注意: グリセロールの格納することができます-80 ° C で 1 年まで</li>
</ol>3. 神経変性認知症予備の過剰発現は、出芽酵母におけるタンパク質を関連付けられています。
<ol><li>冷凍グリセロール、ヒスチジン、酵母を再デルスト リークから 2% ブドウ糖寒天培地選択培地プレートし、2−3 日, 30 ° C で。</li>
	<li>過剰発現モデルおよびヒスチジン選択液体培地添加 2% ラフィノースの 5 mL のコントロールごとに単一のコロニーを接種します。一晩で 30 ° C (200 rpm) の揺れとともに成長します。</li>
	<li>過剰発現モデルとコントロールのそれぞれの液体培養の 100 mL を成長 (FUS、TDP-43、およびベクトル制御; a シヌクレインとベクトル制御)。<ol>
<li>2% ガラクトースを添加した培地における文化の 100 mL を準備します。</li>
		<li>一晩文化の OD600を測定し、一晩かけて培養開始外径600 0.3 の過剰発現文化をレンダリングに必要な量を計算します。通常、一晩文化は一晩 100 mL の新鮮な文化の文化の約 5 mL を必要と 0.9−10 の外径600に達する。</li>
		<li>5 h (FUS と TDP 43) または 30 ° c. で揺すると 8 h (a シヌクレイン) ガラクトース メディア (手順 3.3.1 参照) に酵母を成長することにより蛋白過剰発現を誘導します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>誘導期の終わりに各文化の OD600を測定します。外径 φ600の最小値にすべての細胞数を標準化します。4 ° C で 5 分間 850 × gで遠心分離 50 mL チューブに文化を収穫します。上清を捨てます。 注: OD600値誘導の終了時に測定が場合 0.654 と 0.984、それぞれシヌクレインは文化の 100 mL と 100 mL 管理文化の 95 mL シヌクレインは文化と制御文化の 67.1 mL の収穫します。</li>
	<li>1 mL 滅菌 dH2O のための栽培文化のすべての 10 mL にペレットを再懸濁します。早かったセル巻き上がり 1 mL 遠心チューブに、ペレットを均等に分割します。たとえば、100 ml の培養の場合、滅菌 dH2O 10 mL にペレットを再懸濁します、10 マイクロ遠心チューブ用に分割します。</li>
	<li>850 x g 4 ° C で 5 分間遠心し、上清を除去します。細胞ペレットに凍結する液体窒素、-80 ° C の店で 注: 細胞ペレットは-80 ° C で 1 年間保存できます。</li>
</ol>4. セル換散およびヒストン翻訳後修飾を検出する西部のしみ
<ol><li>セル換散<ol>
<li>氷の上の酵母細胞ペレットを解凍し、dH2o. の 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁します</li>
		<li>セル巻き上がりに 0.2 M NaOH の 300 μ L と 2-メルカプトエタノールの 20 μ L を追加します。上下にピペッティングによって再懸濁します。</li>
		<li>10 分間氷の上のセルをインキュベートし、30 卓上遠心分離機に 3,200 x gで遠心分離した破棄上澄みで s。</li>
		<li>染料と暖房のブロック上で 10 分間沸騰ロード x 1 の 100 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。 注:テーブルの材料でローディングの染料 × 6 のレシピを見つけることができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動と膜を転送します。<ol>
<li>バッファーを実行している 2 つのゲル ライン マーク外チャンバーを充填とトップへのゲル ホルダーと充填内側室に 2 つのゲルを置くことによってゲル室を準備します。</li>
		<li>まあ 10 も 12% ポリアクリルアミドゲルに、4.1.4 ステップから 15 μ L のサンプルをロードします。蛋白質の梯子レーンの 5 μ L をロードします。</li>
		<li>150 V、またはゲルの底に達する色素フロントの読み込みまでは、約 45 分のためのゲルを実行します。</li>
		<li>ゲルの実行中を転送バッファー (材料表) の繊維のパッド (ゲルごとに 2 つ) を浸漬し、メタノールのポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜を浸漬膜転送の準備します。転送する前に転送バッファーの膜をすすいでください。 注: PVDF 膜のゲルのサイズにカットする必要があります、転送されるすべてのゲルの 1 つの PVDF 膜を使用します。</li>
		<li>アセンブル、セミドライの転送装置のセルに転送 'サンドイッチ': 下部電極から (1) さら繊維パッド、洗われ、(2) さら PVDF 膜、4.2.3 のステップからゲル (3) および (4) 2 番目のさら繊維パッドを配置。 メモ:、必ず転送 'サンドイッチ' の空気泡を避けるために'サンドイッチ' 泡を強制的に血清ピペットをゆっくりと転がしてください。ゲルは、PDVF 膜上に配置されている、それを移動しないように確認します。</li>
		<li>電源パックを 150 に設定すると、タンパク質の転送を行う mA 1 h (1 つ ' サンドイッチ')。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヒストン Ptm 変更特定の抗体の検出<ol>
<li>転送装置から膜を削除します。すすぎ簡単に dH2o.<ol>
<li>必要に応じて、小さなプラスチックの箱に膜をカバーし、30−60 s. 削除 Ponceau S の穏やかな揺れで RT のインキュベーションを汚し、背景の汚れまで dH2O で洗浄十分な Ponceau S 汚れを注ぐことによって Ponceau S 染色でタンパク質の転送をチェックします。消える、蛋白質バンドが肉眼に目に見える。DH2O 膜からすべての汚れがなくなるまですすぎを続けます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>染色の小箱でトリス緩衝生理食塩水 (TBS) ブロック バッファー (材料表) の穏やかな揺動と RT で 1 h のしみの孵化によって膜をブロックします。しみをカバーするのに十分なブロック バッファーを使用します。 注意: 蛋白質がうそをつく膜側がに直面していないので、染色のボックスに直立に膜を配置するように気をつけてください。</li>
		<li>一晩 4 ° C で酵母に対する反応性ヒストン修飾特異抗体で染色のボックスでしみを孵化させなさいメーカーの仕様によると TBS のブロック バッファーで抗体を希釈します。修飾特異抗体から別のホスト種で発生した反合計 H3 などの適切な核積載コントロールがあります。例えば、ウサギで育った抗 H3S10ph 抗体を用いた H3S10ph の調査している場合、は、ローディング コントロールとしてのマウスで発生した反合計 H3 抗体を使用します。必要に応じて、すべてのしみのため、この手順を繰り返します。 注: 抗体希釈液は一ヶ月の内で 3 回の合計は再利用できます。4 ° C で保存します。</li>
		<li>4 膜を洗浄の x 家製 TBS + 0.1% ポリソルベート 20 (TBST) 室温ロッキング 5 分</li>
		<li>メーカー指定の希釈 (ロバ抗家兎 680 とロバ抗マウス) 室温 1 時間で二次抗体を蛍光でしみを孵化させなさい 注: 二次抗体を蛍光は、記憶域と使用率の両方の中に光から保護する必要があります。黒いプラスチックの箱でインキュベーションを行うまたは、アルミ箔でカバーします。</li>
		<li>洗浄を 4 x tbst 5 分、室温を揺動しながら 5 分間 TBS で洗う</li>
		<li>2 分のシステムをイメージング蛍光西部のしみしみを視覚化視覚化抗家兎 680 と抗マウス 800 二次抗体、800 nm と 700 nm チャンネル、それぞれ。 注: 複製で独立して行うセクション 1 から始まっています。抗体信号が信号応答のこれらの実験の適切なデータ解釈のために線形範囲内にあることを確認する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. データ分析と統計
<ol><li>イメージング ソフトウェア (材料表) のしみの画像を開く。分析モードでバンドを囲む四角形を描画することによって、ベクトル制御、TDP-43、FUS (またはベクトル制御とシヌクレインは) 変更特定バンド サンプルの生の密度を取得します。</li>
	<li>コントロール バンドの読み込み手順 5.1 を繰り返します。 注: ローディングがあるでしょうバンドと各サンプルの変更特定のバンドを制御します。</li>
	<li>密度ベクトル コントロールのサンプルに対応するバンドの各バンドで割って修正特定バンドの相対的な密度を計算します。これは、ベクトル制御をデータを正規化します。</li>
	<li>読み込みの相対密度を計算対応する読み込みの密度で各バンドを割ってコントロール バンド ベクトル コントロールのサンプル コントロール バンド。</li>
	<li>読み込みの相対密度を介して変更特定バンドの相対的な密度で割って各バンドの調整の相対的な密度を計算する各サンプルのコントロール バンド。今、ヒストグラムの形式でデータを視覚化できます。 注: 処理しやすいように、手順 5.3-5.5 はスプレッドシート (補足ファイル) で実行できます。</li>
	<li>複数の独立した複製、2 つの制御サンプルと適切な認知症予備の実行のウェルチの T 検定pの (FUS 対コントロール、TDP-43 対コントロールおよびシヌクレインは対コントロール) のモデルの後は意義のためのカットオフとして 0.05 を =.</li>
</ol>

<ol><li>Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).</li>
<li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li>
<li>Beitz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+Disease%3A+a+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Parkinson's Disease: a Review.</a> Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li>
<li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013(2017).</li>
<li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).</li>
<li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li>
<li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li>
<li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS%2FTLS+in+ALS+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li>
<li>King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tip+of+the+iceberg%3A+RNA-binding+proteins+with+prion-like+domains+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease.</a> Brain Research. 1462, 61-80 (2012).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li>
<li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson%27s+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).</li>
<li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+parkinson%27s+disease%3A+dopamine%2C+vesicles+and+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+in+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li>
<li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li>
<li>Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+concepts+of+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Basic concepts of epigenetics.</a> Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).</li>
<li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and transcriptional regulatory.</a> Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li>
<li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li>
<li>Sanchez, Y., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP104+required+for+induced+thermotolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HSP104 required for induced thermotolerance.</a> Science. 248 (4959), 1112(1990).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772(2003).</li>
<li>Johnson, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+Is+Intrinsically+Aggregation-prone%2C+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis-linked+Mutations+Accelerate+Aggregation+and+Increase+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329(2009).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLOS Biology. 9 (4), e1000614(2011).</li>
<li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).</li>
<li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li>
<li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Reveal+a+%E2%80%9CDruggable%E2%80%9D+Rsp5%2FNedd4+Network+that+Ameliorates+%CE%B1-Synuclein+Toxicity+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979(2013).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li>
<li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757(1990).</li>
<li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591(2016).</li>
<li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li>
<li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+sequestration+of+FUS%2FTLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li>
<li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+%28ALS%29+Causing+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li>
<li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson%E2%80%99s+disease%3A+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li>
<li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Modifications+of+the+%CE%B1-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345(2018).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明したプロトコルでは、神経変性の proteinopathies に関連するゲノム ヒストン PTM 変化を分類する、方便、簡単でコスト効果の高い方法を提供します。ALS は、PD の他のモデルがありますが、体外などひと細胞およびマウス モデル32、出芽酵母のままその使いやすさのために魅力的です。例えば、無菌フードの使用を必要としない酵母モデルも集中的な訓練に同調細胞培養作業が必要か。さらに、酵母を培養用試薬は哺乳類の細胞の文化用品よりもより手頃な価格も。酵母のモデルは、タンパク質凝集22,23,24,25,26, ドメインの決定要因を明らかにするだけでなく、また遺伝的リスクの発見につながっているに悪用されています。ALS<...

神経変性疾患は、治療オプションがなしにはほとんどの壊滅的な病気です。これらのうち、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) やパーキンソン病 (PD) は特に恐ろしいです。ALS と PD 症例の約 90% は散発的な残りのケースが家族で実行、一般に特定の遺伝子変異の1,2にリンクされている疾患の家族歴なしで発生すると見なされます。興味深いことに、これらの疾患の両方はタンパク質サッカード定位誤りと集計3,4,5,6に関連付けられます。例えば、肉腫 (FUS) の融合し、43 (TDP-43) のタール DNA 結合タンパク質が RNA 結合蛋白質細胞質に mislocalize、ALS7,8,9,10、集計 11,12, α-シヌクレインは PD5,13,14,15にレビー小体と呼ばれるタンパク質の集合体の主成分。
患者集団における大規模なゲノム広い連合の努力にもかかわらず ALS と PD 症例の大多数は遺伝子説明されていなく残る。エピジェネティクスは、神経変性疾患における役割を再生できますか。エピジェネティクスは、基になる DNA シーケンス16に変更もなしで起こる遺伝子発現の変化を構成されています。主要なエピジェネティックなメカニズムには16ヒストン蛋白質の翻訳後修飾 (Ptm) が含まれます。真核生物の細胞の遺伝物質はしっかりとクロマチンにラップされます。クロマチンの基本単位は、DNA がヒストン 8 量体の周りをラップの 146 の塩基対から成る、ヌクレオソーム ヒストン (2 部各ヒストン H2A、H2B、H3、および H4)17の 4 つのペアから成るです。各ヒストンは N ターミナル尾ヌクレオソームの突き出した、リジンとアルギニン残基18上通常の様々 な化学基の付加によって変更することができます。これらの Ptm は動的なつまり、彼らは、簡単に追加することができます削除とアセチル化、メチル化、リン酸化などのグループが含まれます。Ptm は DNA の転写の機械へのアクセシビリティを制御し、制御遺伝子式18のため。たとえば、ヒストンのアセチル化は、非常に基本的なヒストン蛋白質と負荷電 DNA のバックボーン、充填よりアクセスできるアセチル化されたヒストン遺伝子を許可するとの間の静電相互作用の強さを軽減でき、高19を表明しました。最近では、特定のヒストン Ptm との組み合わせの顕著な生物学的特異性が、ヒストン コード仮説20,21どの蛋白質を書き込み、消去、およびヒストン Ptm のすべての行為にコンサートを読むにつながっています。遺伝子発現を調節します。
酵母は、神経変性疾患の研究に非常に有用なモデルです。重要なは、多くの神経細胞は、酵母から人間22,23,24に保存されます。酵母は、細胞毒性や α-シヌクレイン22,23,24,25,26や TDP-43、FUS の過剰発現タンパク質含有を要約します。実際には、ALS の酵母モデルは人間27遺伝的リスク要因を識別するために使用されています。さらに、酵母の過剰発現ヒト α シヌクレイン ニューロン28,29α シヌクレインの毒性を改善するための Rsp5 ネットワークの特性を druggable ターゲットとしての許可。
ここでは、神経変性 proteinopathies (図 1) に関連付けられているゲノム ヒストン PTM の変更を検出する酵母を利用するプロトコルについて述べる。出芽酵母の使用は、その使いやすさ、低コストと神経変性の他の in vitro および動物モデルと比較して速度のため非常に魅力的です。ALS は、PD モデル22,23,25,26を開発活用以前、我々 人間の FUS、TDP-43、および α-シヌクレイン酵母と覆いを取られた異なるヒストン PTM 変化で過剰に発現認知症予備30との接続。ここで説明されているプロトコルは、データ解析への変換から 2 週間足らずで完了ことができます。

<table><tbody><tr><td>-His DO Supplement</td><td>Clontech</td><td>630415</td><td></td></tr><tr><td>10x Running Buffer</td><td></td><td></td><td>Mix:グリシン141.65g(ThermoFisher BP381-1)、Tizmaベース30.3g(Sigma-Aldrich T6066)、ドデシル硫酸ナトリウム10g(Sigma-Aldrich L3771)、脱イオン水1L、pH8.8。</td></tr><tr><td>12% ポリアクリルアミドゲル</td><td>BIO-RAD</td><td>456-1041</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>抗アセチルヒストン H3 (Lys14) 一次抗体</td><td>MilliporeSigma</td><td>07-353 (ロット番号 2762291)</td><td>希釈率: 1/1000</td></tr><tr><td>アンチアセチル-ヒストン H4 (Lys 16) 一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab109463 (ロット番号GR187780)</td><td>希釈率:1/2000</td></tr><tr><td>抗アセチルヒストンH4(Lys12)一次抗体Abcam</td><td></td><td>ab46983(ロット番号GR71882)</td><td>希釈率:1/5000</td></tr><tr><td>抗ジメチルヒストンH3(Lys36)一次抗体Abcam</td><td></td><td>ab9049(ロット番号GR266894、GR3236147)</td><td>希釈率:1/1000</td></tr><tr><td>抗ヒストンH3一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab24834 (ロット番号GR236539、GR174196、GR3194335)</td><td>核装填制御;希釈率: 1/2000</td></tr><tr><td>抗リン酸化ヒストン H2B (Thr129) 一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab188292 (ロット番号GR211874)</td><td>希釈度:1/1000</td></tr><tr><td>抗リン酸化ヒストンH3(Ser10)一次抗体</td><td>アブカム</td><td>ab5176(ロットNo.GR264582、GR192662、GR3217296)</td><td>希釈:1/1000</td></tr><tr><td>BioPhotometer D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>30702118</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Plate, 96 well</td><td>Eppendorf</td><td>30730011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32212 (ロット番号 C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td><td>希釈率: 1/5000</td></tr><tr><td>ロバ アンチウサギ IRDye 860 RD</td><td>LI-COR</td><td>926-68073 (ロット番号 C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td> <td>希釈率: 1/2500</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>極厚ブロット紙 (濾紙)</td><td>BIO-RAD</td><td>1703968</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>20% w/v ストック溶液を調製します。</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>20% w/v ストック溶液を調製します。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>50 % w/v溶液を調製します。</td></tr><tr><td>Immobilon-FL トランスファーメンブレン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>酢酸リチウム二水和物 (LiAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td>1 M 溶液を調製します。</td></tr><tr><td>ローディング色素</td><td></td><td></td><td>ミックス:1.2 gのドデシル硫酸ナトリウム、6 mgのブロモフェノールブルー(Sigma-Aldrich B8026)、4.7 mLのグリセロール、1.2 mLの0.5M Trizma塩基pH 6.8、0.93 gのDL-ジチオスレイトール(Sigma-Aldrich D0632)、および2.1 mLの脱イオン水。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ThermoFisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipet</td><td>Eppendorf</td><td>2231300045</td><td></td></tr><tr><td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td><td>New England Bio Labs</td><td>102855-152</td><td></td></tr><tr><td>Nhe I Restriction</td><td>Enzyme New England Bio Labs</td><td>101228-710</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc Imaging System</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>2800-03</td><td></td></tr><tr><td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td><td>ThermoFisher</td><td>165218</td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td><td>Gift from A. Gitler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-ccdB</td><td>Addgene</td><td>14133</td><td></td></tr><tr><td>pAG303Gal-FUS</td><td>Addgene</td><td>29614</td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-TDP-43</td><td>A. Gitler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td><td>からの贈り物 50% w/v 溶液を準備します。</td></tr><tr><td>Ponceau S Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504</td><td>Mix:0.5 g 0.1% w/w Ponceau S 色素、5 mL 1% v/v 酢酸(Sigma-Aldrich 320099)、および 500 mL 脱イオン水。</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7630</td><td>10% w/v ストック溶液を調製します。</td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Agilent Tech</td><td>201190</td><td></td></tr><tr><td>SD-His プレート</td><td></td><td></td><td>ミックス: 20 g 寒天 (Sigma-Aldrich A1296)、0.77 g -His DO サプリメント、6.7 g 酵母窒素塩基 (アミノ酸なし) (ThermoFisher 291920)、および 900 mL 脱イオン水。</td></tr><tr><td>SGal-Hisプレート</td><td></td><td></td><td>ミックス:寒天20 g、0.77 g-His DOサプリメント、6.7 g酵母窒素ベース(アミノ酸なし)、100 mLガラクトース溶液、900 mL脱イオン水。</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウムローディングバッファー</td><td></td><td></td><td>-20°Cで保存 6X、ミックス:ドデシル硫酸ナトリウム1.2 g、ブロモフェノールブルー6 mg、DL-ジチオスレイトール0.93 g、脱イオン水2.1 mL、グリセロール4.7 mL、0.5 M Trizma塩基1.2 mL、pH 6.8。</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>0.2 M溶液を調製します。</td></tr><tr><td>スクロー</td><td>スSigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>20% w / vストック溶液を調製します。</td></tr><tr><td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td><td></td><td></td><td>ミックス: 100 mL 10X TBS、1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949)、および 900 mL 脱イオン水。</td></tr><tr><td>TBSブロッキングバッファー</td><td>LI-COR</td><td>927-5000</td><td></td></tr><tr><td>トランスブロットSDセミドライ電気泳動トランスファーセル</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーバッファー</td><td></td><td></td><td>ミックス:グリシン22.5 g、チズマベース4.84 g、メタノール400 mL、ドデシル硫酸ナトリウム1 g、脱イオン水1.6 L。</td></tr><tr><td>トリス緩衝生理食塩水(TBS)</td><td></td><td></td><td>10X、pH 7.6、溶液:トリズマ塩基24 gと塩化ナトリウム88 g(Sigma-Aldrich S7653)を混合します。脱イオン水で1Lまで満たします。</td></tr><tr><td>WT 303 S. cerevisiae 酵母</td><td>J. Shorter</td><td></td><td></td>からの贈り物</tr> 酵母<tr><td>抽出物 ペプトン デキストロース (YPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375</td><td></td></tr></tbody></table>

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) やパーキンソン病 (PD) などは、毎年の生活の何千もの何百もの損失を引き起こします。病気の進行を停止することができる効果的な治療オプションが不足しています。患者集団における広範なシーケンスの努力にもかかわらずほとんどの ALS と PD の場合単独で遺伝的変異が原因不明のまま。ヒストン蛋白質の翻訳後修飾などのエピジェネティクス機構は、神経変性疾患病因と進展に関与する可能性があり、薬学的介入のための新しいターゲットに 。ALS と PD の哺乳類の生体内および生体外モデルは高価であり、しばしば長引くと面倒な実験的プロトコルを必要とします。ここでは、我々 は出芽酵母をモデル システムとして使用してヒストン修正レベルのゲノム変化を決定する実用的な高速、かつコスト効率の高いアプローチを概説します。このプロトコルは、エピジェネティックな変化の知識を大幅に拡大している間別のモデル システムの前の調査結果を裏付ける神経変性 proteinopathies に接続されている包括的な調査、神経変性疾患エピゲノム。

このメソッドを示すためには、我々 を最近公開された結果30の利用します。WT 人間 FUS と TDP 43 はいた WT α-シヌクレインが過剰に発現して 8 時間中 5 時間過剰発現。CcdB コンストラクトは、ベクトルのネガティブ コントロールとして使用されました。図 2は、固体および液体文化で成長抑制を示しています。前述の酵母が収穫され、の修飾特異抗体を用いたウエスタンブロットを行った。反計 H3 は、ローディング コントロールとして使用されました。H3S10ph と H3K14ac のレベルの重要な減少は、FUS 過剰発現モデル (図 3 a, b) で明らかです。H4K12 と H4K16 のいずれかで、FUS は観察されなかったが TDP 43 過剰発現モデルまたは α-シヌクレイン発現モデル (図 3 c</stro...

このプロトコル ヒストン翻訳後修飾 (PTM) ALS およびパーキンソン病に関連するタンパク質の過剰発現に関連して発生するレベルのゲノム変化を特徴づける実験手順の概要を説明します。出芽酵母のモデル。SDS ページの分離後個々 のヒストン翻訳後修飾レベルは西部にしみが付くことによって修飾特異抗体で検出されます。

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

このプロトコルは、神経変性疾患のエピジェネティックな特徴を容易に探求することを可能にする。この技術の主な利点は、酵母をモデルシステムとして利用し、神経変性疾患の他の細胞および動物モデルと比較して、酵母が便宜的かつコスト効率が良いということです。この技術は、診断のための新しいマーカーにつながる可能性のある神経変性疾患で生じるエピジェネティックな変化と、治療のための新しい標的をマッピングすることを可能にする。この方法は、神経変性疾患におけるエピジェネティックマークの役割のさらなる調査を可能にし、ヒト線維芽細胞および誘導多能性幹細胞の評価のために改変することができる。この特定の方法には、ウェスタンブロット装置の適切なローディングなど、視覚的に実証する必要がある多くの詳細が含まれています。この手順のデモンストレーションは、トレント研究所の学部研究者であるミシェル・ファラとナヴィン・ラナです。冷凍グリセロールストックからヒスチジン2%グルコース寒天選択的培地プレートに酵母を取り付け、摂氏30度で2〜3日間インキュベーションすることから始めます。インキュベーションの終了時に、各オーバー発現モデルに対して酵母を接種し、ヒスチジン選択的液体培地の5ミリリットルで制御する。摂氏30度で2%ラフィノース、毎分200回転、一晩で補います。翌朝、一晩で2%ガラクトースを補充した選択的培地における過剰発現モデルおよび制御のそれぞれについて、100ミリリットルの液体培養液を成長させる。そして、600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定し、0.3の開始OD600で発現培養に必要な一晩の培養量を決定します。タンパク質の過剰発現を誘導するために、ガラクトース培地上で酵母を成長させ、適切な実験期間に摂氏30度で揺れる。次に、誘導期間の終わりに各培養のOD600を測定する。そして、すべてのセルカウントを最小のOD600値に標準化します。遠心分離によって50ミリリットル遠心分離管で培養物を収穫し、成長した培養物の10ミリリットルごとに無菌スティル水の1ミリリットルでペレットを再懸濁する。アリコート1ミリリットルの細胞再懸濁液を個々のマイクロ遠心分離チューブに追加の遠心分離のために、上清を吸引する。その後、液体窒素中の細胞ペレットをマイナス80°Cで保存するためにスナップします。ウエスタンブロット分析のために細胞を解凍するには、蒸留水100マイクロリットルで再懸濁する前に、氷上の酵母細胞ペレットを解凍します。各細胞サンプルに0.2モル水酸化ナトリウム300マイクロリットルと20マイクロリットルの2-メルカプトエタノールを加えます。そして、ピペット処理によってペレットを再中断します。氷上で10分間のインキュベーションの後、遠心分離により細胞をペレット化し、100マイクロリットルの負荷染料でサンプルを再懸濁した。その後、加熱ブロックで10分間サンプルを沸騰させます。サンプルが取り付けられている間、ゲルホルダーに2つのゲルを入れ、内側のチャンバーをランニングバッファで上部に、外側のチャンバーを2ゲルラインマークに充填します。サンプルの準備ができたら、それぞれ15マイクロリットル、細胞溶解溶液を10ウェルの各ウェルに12%ポリアクリルアミドゲルにロードし、タンパク質ラダーレーンによくタンパク質ラダーの5マイクロリットルを追加します。ゲルを約45分間150ボルトで実行するか、またはローディング染料前面がゲルの底部に達するまで実行します。ゲルが動いている間に、転写バッファーにゲルあたり2つの繊維パッドを浸し、1つのポリビニリデンフッ化物、またはPVDF、1ゲルあたりの膜をメタノールに浸します。ゲルが準備ができたら、膜を転写バッファーにすい、半乾燥転写装置の下部に1つのプリ浸し繊維パッドを置く。その後PVDF膜、ゲル及び第2のプリ浸し繊維パッドが続く。その後、1時間150ミリアンペアに電力を設定します。タンパク質の移動の終了時に、蒸留水で短時間リンスするために、転写装置から膜を取り除く。すすい膜、タンパク質側を小さな染色ボックスに置き、トリスバッファー付き生理食物またはTBSで膜を覆い、緩やかな揺れで室温で1時間のインキュベーションを阻止します。ブロッキングインキュベーションの終了時に、抗酵母ヒストンと改変特異的抗体を摂氏4度でTBSで一晩インキュベートします。そして、適切な核負荷制御抗体。翌朝、膜をTBSで4回洗浄し、0.1%ポリソルベート20を5分間、洗浄ごとに室温で揺らします。最後の洗浄後、適当な二次抗体を室温で1時間インキュベートします。その後、TBSTで4分、5分間の洗浄、TBSだけで5分間の洗浄を行います。その後、蛍光ウェスタンブロットイメージングシステム上のブロットを2分間イメージングします。ここで、固体および液体培養における成長抑制は、肉腫過剰発現モデルにおいてガラクトース注入された酵母の存在下で観察される酵母の増殖に有意な影響を与えることを示している。ヒストンレベルの有意な減少は肉腫過剰発現モデルにおける融合において明らかであり、また、TAR結合タンパク質43過剰発現モデルにおけるヒストンアセチル化のレベルの有意な増加は、肉腫またはαシヌクレイン過剰発現モデルのいずれにも見られないことが観察される。αシヌクレイン過剰発現モデルのヒストンレベルにも有意な低下がある。本ショ糖チューニング実験では、肉腫過発現に融合を誘導するために用いられるガラクトースの量が少ないほど、固体培養液と液培養液の両方で観察される毒性が低くなる。重要なのは、肉腫過剰発現における融合のレベルが低いほど、ヒストンレベルの減少の大きさが小さくなる。このプロトコルを実行している間、ヒストン翻訳後修飾のレベルで適切な比較を可能にするために、各サンプル中の酵母の量を標準化することが不可欠です。2-メルカプトエタノールは、吸入を避けるためにフードの下で使用する必要があります。ポンソー染色を使用する場合は、適切に廃棄する必要があります。

characterizing-histone-post-translational-modification-alterations

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このインタビューで、博士はLindquistさんは、タンパク質の折り畳み、プリオン病や神経変性疾患との関係を説明します。タンパク質の折り畳みの問題は、現代生物学の中核です。彼らの伝統的な生化学的機能に加えて、タンパク質は、生体情報の伝達を媒介することができるため、遺伝物質と見なすことができます。タンパク質のこの最近発見された機能は、ヒトの疾患の研究のための重要な意味を持っています。博士はLindquistさんはまた、モデル生物の遺伝学的研究に基づいて、神経変性疾患のメカニズムを調査するために、現在の実験的アプローチを説明します。...

インタビュー：タンパク質フォールディングと神経変性疾患の研究

ここではでプラスミド過剰発現の画面を説明...

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

本稿ではポリグルタミンの毒性を評価するための3つの相補的なプロトコル（polyQ）拡張酵母のタンパク質について説明します。...

成長アッセイ酵母におけるポリグルタミン毒性を評価する

出典:Bennett, S. A., et al., 酵母神経変性タンパク質症モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特徴付け.J. Vis. Exp.

神経変性タンパク質の過剰発現を伴う酵母細胞におけるヒストン修飾の検出

酵母タンパク質症モデルは、病気に関与するタンパク質の毒性と凝集を評価するための貴重なツールです。ここでは、Hsp104バリアントライブラリの毒性抑制因子をスクリーニングする方法を紹介します。このプロトコールは、酵母に毒性のある任意のタンパク質の毒性抑制因子について、任意のタンパク質ライブラリをスクリーニングするために適合させることができます。...

酵母Proteinopathyモデルを用いた増強Hsp104のバリアントを分離

ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。...

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

Saccharomyces cerevisiaeの内因性位置でヒストン遺伝子の突然変異を生成するための戦略が提示されます。...

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

このプロトコルは、3次元細胞培養システムを使用して、ほぼ生理学的状態のクロマチン修飾をモデル化、処理、および分析する方法を概説しています。...

肝組織の3D細胞培養モデルにおけるヒストン翻訳後修飾のグローバルレベルの定量化

パーキンソン病の病態を研究・理解するためには、α-シヌクレインの in vivo...

ヒト化酵母モデルを用いたα-シヌクレインの毒性と凝集の研究法

ここでは、ヒトγ-セクレターゼを再構成する酵母系について述べる。このシステムにより、活性に影響を与える突然変異の同定と研究、およびγ-セクレターゼ阻害剤(GSI)のスクリーニングが可能になります。家族性アルツハイマー病変異体の機能喪失特性を利用して、γ-セクレターゼモジュレーター(GSM)のスクリーニングが可能です。...

出芽酵母 γ-セクレターゼによるアミロイドベーターゼ産生に影響を与える遺伝子、突然変異、および化学物質をスクリーニングするためのアルツハイマー病のモデル

学ぶ Saccharomyces cerevisiaeを用いた神経変性疾患におけるヒストン翻訳後修飾変化の解析手法。ウェスタンブロットでエピジェネティック変化を検出し、診断マーカーと治療標的の発見に貢献します。

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

さらに動画を探す