酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性
March 24th, 2019
このプロトコル ヒストン翻訳後修飾 (PTM) ALS およびパーキンソン病に関連するタンパク質の過剰発現に関連して発生するレベルのゲノム変化を特徴づける実験手順の概要を説明します。出芽酵母のモデル。SDS ページの分離後個々 のヒストン翻訳後修飾レベルは西部にしみが付くことによって修飾特異抗体で検出されます。
このプロトコルは、神経変性疾患のエピジェネティックな特徴を容易に探求することを可能にする。この技術の主な利点は、酵母をモデルシステムとして利用し、神経変性疾患の他の細胞および動物モデルと比較して、酵母が便宜的かつコスト効率が良いということです。この技術は、診断のための新しいマーカーにつながる可能性のある神経変性疾患で生じるエピジェネティックな変化と、治療のための新しい標的をマッピングすることを可能にする。
この方法は、神経変性疾患におけるエピジェネティックマークの役割のさらなる調査を可能にし、ヒト線維芽細胞および誘導多能性幹細胞の評価のために改変することができる。この特定の方法には、ウェスタンブロット装置の適切なローディングなど、視覚的に実証する必要がある多くの詳細が含まれています。この手順のデモンストレーションは、トレント研究所の学部研究者であるミシェル・ファラとナヴィン・ラナです。
冷凍グリセロールストックからヒスチジン2%グルコース寒天選択的培地プレートに酵母を取り付け、摂氏30度で2〜3日間インキュベーションすることから始めます。インキュベーションの終了時に、各オーバー発現モデルに対して酵母を接種し、ヒスチジン選択的液体培地の5ミリリットルで制御する。摂氏30度で2%ラフィノース、毎分200回転、一晩で補います。
翌朝、一晩で2%ガラクトースを補充した選択的培地における過剰発現モデルおよび制御のそれぞれについて、100ミリリットルの液体培養液を成長させる。そして、600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定し、0.3の開始OD600で発現培養に必要な一晩の培養量を決定します。タンパク質の過剰発現を誘導するために、ガラクトース培地上で酵母を成長させ、適切な実験期間に摂氏30度で揺れる。
次に、誘導期間の終わりに各培養のOD600を測定する。そして、すべてのセルカウントを最小のOD600値に標準化します。遠心分離によって50ミリリットル遠心分離管で培養物を収穫し、成長した培養物の10ミリリットルごとに無菌スティル水の1ミリリットルでペレットを再懸濁する。
アリコート1ミリリットルの細胞再懸濁液を個々のマイクロ遠心分離チューブに追加の遠心分離のために、上清を吸引する。その後、液体窒素中の細胞ペレットをマイナス80°Cで保存するためにスナップします。ウエスタンブロット分析のために細胞を解凍するには、蒸留水100マイクロリットルで再懸濁する前に、氷上の酵母細胞ペレットを解凍します。
各細胞サンプルに0.2モル水酸化ナトリウム300マイクロリットルと20マイクロリットルの2-メルカプトエタノールを加えます。そして、ピペット処理によってペレットを再中断します。氷上で10分間のインキュベーションの後、遠心分離により細胞をペレット化し、100マイクロリットルの負荷染料でサンプルを再懸濁した。
その後、加熱ブロックで10分間サンプルを沸騰させます。サンプルが取り付けられている間、ゲルホルダーに2つのゲルを入れ、内側のチャンバーをランニングバッファで上部に、外側のチャンバーを2ゲルラインマークに充填します。サンプルの準備ができたら、それぞれ15マイクロリットル、細胞溶解溶液を10ウェルの各ウェルに12%ポリアクリルアミドゲルにロードし、タンパク質ラダーレーンによくタンパク質ラダーの5マイクロリットルを追加します。
ゲルを約45分間150ボルトで実行するか、またはローディング染料前面がゲルの底部に達するまで実行します。ゲルが動いている間に、転写バッファーにゲルあたり2つの繊維パッドを浸し、1つのポリビニリデンフッ化物、またはPVDF、1ゲルあたりの膜をメタノールに浸します。ゲルが準備ができたら、膜を転写バッファーにすい、半乾燥転写装置の下部に1つのプリ浸し繊維パッドを置く。
その後PVDF膜、ゲル及び第2のプリ浸し繊維パッドが続く。その後、1時間150ミリアンペアに電力を設定します。タンパク質の移動の終了時に、蒸留水で短時間リンスするために、転写装置から膜を取り除く。
すすい膜、タンパク質側を小さな染色ボックスに置き、トリスバッファー付き生理食物またはTBSで膜を覆い、緩やかな揺れで室温で1時間のインキュベーションを阻止します。ブロッキングインキュベーションの終了時に、抗酵母ヒストンと改変特異的抗体を摂氏4度でTBSで一晩インキュベートします。そして、適切な核負荷制御抗体。
翌朝、膜をTBSで4回洗浄し、0.1%ポリソルベート20を5分間、洗浄ごとに室温で揺らします。最後の洗浄後、適当な二次抗体を室温で1時間インキュベートします。その後、TBSTで4分、5分間の洗浄、TBSだけで5分間の洗浄を行います。
その後、蛍光ウェスタンブロットイメージングシステム上のブロットを2分間イメージングします。ここで、固体および液体培養における成長抑制は、肉腫過剰発現モデルにおいてガラクトース注入された酵母の存在下で観察される酵母の増殖に有意な影響を与えることを示している。ヒストンレベルの有意な減少は肉腫過剰発現モデルにおける融合において明らかであり、また、TAR結合タンパク質43過剰発現モデルにおけるヒストンアセチル化のレベルの有意な増加は、肉腫またはαシヌクレイン過剰発現モデルのいずれにも見られないことが観察される。
αシヌクレイン過剰発現モデルのヒストンレベルにも有意な低下がある。本ショ糖チューニング実験では、肉腫過発現に融合を誘導するために用いられるガラクトースの量が少ないほど、固体培養液と液培養液の両方で観察される毒性が低くなる。重要なのは、肉腫過剰発現における融合のレベルが低いほど、ヒストンレベルの減少の大きさが小さくなる。
このプロトコルを実行している間、ヒストン翻訳後修飾のレベルで適切な比較を可能にするために、各サンプル中の酵母の量を標準化することが不可欠です。2-メルカプトエタノールは、吸入を避けるためにフードの下で使用する必要があります。ポンソー染色を使用する場合は、適切に廃棄する必要があります。
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概要
このプロトコルは、モデルシステムとしてSaccharomyces cerevisiaeを使用して神経変性疾患に関連するエピジェネティック特徴の探索を可能にします。ALSとパーキンソン病に関連するヒストン翻訳後修飾のゲノム全体の変化を特徴づけることによります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- エピジェネティクス
- 神経変性疾患
背景
- ALSやパーキンソン病のような神経変性疾患は複雑なエピジェネティック変化を含みます。
- 酵母モデルはこれらの変化を研究するための費用対効果が高く、迅速な方法を提供します。
- ヒストン翻訳後修飾は遺伝子調節に重要な役割を果たします。
- これらの修飾を理解することで、新しい診断マーカーと治療標的につながる可能性があります。
研究の目的
- 神経変性疾患のエピジェネティック変化をマッピングすること。
- 診断のための潜在的なマーカーを特定すること。
- ヒストン修飾に関連する新しい治療標的を探索すること。
使用された方法
- モデル生物としてSaccharomyces cerevisiaeの利用。
- 修飾特異的抗体を使用したウェスタンブロッティング。
- ヒストンタンパク質の分離のためのSDS-PAGE。
- ウェスタンブロット装置のロードの視覚的デモンストレーション。
主な結果
- 神経変性疾患モデルに関連する特定のヒストンPTMの同定。
- エピジェネティック変化をマッピングする上での方法の有効性のデモンストレーション。
- ヒト線維芽細胞と誘導多能性幹細胞への適応の可能性。
- 実験プロセスへの学部生研究者の参加。
結論
- このプロトコルは神経変性疾患のエピジェネティック修飾を研究するための貴重なツールを提供します。
- 結果は新しい診断と治療戦略の開発に貢献する可能性があります。
- 酵母モデルシステムは費用対効果の高い研究に有利です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables cost-effective, high-throughput investigation of histone post-translational modifications in yeast models of neurodegenerative proteinopathies, offering a scalable system for early epigenetic target validation. By linking chromatin alterations to disease-relevant overexpression models, it supports mechanistic de-risking and biomarker discovery in ALS and Parkinson's disease pathways. The approach accelerates preclinical epigenetics research while reducing reliance on expensive mammalian systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epigenetic mechanisms driving neurodegenerative phenotypes in yeast overexpression models.
- Operational Value: Provides a rapid, inexpensive system for functional target validation of histone-modifying enzymes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, modification-specific readouts via Western blot for epigenetic screening campaigns.
- Operational Value: Standardizes histone extraction and detection workflows for reproducible, scalable assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by enabling parallel analysis in human fibroblasts and iPSCs using adapted protocols.
- Operational Value: Facilitates cross-model comparison of epigenetic changes to strengthen preclinical target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in yeast before advancing to mammalian validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven screening of histone PTM alterations linked to TDP-43, FUS, and alpha-synuclein pathology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative histone modification data suitable for epigenetic compound screening.
- Analytics: Provides antibody-based, chemiluminescent or fluorescent readouts for comparing modification states across conditions.
- Translational Research: Supports continuity to human-relevant systems through protocol adaptation for fibroblasts and iPSCs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable epigenetic profiling platform for multiple neurodegenerative disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by connecting histone modifications to neurodegenerative phenotypes.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility in epigenetic analysis across labs and models.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection through early epigenetic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on modification-disease correlations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast culture, genetic manipulation, and Western blot techniques.
- Dependent on modification-specific antibodies and electrophoresis/blotting instrumentation.
- Necessitates standardization of cell OD600 for accurate cross-sample comparison.
- Involves adaptation considerations when translating from yeast to human cell systems.
- Includes practical limitations such as antibody specificity and semi-quantitative nature of Western blot detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:00
Neurodegenerative Proteinopathy-associated Protein Overexpression in S. cerevisiae
3:02
Cell Lysis and Protein Transfer
5:28
Histone Post-translational Modification Detection
6:52
Results: Representative Effects of Yeast Protein Overexpression on Histone Expression and Modification
8:03
Conclusion
