Name: 取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学ぶ機能性ナノボディーを用いたトランスゴルジネットワークへの逆行性輸送の解析法。HeLa細胞を用いた生化学的手法で膜動態と細胞内タンパク質輸送メカニズムを解明し、細胞生物学研究に応用する。

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この作品は、スイスの全米科学財団による助成金 31003A 162643 によって支えられました。ニコール Beuret とサポート Biozentrum イメージング コア施設 (IMCF) に感謝します

著者が明らかに何もありません。

Nanobodies は、従来の抗体に比べて多くの利点を持つタンパク質バインダー足場の新たなクラスを表す: 彼らは小さく、安定した、単量体、高親和性と不足のジスルフィド結合33,35,のために選択できます。44,45細胞培養システムと生物発生生物学46,47,48,49, 結晶化として引率するよう、多くのアプリケーションで使用。阻害剤や酵素54,55、活動変調器として構造生物学<sup class="xr...

タンパク質や細胞表面からさまざまな細胞内コンパートメントに脂質の逆行のトラフィックは分泌を相殺して前向性輸送機械1のコンポーネントを再利用する膜の恒常性の維持のために重要,2内面化クラスリン依存または独立したエンドサイトーシスを介して、以下貨物蛋白質と脂質を設定初期エンドソームからさらには細胞膜にリサイクル、遠藤ライソゾーム システムに沿っていずれかをリダイレクト。または、トランスゴルジ ネットワーク (TGN) にターゲットを絞った。前向性膜貫通貨物受容体、カチオン依存性および陽イオンに依存しないマンノース-6-リン酸受容体 (CDMPR ・ CIMPR) などの多数の機能サイクルの一部である、TGN にエンドソームや細胞表面からリサイクルを提供します。後期エンドソーム、リソソーム3,4、5ソーティリンと SorLA6、7トランスゴルジ (WLS) 細胞表面に Wnt リガンドを輸送、TGN からライソゾーム加水分解酵素を合成しました。8,9,10,11.、TGN に戻るを取得する他の蛋白質は TGN46 とその関連アイソ フォーム12,13,14スネア (可溶性Nエチルマレイミド感受性融合因子添付ファイル受容体)15,16,17、アミロイド前駆体タンパク質 (APP)18,19、進歩的な強直 (アンク) 蛋白質20、金属トランスポーター ATP7A/B または DMT121,22, などと膜貫通酵素カルボキシペプチダーゼ D、風鈴 BACE123,24,25などを処理します。これらの内因性のタンパク質から離れて細菌植物毒素 (例えば、滋賀とコレラ毒素、リシン、アブリン) ハイジャックに細胞質26,27、retrotranslocation の小胞体に到達する逆行輸送機械 28,29。
逆行性のトラフィックを直接分析するために以前にラベルを貨物蛋白質を細胞表層から細胞内コンパートメント30に従ってください生物学: ナノボディでベースのツールキットを開発しました。Nanobodies は、タンパク質バインダー量重鎖だけ抗体 (hcAbs) ラクダ科動物、軟骨魚類の31,32で発生する自然由来の新しいファミリを表します。HcAbs の変数の重鎖のドメイン (VHH) を構成し、従来の抗体 (Igg など) に比べて多くの利点がある: 彼らは単量体、小さな (~ 15 kDa)、非常に溶ける、二硫化物結束を欠いている細菌によって表される、選択することができます高親和性結合33,34,35,36。私たちの生物学: ナノボディでツールをするためには、汎用性と広く適用/内腔細胞外ドメインに GFP が付いた表面ラベルとトラックのタンパク質機能抗 GFP nanobodies を採用しました。(APEX2) アスコルビン酸ペルオキシダーゼ 2 mCherry と nanobodies の機能化によって真正な貨物の膜貫通タンパク質の37、またはチロシン硫酸化 (TS) シーケンスの逆行輸送どちらか固定で分析することができますなど、ライブセル イメージングで電子顕微鏡検査、または生化学的。チロシン硫酸化チロシン硫酸化硫酸転移酵素 (TPST1 および TPST2) で媒介はトランス Golgi に制限修飾 TGN、直接勉強できるトランスポートおよびこれに細胞表層の興味の蛋白質の動態/細胞ゴルジ区画38,39,40。
この方法の記事で哺乳類セル30における逆行性輸送を分析するアプリケーションの数に適した機能性 nanobodies (VHH 2xTS、- APEX2、- mCherry 誘導体) の生産の容易さについて述べる。我々 は主に硫酸化のコンパートメントに細胞表層から細胞内トラフィックの分析のための TS サイト変更生物学: ナノボディでの使用に焦点を当てます。

<table><tbody><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>製品はSigma-Aldrich社が販売していますが、Roche</td></tr>社製 <tr><td>抗His6抗体</td><td>Bethyl Laboratories</td>社<td>製 A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>抗アクチン抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギHRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスHRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>1x PBS/1%BSA</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>Applichem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>D-ビオチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td> を<td>滅菌 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td></tr><tr><td>5-アミノレブイニル酸 (dALA) に溶解無</td><td>菌水に溶解した</td>塩酸塩<td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A3785</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td>を<td>滅菌水に溶解</td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td>18037059001 製品はシグマ・アルドリッチ社が販売していますが、ロシュ</td></tr>・<tr><td>ブレフェルディンA社(BFA)</td>が製造していますシ<td>グマ・アルドリッチ</td><td>B5936</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>・インビボゲン</td><td>・アリ-PR-1</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>バイオコンセプト</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco '修正されたイーグル」</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfur-35 as sodium sulfate</td><td>Hartmann Analytics</td><td>ARS0105</td><td>Product contains 5 mCi</td></tr><tr><td>Earle's balanced salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6267</td><td></td></tr><tr><td>MEM amino acids (50x) solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>MEMビタミン溶液 (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>製品は Sigma-Aldrich によって配布されていますが、Roche</td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td> <td>Applichem</td><td>A1008</td> 滅菌<td>水に溶解し、ストックは 1 M</td></tr><tr><td>カルベニシリン二ナトリウム塩</td><td>Applichem</td><td>A1491 です</td><td>滅菌水に溶解し、ストックは100 mg / mL</td></tr>の<tr><td>カナマイシン硫酸</td><td>Applichem</td><td>A1493</td>を<td>滅菌水に溶解し、ストックは100 mg / mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R(ブリリアントブルー)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Applichem</td><td>A3813</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>サザンバイオテック</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Niセファロース高性能</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>彼のGraviTrapカラム</td><td>GEヘルスケア</td><td>GE11-0033-99</td><td></td></tr><tr><td>彼の緩衝キット</td><td>GE</td><td>ヘルスケア GE11-0034-00</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てPD10脱塩カラム</td><td>GE</td><td>ヘルスケアGE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアンTGXゲル、4-20%、15ウェル</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'S リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ディッシュ</td><td>ファルコン</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル プレート</td><td>TPP</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>ガラス カバースリップ (No. 1.5H)</td> <td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニル フッ化物 (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>40% DMSO 60% イソプロパノールに溶解、500 mM</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>滅菌水に溶解、ストックは 1 M</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>滅菌水に溶解、ストックは 1 M</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルクミリポア</td><td>106404</td><td>滅菌水に溶解、ストックは5 M</td></tr></tbody></table>

取り込みと培養細胞における機能性 nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

タンパク質とゴルジ体内外細胞表面膜の輸送は、恒常性、細胞小器官アイデンティティおよび生理学に不可欠です。逆行性プロテイン トラフィックを研究、細胞表面から固定しライブの細胞イメージング、電子顕微鏡検査、または生化学的、ゴルジ複合体への輸送を分析するための多彩な生物学: ナノボディでベースのツールキットを最近開発しました。我々 設計機能抗緑の蛍光蛋白質 (GFP) nanobodies-小さな、単量体、高親和性タンパク質バインダー-細胞外の GFP 部分と利子の膜蛋白質を表現する細胞へ適用することができます。GFP レポーターにバインドし誘導体化 nanobodies 具体的に内在化されているし、記者の並べ替えルートに沿ってピギーバック輸送。Nanobodies 蛍光顕微鏡による逆行性輸送に従うとライブ イメージング、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ 2 電子記者生物学: ナノボディで複合体の電顕的局在を調べる (APEX2) fluorophores が付いている修飾されました。顕微鏡とトランスゴルジ ネットワーク (TGN) 到着の動態を評価するためにチロシン硫酸化 (TS) をモチーフにしました。この方法論の記事で細菌によって表現し、機能性 nanobodies を浄化する一般的な手順の概要を説明します。取り込みや TGN 到着貨物蛋白質を分析する mCherry と TS 変更 nanobodies を使用して私たちのツールの強力な使用をについて説明します。

様々 な細胞内の目的地への逆行性蛋白輸送を調べるためには、ラベルを付けると、セル表面30から組換え融合蛋白質に従ってください抗 GFP 生物学: ナノボディでベースのツールを開設します。ここでは、このような細菌の生産 nanobodies 誘導体し、硫酸化解析による TGN 到着を調査する彼らの使用と同様、蛍光顕微鏡と免疫ブロット、取り込みを研究への応用を実証を示します。後者のアプリケーションは、このプロトコルの方法論の対象です。
我々 は標準的な分子クローニング30によって共通の機能と異なる機能性抗 GFP nanobodies のツールボックスを生成しています。私たち最も単純な (標準) 生物学: ナノボディで、VHH std、特異抗体、c 末端 hexahistidine (His6) による VHH ドメイン、T7 およびそれ以降の検出のための HA...

ゴルジ体細胞表面からタンパク質の逆行輸送は膜の恒常性を維持するために不可欠です。ここでは、HeLa 細胞における機能性 nanobodies を用いた組換えタンパク質の細胞表面にゴルジ体輸送を生化学的解析法について述べる。

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

この方法により、細菌発現、機能化されたナノボディの生産と応用が可能になり、細胞表面から細胞間区画への逆行タンパク質輸送を解析することができます。特にトランスゴルジネットワーク。この技術の主な利点は、硫酸化の使用である。DTNコンパートメントでのレポーターナノボディ複合体の到着を評価するための、高度に特異的で、区分化された、敏感な翻訳後の変更。この方法は、生命細胞イメージングおよび電子顕微鏡のための他の誘導体ナノボディと組み合わせて、疾患関連細胞表面受容体のエンドサイトプロセスを研究するためにも使用することができる。機能化されたナノボディのレパートリーは、培養細胞における逆行輸送を研究するために設計されています。しかし、これらのツールは多細胞生物にも適用され得る。この手順を開始するには、プレートから目的のベクターを含む細菌コロニーを選び、抗生物質を添加したLB培地20ミリリットルを含むフラスコを接種する。37で一晩インキュベート

analysis-endocytic-uptake-retrograde-transport-to-trans-golgi-network

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオは、官能基化されたナノボディの取り込みと逆行性輸送を研究し、その細胞内輸送経路を理解する方法を示しています。放射性標識硫酸塩を導入し、単離および検出技術を利用することにより、この方法は、カーゴタンパク質のエンドサイトーシス取り込みとトランスゴルジネットワークの到着の研究を可能にします。...

官能基化ナノボディを用いたトランスゴルジ体ネットワークへのGFPタグ付き表面タンパク質の到着のモニタリング

膜輸送は、細胞膜から細胞内部へのタンパク質の輸送(すなわち、エンドサイトーシス)を含み、その後、分解のためにリソソームに輸送するか、またはリサイクルのために細胞膜に輸送します。この記事で説明する方法は、細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するように設計されています。...

セルベースの​​L-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

我々は、細胞外のエピトープに特異的なポリクローナル抗体を用いてニューロンを生体の表面上のタンパク質を標識するための方法を記載している。タンパク質、細胞表面上の抗体によって結合され、その後、エンドサイトーシスを介して内在化は、上の残りのタンパク質から区別、又はインキュベーション中に表面に輸送することができる。...

ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

この記事では、合成とナノ粒子（NPS）の蛍光標識するための方法を説明します。 NPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために、パルスチェイス実験に適用した。細胞内病原体サルモネラ·エンテリカの活動によって、エンド-リソソームシステムの操作は、ライブセルイメージングが続き、定量化した。...

細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。...

Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。...

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

この報告では、原形質膜で発現されるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を決定するために設計された2つのビオチン化に基づく方法を提示する。...

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

子宮内膜のリサイクルは、内膜管状ネットワークの一部です。ここでは、GFP-STX13をオルガネラマーカーとして使用して、エンドーソームのリサイクルのダイナミクスを定量化する方法を紹介します。...

SNARE人身売買を用いた循環型の内視鏡分析法

原形質膜からトランスゴルジネットワークへのタンパク質のエンドサイトーシスおよび逆行性輸送は、膜恒常性を維持し、シグナル伝達を調節するために不可欠です。ここでは、HeLa細胞における誘導体化抗GFPナノボディを用いた生細胞顕微鏡による膜貫通カーゴタンパク質のエンドサイトーシス輸送を画像化し、定量する方法を記述します。...

培養細胞における官能化ナノボディを用いたエンドサイトーシス輸送の生細胞イメージング

学ぶ機能性ナノボディーを用いたトランスゴルジネットワークへの逆行性輸送の解析法。HeLa細胞を用いた生化学的手法で膜動態と細胞内タンパク質輸送メカニズムを解明し、細胞生物学研究に応用する。

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジネットワークへの逆行性輸送の解析

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