Name: ポスト染色法によるポリアクリルアミドゲル中のマンゴータグRNAの蛍光可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 学ぶポスト染色法によるポリアクリルアミドゲル中のMangoタグRNA蛍光可視化。TO1-Biotinを用いた迅速かつ高感度なRNAイメージング手法で、生体学的に重要なRNAとRNA複合体の追跡と精製を簡便化します。

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著者らは、ラズヴァン・コジョカルとアミール・アブドラザデの技術支援とレナ・ドルゴシーナに原稿を校正してくれたことに感謝している。このプロジェクトの資金は、カナダ自然科学工学研究協議会(NSERC)がP.J.Uに対する運営助成金によって提供されました。

<ol><li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore%3A+A+Bright%2C+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li>
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<li>Trachman, R. J. III, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).</li>
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<li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li>
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<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from:
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<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol%3AChloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).</li>
<li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain%3A+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li>
</ol>

マンゴーフルオロゲン系に関する特許が出願中です。

マンゴー蛍光タグの大きな利点は、1つのタグが複数の方法で使用できることです。これらのアプタマーの高輝度と親和性は、細胞可視化2だけでなく、インビトロRNAまたはRNP精製4にも有用です。従って、ゲルイメージ投射はマンゴーのタグの多様性を簡単な方法で拡張する。マンゴーゲルイメージング感度は、ノーザンブロット14のそれよりもわずかに小さいですが、長くて退屈な膜移動およびプローブステップを必要とせずに、RNAサンプルの60-120 fmolを簡単に検出できます。これは、ゲル15の小さなRNAに対して以前に見つかったハイブリダイゼーションベースのプローブ効率に匹敵します。他の蛍光性アプタマー法論(特にRNAほうれん草)は、より大きな感度と特異性を有するが、現在、マンゴーアプタマー系の高輝度と親和性を同時に持つものは存在しない。細胞イメージング、RNP精製、および現在ゲルイメージングに使用されます。
<...

マンゴーは、チアゾールオレンジ(TO1-Biotin、図1A)1、2、3の単純な誘導体に密結合する4つの小さな蛍光RNAアプタマーのセットからなるRNAタグ付けシステムです。.結合すると、このリガンドの蛍光は、特定のアプタマーに応じて1,000〜4,000倍に増加する。マンゴーIIIの高輝度は、強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を超えるマンゴー系の高輝度と、RNAマンゴーアプタマーのナノモル結合親和性と組み合わせることで、RNAのイメージングと精製の両方に使用することができます。複合体2,4.
マンゴーI5、II6、およびIII7のX線構造は高分解能に決定されており、3つのアプタマーはすべてRNA四分円を利用してTO1-Biotin(図1B-D)を結合する。すべての3つのアプタマーの密集した中心は密集したアダプターのモチーフによって外的なRNA配列から隔離される。マンゴーIとIIは、柔軟なGNRAのようなループアダプタを使用して、マンゴーコアを任意のRNAデュプレックスに接続します(図1B,C)。対照的に、マンゴーIIIは、そのコアを任意のRNAらせん(図1D、紫色の残渣)に接続するために剛性トリプレックスモチーフを使用していますが、マンゴーIVの構造は現在知られていません。これらのアプタマーのリガンド結合コアは、これらのヘリカルアダプターによって外部RNA配列から分離されるので、それらはすべて単に様々なRNAに組み込むことができる可能性が高い。細菌6S調節RNA(マンゴーI)、酵母スプリセオソーム(マンゴーI)の成分、およびヒト5S RNA、U6 RNA、およびC/D scaRNA(マンゴーIIおよびIV)はすべて、この方法でうまくタグ付けされている2、8、多くであることを示唆している生物学的RNAは、RNAマンゴーアプタマー系を使用してタグ付けすることができます。
RNAの研究には、未生および天然ゲルが一般的に使用されます。転移ゲルは、RNAサイズまたはRNA処理を判断するためによく使用されますが、典型的には、北部のブロットの場合、例えば、画像を生成するためにいくつかの遅い、逐次的なステップを必要とします。RNAホウレンソウやブロッコリーなどの他のRNAフルオロゲンアプタマーはゲルイメージング9に成功していますが、これまでフルオロゲンアプタマー系はマンゴー系の高輝度と親和性を持たないため、かなりの関心を持っています。マンゴーのゲルイメージング能力を調べるために。本研究では、TO1-Biotin(それぞれ510nmおよび535nm)の励起波長がほとんどの蛍光に共通するeGFPチャネルでのイメージングに適しているので、RNAマンゴーシステムを単にゲルイメージングに拡張できるかどうか疑問に思いました。ゲルスキャンの器械使用。
ここで提示されるポストゲル染色プロトコルは、マンゴータグ付きRNA分子をネイティブおよび脱帰性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルで特異的に検出する迅速な方法を提供します。この染色方法は、カリウムおよびTO1-Biotinを含む緩衝液にゲルを浸すことを含む。RNAマンゴーアプタマーはG-四重化基基であり、カリウムはそのような構造を安定化するために必要とされる。最小限のマンゴーコードDNAテンプレートから転写されたRNA(プロトコルセクションを参照)を使用して、単純な染色プロトコルを使用して、ネイティブゲル中のRNAの62.5 fmolと脱変性ゲル中のRNAの125 fmolをわずかしか検出できません。一般的な非特異的核酸染色とは対照的に(材料の表を参照)、サンプル中にタグ付けされていない全高濃度のRNAが存在する場合でも、マンゴータグ付きRNAを明確に同定することができます。

<table><tbody><tr><td>0.8mm 厚 コーム 14 ウェル 30 mL PAGE ゲル用</td><td>LabRepCo</td><td>11956042</td><td></td></tr><tr><td>101-1000 &micro;L&nbsp;tips</td><td>フィッシャー</td><td>02-707-511</td><td></td></tr><tr><td>20-200 & マイクロ;L 低保持&nbsp;ヒント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-717-143</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド:N,N'-メチレンビスアクリルアミド (40% 19:1)</td><td>バイオ試薬</td><td>BP1406-1</td><td>急性毒性</td></tr><tr><td>アクリルアミド:N,N'-メチレンビスアクリルアミド (40% 29:1)</td><td>フィッシャー</td><td>BP1408-1</td><td>急性毒性</td></tr><tr><td>寒天</td><td>Anachemia</td><td>02116-380</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウム裏打ち TLC プレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>1164840001</tr><tr><td>アマシャム イメージャー 600</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Biorad</td><td>161-0700</td><td>有害な</td></tr><tr><td>BL21 細胞</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>ACP</td><td>B-2940</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノール ブルー ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>B8026-25G</td><td></td></tr><tr><td>クロロフォーム</td><td>ACP</td><td>C3300</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td>アルコール<td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩</td><td>ACP</td><td>E-4320</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>商業&nbsp;</td><td></td><td></td>P016EAAN</tr><tr><td>フラットジェルローディングのヒント</td><td>Costar</td><td>CS004854</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11076</td><td></td></tr><tr><td>スペーサーとコームを備えたゲル装置</td><td>LabRepCo</td><td>41077017</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック蓋付きガラス皿</td><td>パイレックス</td><td>1122963</td><td>ゲルピースに合うのに十分な大きさである必要があります</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Anachemia</td><td>43567-540</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Anachemia</td><td>464140468</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuanTL</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>29000605</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ACP</td><td>P-2940</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Caledron</td><td>4903-01</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ACP</td><td>S-2830</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BDH</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Rotator</td><td>Lab-Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>ラウンド ゲル ローディングのヒント</td><td>Costar</td><td>CS004853</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>カレドロン</td><td>8120-1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>カレドロン</td><td>8180-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBRGold</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAポリメラーゼ</td><td>ABM</td><td>E041</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7024-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>TO1-3PEG-ビオチンフルオロフォア</td><td>ABM</td><td>G955</td><td></td></tr>トリ<tr><td>スベース</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP152-500</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プトン</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Σ</td><td>P9496-100</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>フィッシャー</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>キシレン シアノール</td><td>Σ</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>バイオショップ</td><td>YEX401.500</td><td></td></tr></tbody></table>

ポスト染色法によるポリアクリルアミドゲル中のマンゴータグrnaの蛍光可視化

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

天然および変性ポリアクリルアミドゲルは、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体移動性を特徴付け、それぞれRNAサイズを測定するために日常的に使用されます。多くのゲルイメージング技術は、非特異的な染色や高価な蛍光色素プローブを使用するため、敏感、判別、および経済的なゲルイメージング方法論が非常に望ましい。RNAマンゴーコア配列は、任意のRNAステムによって閉じた場合、単にかつ安価に目的とするRNAに付加することができる小さな(19-22 nt)配列モチーフである。これらのマンゴータグは、TO1-Biotinと呼ばれるチアゾールオレンジ蛍光リガンドに高い親和性と特異性を結合し、結合時に数千倍の蛍光になります。ここで、マンゴーI、II、III、およびIVは、高感度のゲル中のRNAを特異的に画像化するために使用できることを示す。天然ゲル中のRNAの62.5 fmolと、入型ゲル中のRNAの125 fmolは、カリウムを含む画像バッファーにゲルを浸漬し、20nM TO1-Biotinを30分間検出することができる。マンゴータグ付き6S細菌RNAを、全細菌RNAの複雑な混合物のコンテキストでイメージングすることにより、マンゴータグ付きシステムの特異性を実証する。

短いマンゴータグ付きRNAは、プロトコルセクションで説明されているように調製されました。ゲル中の尿素の存在により、回帰条件での蛍光が最も観察しにくいと仮定し、まず核酸の脱窒剤として作用する尿素に対するマンゴーアプタマーの耐性を検討した。マンゴーアプタマーは、約1M(図2A)の尿素濃度までの脱彩に対して実質的に耐性があることがわかった。経常ゲルにゲル染色液を添加する前に、ゲル中の尿素の最終濃度は6Mであるこの濃度を1Mに減少させる十分な染色液を加えることは、したがって、4つのアプタマーすべてに対して完全なマンゴー蛍光を確保するのに最適であろう。実際には、染色プロトコルは、この完全に最適な結果よりも少ない達成したが、これは単に、より多くの染色溶液を使用するか、染色中に一度溶液を変更する単純な便宜によって、必要に応じて修正することができる。
マンゴータグ付きRNA構築物が変性ゲルに実行されると、染色時間は、3つの異なるマンゴ...

ここでは、RNAマンゴーアプタマーI、II、III、またはIVでタグ付けされたRNAを画像化する敏感で迅速かつ判別的なポストゲル染色法を、天然または未消化ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルを用いて提示する。標準的なPAGEゲルを実行した後、マンゴータグ付きRNAはTO1-Biotinで容易に染色し、一般的に利用可能な蛍光リーダーを使用して分析することができます。

ポスト染色法によるポリアクリルアミドゲル中のマンゴータグRNAの蛍光可視化

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

ここで示す Mango タグ付きゲルイメージング方法論は堅牢であり、感度と特異性の点で簡単に拡張できることが期待されています。これは、目的のRNAにマンゴータグを追加するという単純な便宜によって、生物学的に重要なRNAおよびRNA複合体の日常的な精製をさらに簡素化するであろう。RNAは、このポストデート法のためにますます多くの病気に関与しており、RNAを追跡し、視覚化するための簡単かつ迅速な方法です。ゲルは壊れやすく、壊れやすいので、ゲルをある場所から別の場所に移す際には、特別な注意が必要です。30ミリリットル変性ゲルを調製するために、まず適当なブロモフェノールブルーでポリアクリルアミドの割合を選択し、キシレンシアノール染料を高帯域分離を保証するために目的のRNAと比較して。次に、表 1 に従ってソリューション A、B、および C を混合し、APS と timud を追加します。すぐに適切なゲル鋳造装置にゲル溶液を注ぎます。目的のコーンを挿入し、ゲルをポリメラーゼに約30分間放置します。1 XTBE溶液を使用してゲルタンクを作り、慎重にコーンを取り外します。ゲルを慎重に持ち上げてゲル装置に取り付け、バインダークリップを使用して固定します。注射器を使用して、サンプルローディングの直前に井戸を吸引する。目的のRNAサンプルに2X変性ゲルローディング溶液を添加して1X RNAサンプルを調製します。サーモサイクラーを使用して、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。次に、ゲルローディングチップを使用して冷却したサンプルを各ウェルの底部にロードします。そして、ゲルを室温で良好にし、ゲル装置のガラス板を割らないで電力が効果的に低い。ゲルに快適にフィットできるほど広いきれいなガラス容器に原稿に従って1Xゲル染色液を調製します。十分な1倍のゲル染色液を容器に加えて、周回回転器に置いたときにゲルが溶液で完全に覆われるようにします。ゲルの実行が終了したら、ゲルを装置から取り出し、そのウェルとゲルの角を切り落とし、向きを決定します。次に、ゲルを1Xゲル染色液に慎重に移します。イメージングを行うために、染色液を慎重にデカントし、ゲルを水で素早くすすいすます。最後に、慎重にイメージャーに置かれるトレイにゲルを移します。閉じ込められた気泡と余分な液体を除去するためにゲルの上にガラスピペットを転がします。そしてゲル画像の撮影に進みます。マンゴーアプタマー1、2、3、4は、ほぼ1モル尿素濃度までの変性に実質的に抵抗した。20〜40分の染色時間は、最大ゲル蛍光に十分であった。より長い時間は、ゲルから拡散し始めたため、この研究で使用される小さなRNAには適していなかった。フルオロメーター分析は、尿素の存在下でマンゴーアプタマー1、2、および3がアプタマー4よりも速く折り畳むことができることを示した。尿素の不在時には、折り畳みは予想通りはるかに速かった。ポスト染色法の感度は、後者のゲルに対する感度がわずかに少ないネイティブおよび変性ゲルのマンゴーバリアントのそれぞれについて、よく折りたたまれたRNAに対応する単一のバンドによって示された。ネイティブゲルの定量化は、マンゴー1、2、および4がマンゴー3よりも直線的に振る舞う約1桁の程度の程度の丸直性であった。変性ゲルの定量化は、変性ゲル中の尿素の存在がTO1ビオチン染色溶液に入れられた後、アプタマーを折り畳むより均質な方法を提供するかもしれないことを示唆するより直線的であった。マンゴータグ付きRNAは、SG染色と比較してTO1ビオチン染色を使用して全RNAの存在下で検出することができる。ゲル染色容器がゲルに合うほどの大きさであることを確認してください。RNAサンプルは、ある場所から別の場所に移動します。変性ゲルと同様に、この方法は、天然ゲルに対して行うことができる。ネイティブ条件を維持するために、低ワット数の冷たい部屋でゲルを実行します。

fluorescent-visualization-mango-tagged-rna-polyacrylamide-gels-via

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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