マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色
2019年5月10日
ここでは、マウス頭蓋組織を例に免疫染色することにより、頭蓋顔面形態/病因の間のタンパク質レベルを検出し、定量するための詳細なプロトコルを提示する。また、免疫染色のための若いマウスからの非デカル化された硬質組織の調製および凍結切除の方法について説明する。
ここでは、切片切り材料上のタンパク質に対する蛍光免疫検出のための簡単なプロトコルを紹介します。この方法は、抗原の検索を必要としません。難組織を含むマウスヘッドを使用します。
この技術の主な利点は、硬い組織の抗原の検索および脱灰をスキップすることです。それらは免疫染色結果の良質につながる。この方法はまた時間および労働両方を節約する。
この方法は、適切な修正を伴う他の組織にも適用可能である。解剖されていない組織から素敵な切片を作るために、ターゲット組織をさらに解剖して周囲の組織をトリミングし、必要に応じて凍結保護の前に2日間摂氏4度で10%EDTAでサンプルを処理します。この方法の手順について、視覚的なデモンストレーションで詳細かつ明確な説明を提供します。
まず、PBSを含む10センチメートルといくつかの3.5センチメートルの皿と、各妊娠中のマウスの各井戸にPBSに4%PFAの2ミリリットルを含む1つの12ウェル培養プレートを準備し、それらをすべて氷の上に置きます。妊娠中のマウスから胚を解剖するには、安楽死させたマウスの腹の中心下の皮膚を鉗子でつかみ、皮膚のみを切断し、皮膚を穏やかに引っ張って下の腹筋壁から分離する。皮膚切開の同じラインに続いて、腹腔内に切り込む。
胚の文字列を含む子宮を取り除きます。次に、子宮壁を優しく切断して胚を取り除き、黄身嚢や羊膜などの胚外組織を除去する。各胚から頭部を切断して分離し、鉗子で各頭部を4%PFAを含む12ウェルプレートの別々のウェルに移す。
摂氏4度で4時間インキュベートして固定します。12時間穏やかな揺れで4°CでPBSで頭をすすいでください。ヘッドを凍結保護するには、鉗子を使用して、PBSで30%スクロースの2ミリリットルを含む新しい12ウェルプレートに移します。
頭が皿の底に沈むまで摂氏4度で穏やかな攪拌でインキュベートします。凍結保護ヘッドを埋め込むには、最適な切断温度化合物を含む金型に移し、数分間平衡化します。鉗子を使用して、サンプルの位置と方向を調整して、サンプルのトリム側が埋め込み金型の底面に向かるようにします。
その後、乾燥氷の上にカビを置いて凍結し、凍結切断の準備ができるまでマイナス80度のビニール袋に入れて保管します。出生後組織の場合、安楽死させた3週間から3ヶ月のマウスの皮膚および脂肪組織を除去した後、頭部を切断して分離し、下顎を取り除く。その後、胚の頭部で行われたように頭を固定し、凍結します。
OCTの胚頭部と同様の方法で8%ゼラチンに埋め込み、クライオムドルを下切りまでマイナス80度のビニール袋に入れます。適切なクライオスタット温度を設定します。クライオスタットチャンバーにサンプルを約30分間置き、クライオスタット温度に平衡させます。
クリオマールからサンプルを取り外し、OCTドロップで試料チャックに取り付けて凍結し、サンプルのトリミングされた側をチャックから最も遠く離れ、オペレータに向かうことを確認します。ブロックマウントチャックをクライオスタットオブジェクトホルダーに積み込みます。ブレードの角度がサンプルに対して 3 ~ 5 度になるように、ブレード ホルダーを調整します。
コーティングされた顕微鏡のスライドに10マイクロメートルのセクションを集める。完全に乾燥するまで室温でセクションを残し、マイナス80度で保存します。染色から始めるには、マイナス80度からスライドを取り出し、室温で1時間保ち、セクションを空気乾燥させます。
0.1%PBSTでスライドを3回5分間洗い流し、OCTを洗い流し、セクションを透過させます。各スライドに200マイクロリットルのブロッキング溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。次に、スライドをすすかずにブロッキング溶液を取り除きます。
各スライドにブロッキング溶液で希釈した一次抗体の100マイクロリットルを加え、摂氏4度で一晩インキュベートする。スライドを室温で10分間3回、PBSで洗い上がってください。ブロッキング溶液に希釈した2次抗体の100マイクロリットルを加え、光から保護された室温で1時間インキュベートする。
PBSで室温でそれぞれ10分間3回リンスし、依然として光から保護する。スライドを取り付けるには、各スライドにDAPIを使用して2滴のアンチフェードメディアを追加し、カバースリップで覆い、イメージを作成できるまで摂氏4度で保存します。コントロール胚の前頭骨は、pSmad1/5/9、下流BMPシグナル伝達因子、および細胞増殖マーカーであるKi67に陽性であった。
神経堤特異的な、構成的に活性化されたBMPR1A変異胚では、しかしながら、ki67レベルが減少している間にpSmad1/5/9レベルが増加した。さらに、対照性胚の細胞よりも変異胚の前頭骨においてより多くのアポトーシス細胞が観察された。ゼラチン埋め込まれた頭部の冠状動脈は、鼻骨および鼻組織のtdTomatoカセットからのGFP信号およびRFP信号を明確に示し、ゼラチンが蛍光シグナルを妨げないことを示す。
これらの切片がSOX9またはオステルクスおよびE11/ポドプラニンに対して免疫染色された場合、3週間の硬い組織のほとんどから良質の切片が得られた。一方、3ヶ月前のサンプルでは、大腿骨、鼻組織、頭蓋骨の骨膜部分(鼻前顎縫合糸、頭部の周囲の骨を含む)を含む硬い組織の一部でのみ良質の切片が得られた。SOX9陽性細胞は、大腿骨および鼻中隔からの成長板および関節の軟骨細胞において特異的に検出された。
生後3週間の切歯では、間葉細胞でSOX9が検出された。オステリクスとE11の二重染色結果は、オステリクスが骨芽細胞で検出され、E11は大腿骨および頭部からの骨の骨細胞で検出されたことを示す。3週間の切歯では、オステリクスは歯根芽細胞で陽性であり、E11は卵胞間葉細胞で陽性であった。
4%PFAでサンプルをオーバーフィックスしないでください。ゼラチン中の固硬組織の除菌では、最高温度はマイナス25°C以下です。この手順に従って、蛍光レベルは、我々のプロトコルに記載されているように定量化することができる。
これらの測定値は、異なるグループ間のタンパク質の相対的なレベルの違いを示す有益なデータを提供します。その開発後、この技術は、異なるタンパク質の共発現パターンを得るための二重または三重染色のための道を開いた。4%PFA は危険です。
皮膚アレルギー、重篤な眼の損傷、臓器の損傷、または癌を引き起こす可能性があります。取扱い後は、個人用保護具を使用し、肌を十分に洗ってください。
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概要
この記事では、切片化されたマウスの頭蓋顔面組織におけるタンパク質の免疫蛍光検出のプロトコルを紹介します。この方法は、抗原回収と脱石灰の必要性を排除し、免疫染色プロセスを効率化します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 免疫学
背景
- 頭蓋顔面形態形成と病態形成は重要な研究分野です。
- タンパク質レベルを理解することで、発生過程への洞察が得られます。
- 従来の方法では、時間のかかる広範な準備が必要になることがあります。
- このプロトコルは、品質を維持しながらプロセスを簡素化することを目的としています。
研究目的
- 頭蓋顔面組織におけるタンパク質レベルを検出する信頼性の高い方法を提供すること。
- 免疫染色技術の効率性を向上させること。
- 頭蓋顔面の発達と関連疾患の研究を促進すること。
使用した方法
- 切片化されたマウスの頭蓋顔面組織における免疫蛍光検出。
- 未脱石灰硬組織の準備と凍結切片化。
- 抗原回収ステップの回避。
- タンパク質レベルを評価するための免疫染色技術の適用。
主な結果
- このプロトコルは、脱石灰の必要なしにタンパク質を検出することに成功しました。
- 免疫染色結果は高品質で再現性があります。
- この方法は従来の技術と比較して時間と労力を節約します。
- 頭蓋顔面形態形成の研究に有用なツールを提供します。
結論
- このプロトコルは、頭蓋顔面研究におけるタンパク質検出への効率的なアプローチを提供します。
- 免疫染色の効率性を向上させ、研究者にとってアクセスしやすいものにします。
- この方法は頭蓋顔面の発達の理解を深めることに貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables efficient protein detection in craniofacial tissues by eliminating antigen retrieval and decalcification steps, reducing time and labor in preclinical target validation workflows. It supports mechanistic de-risking by providing reliable spatial protein expression data in disease-relevant systems, facilitating go/no-go decisions in early discovery. The method enhances assay standardization and reproducibility for downstream screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific protein localization in craniofacial morphogenesis models.
- Operational Value: Reduces procedural complexity by avoiding antigen retrieval and decalcification, accelerating target validation timelines.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking via high-quality immunostaining of key markers like pSmad1/5/9 and Ki67 in BMP signaling pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized cryosections suitable for quantitative immunofluorescence screening of protein expression changes.
- Reproducibility: Enables consistent section quality from undecalcified hard tissues, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Scalability: Compatible with gelatin embedding for long-term storage and batch processing of tissue samples.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to craniofacial pathogenesis models, allowing assessment of protein expression alterations in mutant embryos.
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining antigen integrity without harsh treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables quantification of fluorescence levels to inform go/no-go decisions based on protein expression thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research, supporting hypothesis testing and pathway clarification in craniofacial biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by detecting spatial protein expression patterns in embryonic and postnatal tissues.
- Screening: Enables assay standardization through consistent cryosectioning and immunostaining of hard and soft tissues.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence readouts that allow comparison of protein levels across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving tissue morphology and antigenicity in undecalcified samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein detection across multiple tissue types with protocol adaptations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through reliable detection of proliferation and apoptosis markers.
- Operational Value: Improves standardization and reduces variability by eliminating antigen retrieval steps.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by decreasing hands-on time and accelerating data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative protein expression data for decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cryoprotection, and immunofluorescence techniques.
- Dependent on cryostat and fluorescence microscopy infrastructure for sectioning and imaging.
- Necessitates standardization of blocking, antibody incubation, and washing protocols across teams.
- Requires adaptation of embedding media (OCT vs. gelatin) based on tissue age and hardness.
- Limited by antibody specificity and quantification challenges noted in the source material.
