Name: マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶマウス頭蓋組織の非除電骨を用いた免疫蛍光検出法。抗原回復と脱灰を省略し、高品質な免疫染色を実現する効率的なプロトコルです。頭蓋顔面形態形成の研究に有用です。

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この研究は、国立衛生研究所(R01DE020843 to Y.M.)、国際FOP協会(Y.M.)、および中国国立自然科学財団(31500788からJ.Y.)からの助成金によって支援されました。

すべてのマウス実験は、ミシガン大学のガイドラインに従って、動物の人道的ケアと研究における動物の使用をカバーして行われました。この研究で使用されるすべての動物の手順は、ミシガン大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました(プロトコル#PRO00007715)。
1. 組織製剤
<ol><li>
胚組織の調製
	<ol>
<li>10cm皿1枚とリン酸緩衝生理食(PBS)を含む3.5cmの皿を1つと、妊娠マウスごとにPBSに2mL 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む12ウェル培養プレートを1つ用意します。すべてのペトリ皿とプレートを氷の上に置きます。 注:ヒュームフードで4%PFAを取り扱います。</li>
		<li>前述の14.14のように、妊娠中のマウスから鉗子とはさみで氷冷PBSで胚を解剖する。<ol>
<li>簡単に言えば、CO2で妊娠マウスを安楽死させ、鉗子で腹の中心の下の皮膚をつかみ、皮膚だけを切り取り、その後、腹部の筋肉壁の下からそれを分離するために皮膚を穏やかに引っ張る。</li>
			<li>次に、皮膚切開の同じラインに続いて腹腔に切り込む。胚の文字列を含む子宮を取り除き、子宮壁をそっと切り取って胚を取り除く。黄身嚢やアムニオンなどの胚外組織が除去されます。</li>
			<li>各胚から頭部を切断し、分離する。</li>
		</ol>
</li>
		<li>プラスチック転写ピペットまたは鉗子で4%のPFAを含む12ウェルプレートの各ウェルに各ヘッドを転送します。4°Cで4°CのPFAで4°Cのサンプルを4°Cで4°Cで洗浄し、4°Cで4°Cのサンプルを12時間の穏やかな振盪で固定します。 注:胚の日16.5(E16.5)より若い胚の場合は、単離直後に4%のPFAで胚頭を固定する。E16.5以降の胚の場合は、皮膚および脂肪組織を頭部から廃棄し、固定前に氷冷PBSで数回すすいで除去する。</li>
		<li>クライオプロテクトヘッド。<ol>
<li>プラスチック転写ピペットまたは鉗子を使用してPBSで30%ショ糖の2 mLを含む新しい12ウェルプレートに各ヘッドを転送します。頭が皿の底に沈むまで4°Cで穏やかに攪拌する。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ヘッドを埋め込む。<ol>
<li>凍結保護されたヘッドを最適な切断温度(OCT)化合物を含む金型に移します。OCTで数分間サンプルを平衡化します。鉗子でサンプルの位置と方向を調整します。</li>
			<li>ドライアイスの上に金型を置き、凍結させます。クライオセクションの準備ができるまで、-80°Cのビニール袋に得られたクライオモルドを保管してください。 注:サンプルのトリミングされた側は、埋め込み金型の底部に面している必要があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
出生後の非デカール化硬組織の調製
	<ol>
<li>CO2で3週間または3ヶ月齢のマウスで安楽死させる。皮膚と脂肪組織を取り除きます。頭や長い骨をマウスから切り取って分離します。</li>
		<li>ステップ1.1.3-1.1.4に記載されているように、マウスの頭部または長い骨を修正し、凍結保護する。</li>
		<li>ステップ1.1.5と同様の方法で8%ゼラチンに埋め込む。凍結切除まで-80°Cのビニール袋にクライモルドを保管してください。 注:ここではデカルシングは必要ありません。8%のゼラチンを調分するには、8gのゼラチンを100mLのPBSと混ぜ、電子レンジで沸騰させます。混合物は簡単に沸騰していることに注意してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. クライオ断面
<ol><li>クヨスタット温度を、OCTに埋め込まれた軟部組織の場合は-18 °C、ゼラチンに埋め込まれた非割り分けされた硬質組織の場合は-18 °C に設定します。クライオスタット温度に平衡化するために、約30分間クライオスタット室でサンプルを保持します。</li>
	<li>ブロックをクライモルドから追い出します。OCTドロップで取り付けによって試料チャック(ティッシュホルダー)にブロックを凍結します。サンプルのトリミングされた側面をチャックから最も遠く(オペレータに向かって)に保ちます。</li>
	<li>ブロックマウントチャックをクライオスタットオブジェクトホルダーにロードします。ブレードホルダーを調整して、ブレードの角度をサンプルに対して3°~5°にします。</li>
	<li>コーティングされた顕微鏡スライドに10 μmのセクションを集める。RTで完全に乾燥したセクションを、-80 °Cに保存します。</li>
</ol>3. 組織染色と顕微鏡イメージング
<ol><li>免疫蛍光染色
	<ol>
<li>-80 °Cからスライドを取り出します。RTで1時間のスライドをエアドライセクションに保管してください。0.1%PBST(PBSのポリエチレングリコールテルトオクチルフェニルエーテル、材料の表を参照)で0.1%のスライドを洗い流し、OCTを洗い流し、セクションを透過します。</li>
		<li>必要に応じて、抗原検索を実行する(オプション)。<ol>
<li>クエン酸バッファー(10mMクエン酸ナトリウムpH6)を蒸し器または水浴で95〜100°Cに染色皿に入れます。ク硝子バッファーにスライドを浸し、10分間インキュベートする。</li>
			<li>スチーマーや水風呂からRTに染色皿を取り出し、RTで20分以上15分のスライドを冷却します。 注:代替手段として、トリス-EDTAバッファー(10 mMトリスベース、1mM EDTA、0.05%ツイーエン20、pH 9.0)またはEDTAバッファー(1mM EDTA、0.05%トウェン20、pH 8.0)を熱誘発抗原回収に使用します。熱スチーマーに加えて、熱誘発抗原検索には圧力鍋、電子レンジ、または水浴を使用してください。トリプシンまたはペプシンを用いて酵素誘発抗原検索は別の選択肢である。有害なセクションを避けるために酵素検索の濃度と治療時間を最適化します。抗体/抗原の組み合わせごとに抗原検索方法を最適化します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>RTで200μLのブロッキング溶液(0.1%PBSTで希釈した5%)で各スライドをインキュベートし、すすりせずにブロッキング溶液を除去します。</li>
		<li>100 μLの一次抗体または抗体を100μLでインキュベートし、4°CでRTまたはO/Nで1時間のブロッキング溶液で希釈します。RTでそれぞれ10分間、PBSで3回スライドをすすいで下します。</li>
		<li>RTで1時間のブロッキング溶液中で希釈した二次抗体の100μLで各スライドを100μLでインキュベートし、RTでそれぞれ10分間PBSのリンススライドを3回、光からスライドを保護します。</li>
		<li>スライドをマウントします。<ol>
<li>スライド上にDAPI(4'、6-diamidino-2-フェニリンドール)を持つアンチフェード媒体の2滴を追加します。その後、カバースリップでカバーします。</li>
			<li>画像化する準備ができるまで、暗い4°Cで保存します。 注:代替として、最初にRTでPBSで1:2,000を希釈したDAPIまたはHoechst 33324色素で核を標識し、次にグリセロールでマウントする。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)染色。 注:3'-ヒドロキシルターミニニ(3'OH DNAテルミニ)を持つ二本鎖DNAは、細胞内のアポトーシス中に形成されます。ここでは、市販キットを用いて特異的染色によりジゴキシゲニン-ヌクレオチド(TdT)を用いてDNA断片を標識することにより、その中の自由な3'OH DNAターミニーニに標識するプロトコルを提供する(材料の表参照)。 ).<ol>
<li>必要に応じて、TUNEL染色の前に一次およびAlexa Fluor-488標識二次抗体を含む染色セクション。PBSのスライドをそれぞれ10分間3回すすいで下します。 注:このステップは、同じスライド内のタンパク質とTUNELの二重染色のために任意である。</li>
		<li>100 μL プロテインナーゼ K (10 mM トリス pH 7.5 および 5 mM EDTA で 10 μg/mL) で各スライドを RT で 10 分間 PBS を使用して 5 分間インキュベートします。 注:組織タイプごとにプロテインタネセKのインキュベーション時間と温度を調整します。4%PFAで固定された胚頭部の10 μmセクションについては、RTで5分間インキュベートする。プロテパラーゼKを使用する方法に加えて、(1)新鮮に調製された0.1%ポリエチレングリコールテルトオクチルフェニルエーテル、0.1%クエン酸ナトリウム、37°Cで10分を含む、必要に応じて代替治療を使用します。(2) HCl中0.25%~0.5%ペプシン(pH2)または0.25%トリプシン、37°Cで10分。(3)0.1Mクレートバッファー(pH6)を含むマイクロ波照射を行った。</li>
		<li>各スライドに200μLのブロッキング溶液(0.1%PBSTで希釈したロバ血清5%)を塗布し、RTで30分間インキュベートし、すすりせずにブロッキング溶液をタップします。</li>
		<li>キットが提供する平衡バッファの50 μLをRTの各スライドに少なくとも10s.すすせずにバッファをタップします。</li>
		<li>TdT酵素とキットが供給する反応バッファーを3:7の比で混合して反応混合物(作動強度TdT酵素)を調製する。各スライドに反応混合物の50 μLを適用し、37 °Cで1時間インキュベートし、すすせずにバッファーをタップします。</li>
		<li>キットが提供するストップバッファの200 μL(ddH2 Oで1:30希釈)を各スライドに塗布し、RTで10分間リンススライドを10分間インキュベートし、それぞれ10分間PBSで3回インキュベートします。</li>
		<li>ロダミン抗体を用いた標識。<ol>
<li>各スライドに50 μLの予め温められた(RT)抗ジゴキシゲニンコンジュゲート(ロダミン)(ブロッキング溶液で1:1希釈)を適用します。暗闇の中で30分間RTでインキュベートします。</li>
			<li>PBSでスライドを10分間3回ずつすすいで下します。スライドをステップ 3.1.6 としてマウントします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>4. イメージング取得
<ol><li>陽性コントロール(標的抗原に対して陽性の組織)を使用して、シグナル標識および陰性コントロール(一次抗体、アイソタイプコントロール、または標的抗原に対して陰性の組織を省略)をチェックし、蛍光下の画像の背景を評価する。顕微鏡。</li>
	<li>ネガティブコントロールとポジティブコントロールの信号強度に基づいて、イメージング用の機器とカメラの状態(露出やその他の一般的な設定)を設定します。 注:これらの条件は、(1)イメージングに使用されるカメラと顕微鏡、(2)抗体、および(3)各実験の組織によって異なります。頭蓋組織に使用される一般的な条件は、抗体の品質および特異性に依存する1/100 sから1sまでの露光時間を持つISO 200である。適切な倍率は、サンプルのサイズと実験の目的によって異なります。</li>
	<li>従来のエピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像を取得します。各カラーチャンネルの同じ条件で画像(対応するコントロールを含む)を取得します。同じ形式の画像を保存します (tiff は情報を保持するのに最適です)。</li>
</ol>5. 蛍光定量
注:異なるグループ間の染色を統計的に比較することは、多くの場合、より有益になります。免疫蛍光画像を用いて、シグナル密度を測定し、陽性細胞を数えたり、陽性領域を計算したりして、タンパク質の相対レベルを定量化する。統計分析の場合、生物学的に独立したサンプルの最小数は 3 です。一般的な方法は、各サンプルから少なくとも 3 つのセクションを生成し、各セクションの少なくとも 3 つの代表的な領域の画像を撮影することです。
<ol><li>
ImageJを用いた蛍光強度の定量
	<ol>
<li>ソフトウェアを開き、[解析]> [測定値の設定] を使用して、エリアと集積密度のみが選択されていることを確認します。ファイル>を使用して、分析する画像を開きます。</li>
		<li>ツールバーを使用して、左端の正方形または円のアイコンを選択します。選択ツールを使用して、画像上で解析する領域を選択します。[分析];[測定]を使用して、[結果]ウィンドウで選択した領域と統合密度の読み出しを取得します。背景を読み取るために蛍光のない正のセルの横の領域を選択します。</li>
		<li>手順 5.1.2 を繰り返して、他の画像を分析します。分析する領域を最初の画像の領域と一致するように調整しました。</li>
		<li>[結果] ウィンドウのすべてのデータをコピーし、分析が完了したらスプレッドシートに貼り付けます。</li>
		<li>補正された蛍光強度(CTCF)を統合密度として計算する — (選択した細胞の面積 x バックグラウンド測定値の平均蛍光値)サンプル間の補正された全細胞蛍光の差を比較し、グラフを作成します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ImageJを用いた蛍光画像の陽性細胞数の定量化
	<ol>
<li>手動セルカウント。<ol>
<li>ImageJ > プラグイン >分析を使用して、セルカウンタプラグインをインストールします。</li>
			<li>ファイル>を使用して、分析する画像を開きます。プラグイン>分析>セル カウンタを使用して、カウンタ ウィンドウと結果ウィンドウを開きます。 注:セル カウンタはスタックでは機能しません。スタックをカウントする場合は、プラグインプロット Z 軸プロファイルを使用し、イメージ>スタック> プロットZ 軸プロファイルを使用して、パーティクル トラッキング ツールを使用して移動する ROI の強度を監視します。このツールは、手動または自動のいずれかです。</li>
			<li>[カウンター] ウィンドウの下部にあるボタンのいずれかをクリックしてカウントを開始します。終了までカウントするセル/オブジェクトを直接クリックします。</li>
			<li>[カウント]ウィンドウの [結果]ボタンをクリックします。カウントされたセルの合計数が [結果]ウィンドウに表示されます。結果ログをスプレッドシートとして保存し、分析します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>自動セルカウント。<ol>
<li>ファイル>を使用して、分析する画像を開きます。続行する前に、RGB イメージをグレースケール イメージに変換します。</li>
			<li>[イメージ>しきい値を調整]を使用して、カウントする必要があるすべての領域を選択します。</li>
			<li>[解析>パーティクルの分析]を使用して、セル/パーティクルの数を取得します。特定の範囲内のセル/パーティクルをカウントするには、デフォルトの 0-Infinity の代わりに、有効なパーティクル サイズ (100-Infinity など) の範囲を設定します。結果ログをスプレッドシートとして保存し、分析します。 注:画像からその他の情報を取得するには、エリアの他の情報を取得するには、[測定値を分析] に移動し、必要な情報の横にあるボックスを選択します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Trinh, L. eA., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development%3A+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li>
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<li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50803(2014).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、マウスヘッドと非デカル化された骨組織の調製のための詳細なプロトコルと、細胞増殖、細胞死、およびBMPシグナル伝達マーカーの免疫染色のための凍結切除を提供する。また、免疫蛍光画像から定量的データを得るための戦略についても詳しく述べる。これらの方法は、適切な修飾を有する他の組織にも適用可能である。
組織調製の条件は、組織の大きさと種類によって異なります。固定と凍結保護時間は、通常、一晩に数時間を必要とします。固定後、組織はパラフィンに埋め込まれ、マイクロトーム16で切断することもできる。パラフィンとOCTの両方が免疫染色のためにうまく動作しますが、それらの間にいくつかの違いがあります。パラフィンブロックはRTで複数年保持することができ、OCTブロックは-80°Cで1年間保持できます。パラフィンは組織形態を保持し、OCT埋め込み中に形成された氷結晶は組織構造に悪影響を及ぼす可能性がある。パラフィンは時々抗原のエピトープをマスクし、OCTは酵素活性と抗原エピトープを保存します。したがって、4%PFAで4時間以下で固定し、OCTに埋め...

顔は人間のアイデンティティの重要な部分であり、上皮、筋肉、骨、軟骨、歯など、いくつかの異なるタイプの組織で構成されています。これらの組織は、外胚芽、内皮、中胚芽1、2の3つの胚芽層すべてに由来する。頭蓋組織の適切なパターン化と開発のためには、細胞増殖、死亡および分化は、Wnt、Fgf、HhおよびBmp経路3、4などの特定のシグナル伝達経路によって高度に調整され、調節される必要がある。、5.細胞の増殖、生存または分化の欠陥は、最も頻繁に発生する先天性先天性欠損の一つである頭蓋骨の奇形につながります。トランスジェニックマウスは、頭蓋骨形成および病態1、2、3、4、5のメカニズムを研究するのに有用なツールである。発達と病因の間の頭蓋の構造の変化を理解することは、主要な発達原理と頭蓋顔面奇形のメカニズムを明らかにするのに役立ちます1,2,3 、4、5.
特定の抗体を用いたマウント全体または断面組織の染色は、目的のタンパク質6の空間分布を決定するための非常に貴重な技術である。正式には、組織免疫染色は、免疫組織化学(IHC)または免疫蛍光(IF)のいずれかに依存することができます。IHCによる3,3'-Diaminobenziジン(DAB)などの発色基板で生成された不透明反応生成物と比較して、IFは蛍光顕微鏡で見える蛍光コンジュゲートの使用を含む。したがって、IFは明らかにポジティブな細胞をバックグラウンドノイズから区別し、ImageJやAdobe Photoshop 7、8などのソフトウェアによって画像を定量的に分析し、強化することができる。全体のマウント染色アプローチは、セクション9、10からの再建を必要とせずにタンパク質/抗原の位置に関する3次元情報を提供することができ、組織の小さなブロック(厚さ5ミリメートル未満)で動作します。.しかし、組織切片と比較して、マウント免疫染色全体は時間がかかり、大量の抗体溶液を必要とします。すべての抗体が基本的なマウントアプローチと互換性があるわけではありません。さらに、抗体の不完全な浸透は、不均一な染色または偽陰性染色をもたらす。ここでは、切除組織上のタンパク質/抗原の免疫蛍光検出に焦点を当てます。硬い組織(例えば、頭部、歯、長骨)の場合、発症/病因の間のカルシウム沈着は、サンプルを切除しにくくし、免疫染色治療中に容易にすすいでくるぐる。現在利用可能なプロトコルのほとんどは、セクション化を容易にするために埋め込む前に硬い組織をデカール化し、これは時間がかかり、不適切に扱われた場合、サンプルの形態および抗原を破壊する可能性があります11,12.この問題を克服するために、脱石せずに硬質組織を凍結切除するアプローチを最適化し、その形態の可視化とシグナル伝達タンパク質の分布を改善しました。
ここで説明するプロトコルは、BMPトランスジェニックマウスの頭蓋骨組織における形態学的および組織学的変化を決定するために使用されている。具体的には、プロトコルは、(1)頭部組織の収穫と解剖、(2)実験マーカーの切片および免疫染色(Ki67、pSmad1/5/9)およびTUNEL染色、(3)蛍光顕微鏡を用いた切片のイメージング、および最後に(4)を含む。結果の分析と定量化を行います。デカル化せずに硬質組織を調作および凍結切除するプロトコルも13について説明する。これらの方法は頭蓋顔面組織用に最適化されています。それらはまた適切な修飾が付いているサンプルのさまざまな年齢からの他のティッシュに適用可能である。

<table><tbody><tr><td>粘着テープ</td><td>Leica</td><td>#39475214</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-ヤギ 抗ウサギ二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>DAPI入り退色防止剤</td><td></td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー ブランド</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>In Situ&nbsp;細胞死検出キット</td><td>ミリポア</td><td>S7165</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>OCT化合物</td><td>フィッシャーヘルスケア</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>シグマ</td><td>P6148&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール&nbsp;tert-オクチルフェニルエーテル</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2542</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9129</td><td>Lot#:3;RRID:AB_2687446</td></tr><tr><td>ウサギ抗pSmad1/5/9抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>13820</td><td>ロット#:3;RRID:AB_2493181</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>1613859</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Σ</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマ</td><td>10708976001</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

組織免疫染色は、所定の組織内の目的のタンパク質の非常に特異的で信頼性の高い検出を提供します。ここでは、マウス頭蓋組織を例にした頭蓋骨形成/病因の間にタンパク質発現を検出するための完全で簡単なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、組織の調製および凍結切除、間接免疫蛍光、画像取得、および定量化で構成されます。また、免疫染色のための非デカール化硬組織の調製および凍結切除のための方法が記載されており、例として頭蓋顔面組織および長骨を用いる。これらの方法は、頭蓋骨形成/病因の間に様々な組織におけるタンパク質発現および形態学的/解剖学的変化を決定する鍵となる。それらは適切な変更を加える他の組織にも適用可能である。血管学の知識とセクションの高品質は、実験的な結果から科学的な結論を引き出すために重要です。この方法論の潜在的な制限には、抗体の特異性および定量化の困難が含まれるが、これらに限定されない。

胚頭蓋組織切片 上記のステップに続いて、頭部を対照(P0-Cre)または変異体(神経堤細胞におけるBmpr1a、P0-Cre;caBmpr1a)胚(E)16.5または18.5で解剖した。 4時間のPFAで4%PFAを固定した後、サンプルをOCTに埋め込み、冠状動脈に凍結切除した。得られた切片は、pSmad1/5/9(下流BMPシグナル伝達因子)またはKi67(細胞増殖マーカー)に対する抗体で免疫染色し、プロトコルに従って抗原検索を行わずに行った。図に示すように、pSmad1/5/9(図1A)およびKi67(図1C)は対照胚の前頭骨において陽性であった。変異胚では、pSmad1/5/9のレベルが増加し(図1B)、Ki67のレベルは前頭骨で減少した(図1D)。これら...

ここでは、マウス頭蓋組織を例に免疫染色することにより、頭蓋顔面形態/病因の間のタンパク質レベルを検出し、定量するための詳細なプロトコルを提示する。また、免疫染色のための若いマウスからの非デカル化された硬質組織の調製および凍結切除の方法について説明する。

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

ここでは、切片切り材料上のタンパク質に対する蛍光免疫検出のための簡単なプロトコルを紹介します。この方法は、抗原の検索を必要としません。難組織を含むマウスヘッドを使用します。この技術の主な利点は、硬い組織の抗原の検索および脱灰をスキップすることです。それらは免疫染色結果の良質につながる。この方法はまた時間および労働両方を節約する。この方法は、適切な修正を伴う他の組織にも適用可能である。解剖されていない組織から素敵な切片を作るために、ターゲット組織をさらに解剖して周囲の組織をトリミングし、必要に応じて凍結保護の前に2日間摂氏4度で10%EDTAでサンプルを処理します。この方法の手順について、視覚的なデモンストレーションで詳細かつ明確な説明を提供します。まず、PBSを含む10センチメートルといくつかの3.5センチメートルの皿と、各妊娠中のマウスの各井戸にPBSに4%PFAの2ミリリットルを含む1つの12ウェル培養プレートを準備し、それらをすべて氷の上に置きます。妊娠中のマウスから胚を解剖するには、安楽死させたマウスの腹の中心下の皮膚を鉗子でつかみ、皮膚のみを切断し、皮膚を穏やかに引っ張って下の腹筋壁から分離する。皮膚切開の同じラインに続いて、腹腔内に切り込む。胚の文字列を含む子宮を取り除きます。次に、子宮壁を優しく切断して胚を取り除き、黄身嚢や羊膜などの胚外組織を除去する。各胚から頭部を切断して分離し、鉗子で各頭部を4%PFAを含む12ウェルプレートの別々のウェルに移す。摂氏4度で4時間インキュベートして固定します。12時間穏やかな揺れで4°CでPBSで頭をすすいでください。ヘッドを凍結保護するには、鉗子を使用して、PBSで30%スクロースの2ミリリットルを含む新しい12ウェルプレートに移します。頭が皿の底に沈むまで摂氏4度で穏やかな攪拌でインキュベートします。凍結保護ヘッドを埋め込むには、最適な切断温度化合物を含む金型に移し、数分間平衡化します。鉗子を使用して、サンプルの位置と方向を調整して、サンプルのトリム側が埋め込み金型の底面に向かるようにします。その後、乾燥氷の上にカビを置いて凍結し、凍結切断の準備ができるまでマイナス80度のビニール袋に入れて保管します。出生後組織の場合、安楽死させた3週間から3ヶ月のマウスの皮膚および脂肪組織を除去した後、頭部を切断して分離し、下顎を取り除く。その後、胚の頭部で行われたように頭を固定し、凍結します。OCTの胚頭部と同様の方法で8%ゼラチンに埋め込み、クライオムドルを下切りまでマイナス80度のビニール袋に入れます。適切なクライオスタット温度を設定します。クライオスタットチャンバーにサンプルを約30分間置き、クライオスタット温度に平衡させます。クリオマールからサンプルを取り外し、OCTドロップで試料チャックに取り付けて凍結し、サンプルのトリミングされた側をチャックから最も遠く離れ、オペレータに向かうことを確認します。ブロックマウントチャックをクライオスタットオブジェクトホルダーに積み込みます。ブレードの角度がサンプルに対して 3 ~ 5 度になるように、ブレード ホルダーを調整します。コーティングされた顕微鏡のスライドに10マイクロメートルのセクションを集める。完全に乾燥するまで室温でセクションを残し、マイナス80度で保存します。染色から始めるには、マイナス80度からスライドを取り出し、室温で1時間保ち、セクションを空気乾燥させます。0.1%PBSTでスライドを3回5分間洗い流し、OCTを洗い流し、セクションを透過させます。各スライドに200マイクロリットルのブロッキング溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。次に、スライドをすすかずにブロッキング溶液を取り除きます。各スライドにブロッキング溶液で希釈した一次抗体の100マイクロリットルを加え、摂氏4度で一晩インキュベートする。スライドを室温で10分間3回、PBSで洗い上がってください。ブロッキング溶液に希釈した2次抗体の100マイクロリットルを加え、光から保護された室温で1時間インキュベートする。PBSで室温でそれぞれ10分間3回リンスし、依然として光から保護する。スライドを取り付けるには、各スライドにDAPIを使用して2滴のアンチフェードメディアを追加し、カバースリップで覆い、イメージを作成できるまで摂氏4度で保存します。コントロール胚の前頭骨は、pSmad1/5/9、下流BMPシグナル伝達因子、および細胞増殖マーカーであるKi67に陽性であった。神経堤特異的な、構成的に活性化されたBMPR1A変異胚では、しかしながら、ki67レベルが減少している間にpSmad1/5/9レベルが増加した。さらに、対照性胚の細胞よりも変異胚の前頭骨においてより多くのアポトーシス細胞が観察された。ゼラチン埋め込まれた頭部の冠状動脈は、鼻骨および鼻組織のtdTomatoカセットからのGFP信号およびRFP信号を明確に示し、ゼラチンが蛍光シグナルを妨げないことを示す。これらの切片がSOX9またはオステルクスおよびE11/ポドプラニンに対して免疫染色された場合、3週間の硬い組織のほとんどから良質の切片が得られた。一方、3ヶ月前のサンプルでは、大腿骨、鼻組織、頭蓋骨の骨膜部分(鼻前顎縫合糸、頭部の周囲の骨を含む)を含む硬い組織の一部でのみ良質の切片が得られた。SOX9陽性細胞は、大腿骨および鼻中隔からの成長板および関節の軟骨細胞において特異的に検出された。生後3週間の切歯では、間葉細胞でSOX9が検出された。オステリクスとE11の二重染色結果は、オステリクスが骨芽細胞で検出され、E11は大腿骨および頭部からの骨の骨細胞で検出されたことを示す。3週間の切歯では、オステリクスは歯根芽細胞で陽性であり、E11は卵胞間葉細胞で陽性であった。4%PFAでサンプルをオーバーフィックスしないでください。ゼラチン中の固硬組織の除菌では、最高温度はマイナス25°C以下です。この手順に従って、蛍光レベルは、我々のプロトコルに記載されているように定量化することができる。これらの測定値は、異なるグループ間のタンパク質の相対的なレベルの違いを示す有益なデータを提供します。その開発後、この技術は、異なるタンパク質の共発現パターンを得るための二重または三重染色のための道を開いた。4%PFA は危険です。皮膚アレルギー、重篤な眼の損傷、臓器の損傷、または癌を引き起こす可能性があります。取扱い後は、個人用保護具を使用し、肌を十分に洗ってください。

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Research

JoVE Journal

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マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色

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