Name: In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぶAstyanax mexicanus胚のin situハイブリダイゼーション法。最小限の背景染色で遺伝子発現パターンを可視化し、発生生物学と神経科学の研究を支援します。再現性の高いプロトコルで洞窟魚の進化的適応を解明します。

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この原稿の有用なコメントのための総研究室のメンバーを感謝致します。2017、2018、クリスティン曹、マイケル ・ ウォーデン、安芸李デビッド ヌワンコなど夏のインターンシップ中にこのプロトコルを利用する 4 つの高校生を認識したいです。HL は 2017 年の夏カリフォルニア大学生物学幹交わりによって支えられました。この作品は全米科学財団 (デブ 1457630 JBG に)、国立機関歯科・頭蓋顔面研究所 (NIH; からの補助金によって支えられました。JBG に DE025033)。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) シンシナティ大学 (プロトコル #10-01-21-01) によって承認されています。
1. 固定
<ol><li>飼育槽からアステュアナクス メキシコ胚の適切な数を特定し、一度に 50 〜 胚を修正します。胚は大きく、古い場合も固定して時に 25 を修正する必要があります。</li>
	<li>胚の年齢に応じて麻酔 IACUC 承認法を活用します。機能系と古い胚のため麻酔薬過量投与による胚を犠牲に。したがって、痛みや有機体のための不快感を最小限に抑える (pH 7.4 にバッファリング) ~ 1 %tricaine 溶液に胚を配置します。</li>
	<li>胚が反応するタッチ、tricaine を含むシステム水を交換し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) x 1 〜 1 mL を追加します。</li>
	<li>PBS のソリューションを削除し、4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 1 つの mL を追加します。4 ° C で一晩胚を修正します。 注意: PFA は (すなわち、それは可燃性と皮膚と肺の刺激) は危険、取り扱い注意。</li>
</ol>2. 脱水症状
<ol><li>胚を脱水、固定液 1 mL の PBS ですすいでください。リンス中にプラットフォーム シェーカーに角度 (30 ° と 45 °) の間でバイアルを胚芽入りを配置します。胚は 2 回、洗浄あたり 5 分を洗浄し続けます。</li>
	<li>胚では、絨毛膜がある、すべて 50 胚を 100 mm × 25 mm シャーレに置き、この慎重に顕微鏡下で時計職人の鉗子 (#5 鉗子など) の 2 つのセットを使用して絨毛からそれらを分離します。 注: 手順とプロトコルの残りのため中から慎重に取り外しますすべて液体クリーンを使用して前の手順、次の解決策を追加する前にガラス パスツール ピペット</li>
	<li>メタノール (メタノール) 下記のますます集中している洗浄のシリーズで胚を脱水します。希釈は、各 4 mL バイアルに入る液の 500 μ L で 1 mL の容量に基づいています。シェーカーのプラットフォームに室温 (RT) ですべての脱水の手順を実行します。<ol>
<li>PBS ソリューションを慎重に取り外します。25% メタノール溶液 (メタノールの 250 μ L) + 750 μ L の PBS を追加します。軽く 5 分プラットフォーム シェーカーを振る。</li>
		<li>25% メタノール溶液を慎重に取り外します。50% メタノール溶液 (メタノール 500 μ L) + 500 μ L の PBS を追加します。軽く 5 分プラットフォーム シェーカーを振る。</li>
		<li>50% メタノール溶液を慎重に取り外します。75% メタノール溶液 (メタノールの 750 μ L) + 250 μ L の PBS を追加します。軽く 5 分間プラットフォーム シェーカーを振る。</li>
		<li>75% メタノール溶液を慎重に取り外します。100% メタノール溶液 (1 mL のメタノール) を追加します。軽く 5 分 3 回ステップを繰り返してくださいプラットフォーム シェーカーを振る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>この時点で、ストアは胚、-20 ° C (長期) で彼らのガラスの瓶で、必要に応じて水分を取り除かれます。また、プロトコルの 1 日目に進みます。</li>
</ol>3. 1 日目: 水分補給
<ol><li>-20 ° C のフリーザーから脱水の胚を得る (または 2.5 のステップから直接続行)。</li>
	<li>パスツール ピペットを用いた胚を並べ替えます。1 つは (すなわち、洞窟または表面) に基づいて morphotype を並べ替えることができ、遺伝子の数が各実験で評価しました。一度ソート バイアルあたり通常これ以上より 12 の胚があります。組織を維持するためにバイアルおよび各遺伝子用ピペットを指定するのに色ラボ テープを使用します。胚は、プロトコル全体を通して同じバイアルに滞在します。 注: 100% のパスツール ピペットの先端の場所の間のそれを殺菌するエタノールを使用します。</li>
	<li>揺れ水浴を後の手順で使用される 70 ° C に設定します。慎重に、並べ替えられた胚のバイアルにメタノールを引き出すし、置き換える新しい 100% を 500 μ l 添加メタノール。簡単に (~ 1 分) を洗うプラットフォーム シェーカー。</li>
	<li>プラットフォーム シェーカーで Tween 20 (PBT、下記参照) と 1x PBS の増加濃度の胚を水分補給します。希釈は、各バイアルに入る 500 μ L で 1 mL 最終希釈量に基づいています。<ol>
<li>25 %pbt ソリューション (PBT、MeOH の 750 μ L の 250 μ L) を追加します。軽く 5 分プラットフォーム シェーカーを振る。</li>
		<li>25% ・ PBT ・ ソリューションを慎重に取り外します。50 %pbt ソリューション (PBT、MeOH の 500 μ L の 500 μ L) を追加します。軽く 5 分プラットフォーム シェーカーを振る。</li>
		<li>50% ・ PBT ・ ソリューションを慎重に取り外します。75 %pbt ソリューション (PBT、MeOH の 250 μ L 750 μ L) を追加します。軽く 5 分プラットフォーム シェーカーを振る。</li>
		<li>75% ・ PBT ・ ソリューションを慎重に取り外します。100 %pbt ソリューション (PBT の 1 mL) を追加します。軽く 5 分 3 回ステップを繰り返してくださいプラットフォーム シェーカーを振る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 1 日目: 消化と固定
<ol><li>プロティナーゼ K (PK) ソリューションを準備するには、PBT の 2 mL に PK (20 mg/mL) の 1 μ L を追加します。</li>
	<li>以降の手順を見越して、-20 ° C での保存から交配バッファー (Hyb - と Hyb +;補足ファイル 2 ファイル 3 の補足を参照してください)、PFA の冷凍の因数を取得します。<ol>
<li>室温解凍する PFA を許可します。</li>
		<li>回転 70 ° C の水浴中 Hyb - と Hyb + の因数を配置します。すべて試薬及び試薬容器小浮水風呂装置内部メッシュの下「ガスケット」の内部に配置します。これによりチューブと回転 70 ° C の水浴からバイアルの単純な追加および削除できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての組織を確保する胚のバイアルに PK ソリューションがソリューションで完全に覆われている優しく追加します。~ 12 分での PK 作業ソリューション プラットフォームのシェーカーのための胚を消化します。 注: 最適な結果を確保するための調査官によって消化の長さを変えることができます。</li>
	<li>PK 溶液をゆっくりと引いて、簡単に任意の残りのパークを希釈する PBT でバイアルの洪水</li>
	<li>PBT ソリューションをオフに描画し、新しい PBT 500 μ L に置き換えます。5 分間プラットフォーム シェーカーで洗浄するソリューションを許可します。</li>
	<li>PBT をオフに描画し、解凍の 4% の 500 μ L に置き換えます PFA。プラットフォーム シェーカー室温で 20 分間インキュベートする胚を許可します。</li>
	<li>4% をオフに描画 PFA と簡単に任意の残りの PFA を希釈する PBT でバイアルを洪水します。PBT をオフに描画し、新鮮な PBT 500 μ L に置き換えます。プラットフォーム シェーカー上で 5 分間洗浄する胚を許可します。この手順 4 複数回繰り返します。</li>
</ol>5. 1 日目: Prehybridization
<ol><li>バイアルに予め温めておいた Hyb ソリューションの場所 500 μ L。慎重に、70 ° C 水 (ガスケット) 内風呂なし5 分、揺れにバイアルを配置します。</li>
	<li>Hyb ソリューションを描画し、予め温めておいた Hyb + ソリューションの 500 μ L でバイアルの洪水します。70 ° C の水浴 (40 回転) を振動にバイアルを配置します。いずれかの 4 時間インキュベートまたは一晩します。 注: 4 時間培養は合計で 4 日間完全なその場でのプロトコルになります。ここでは、この手順は、一晩インキュベート、合計 5 日間続くプロトコルをもたらすとして提示されます。</li>
</ol>6 2 日目: 交配
<ol><li>5 分間揺れお湯浴に-20 ° C のフリーザーから Hyb + の因数を配置します。</li>
	<li>バイアルから Hyb + 引き、予め温めておいた Hyb + 500 μ L に置き換えます。このソリューションを慎重に 2 μ L の RNA プローブを各バイアルに追加します。プローブの均一な分布を確実にバイアルを軽く旋回します。</li>
	<li>70 ° C の湯浴で Hyb + (追加調査) のソリューションを 40 rpm で震えながら一晩インキュベートします。 注: 1 つは、Hyb + (プローブ) のソリューションを再利用できます。このため、Hyb + プローブを最初から実行から取る-20 ° C のフリーザーと場所交換 Hyb + 1 日目から 5 分間湯浴 Hyb + プローブのプロトコル、湯浴で一晩インキュベートを許可します。</li>
</ol>7 日 3: ソリューションの準備
<ol><li>「遺伝子の関心」RNA プローブの付いた Hyb + マイクロ遠心チューブ用を準備します。3 日目に使用される希薄のシリーズを準備します。<ol>
<li>6 の個別のチューブを使用して、Hyb と生理食塩水クエン酸ナトリウム (SSC、0 ~ 100%) の希釈液の次のシリーズを準備します。風呂の水揺れ 70 ° C で 1 mL ボリューム、および場所: チューブ 1 = 100 %hyb - (Hyb の 1 mL): 2 = 25% をチューブ 2 x SSC (250 μ L 2 の x SSC、Hyb 750 μ L);3 = 50 %2 x SSC をチューブ (2 x SSC、Hyb 500 μ L の 500 μ L);4 = 75 %2 x SSC をチューブ (2 x SSC、Hyb の 250 μ L 750 μ L);チューブ 5 = 100 %2 x SSC (2 x SSC の 1 mL);6 = 100 %0.2 x SSC (0.2 x SSC の 2 mL) をチューブします。 注: 警戒、SSC の濃度の 2 倍から 0.2 に変更、x。</li>
		<li>4 を使用してチューブを分離、PBT、SSC の 1 mL 量の希釈液の次のシリーズを準備し、RT に配置: 1 = 25% をチューブ PBT (250 μ L 750 μ L 0.2 の PBT の x SSC);2 = 50 %pbt をチューブ (PBT、0.2 x SSC を 500 μ l 添加の 500 μ L);3 = 75 %pbt をチューブ (PBT、0.2 x SSC の 250 μ L 750 μ L);4 = 100 %pbt 樹脂 (PBT の 1 mL) をチューブします。</li>
		<li>管 2 mL のトゥイーン 20 (MABT) 実用的なソリューションを含むマレイン酸バッファーを準備します。</li>
		<li>ソリューションをブロックの 2 つの 15 mL の円錐管を準備します。各チューブの MABT 10 mL にブロッキング試薬の 0.2 g を追加 (補足ファイル 4を参照)。(最大 3 h) ソリューションで完全に溶解までならびにミキサー (またはプラットフォーム シェーカー) 両方のチューブを配置します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8 日 3: プローブの除去
<ol><li>Hyb + (プローブ) とガラス パスツール ピペットで溶液を描画し、遠心チューブをラベル、滅菌にそれを配置します。(プローブ標識が成功した) 場合は、将来の使用のため-20 ° C のフリーザーの筒を保持します。</li>
	<li>暖かい SSC/Hyb-希釈 (下記) を 500 μ l 添加を慎重に追加します。70 ° C の振動水お風呂に 10 分間以下の解決策のそれぞれで孵化させなさい。<ol>
<li>100% と順次孵化 Hyb - (Hyb の 1 mL) 25 %2 x SSC (2 の 250 μ L x SSC、Hyb 750 μ L), 50 %2 x SSC (500 μ L の 2 x SSC、Hyb 500 μ L), 75 %2 x SSC (750 μ L 2 の Hyb の 250 μ L x SSC)、100 %2 x SSC (2 の 1 mL x SSC)、100 %0.2 x SSC (0.2 2 mL x SSC)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次の最後のステップでは、各 10 分ずつの次のソリューションで孵化させなさい。プラットフォーム シェーカーで RT で場所を取る次の孵化のすべて: 25 %pbt (250 μ L 750 μ L 0.2 の PBT の x SSC)、50 %pbt (500 μ L PBT、0.2 を 500 μ l 添加の x SSC), 75 %pbt (PBT、0.2 の 250 μ L 750 μ L x SSC)、100 %pbt (PBT の 1 mL)。</li>
	<li>10 分間インキュベーション後削除 100 %pbt、各バイアルに MABT を 500 μ l 添加し、。5 分の 2 回、この手順を繰り返します。</li>
</ol>9 3 日目: ブロック
<ol><li>各バイアルからの洪水 (7.1.4 の手順で準備) 管のいずれかから予ブロッキング液で MABT を削除します。室温 〜 4 時間ならびにミキサーにバイアルを配置します。</li>
	<li>追加 2 μ L 抗 DIG AP Fab のフラグメントの第 2 バイアル 10 mL (7.1.4 の手順で準備) ソリューションと簡単に渦をブロックするのです。</li>
	<li>ソリューション (~ 5 mL) ブロック各バイアルでほぼ完全に満たし、4 ° C で冷蔵庫で一晩ならびにミキサーに配置</li>
</ol>10 4 日目: MABT リンス
<ol><li>MABT で 10% ヤギ血清 (NGS) のストック バイアルを準備 (MABT の 900 μ L に NGS の 100 μ L を追加)。</li>
	<li>各バイアルにブロッキング液をオフに描画し、各バイアルに NGS/MABT 混合物の 500 μ L を追加します。プラットフォーム シェーカーで RT で 25 分間インキュベートする胚を許可します。</li>
	<li>500 μ L 100% の NGS/MABT 混合物に置き換える MABT。プラットフォーム シェーカーで RT で 30 分間インキュベートします。このリンス 11 回以上終日 30 分ごとを実行します。</li>
	<li>100 %mabt、4 ° C で冷蔵庫やウォークイン商工会議所で一晩ならびにミキサー上の場所と、バイアルを満たし</li>
</ol>11 日は 5: プローブの可視化
<ol><li>アルカリフォスファターゼ (AP) バッファーの 50 mL の約数を準備 (補足のファイル 5を参照)。50 mL の円錐管に包まれた光の露出を制限するアルミ箔で次の結合: 1 M トリス (pH 9.5) 50 mm MgCl2, 5 mL の 1 %5 mL の 5 mL トゥイーン 20、1 M nacl、30 mL ddH2O の 5 mL。</li>
	<li>MABT を削除し、1 mL の AP バッファー (チューブに包まれた箔) で置き換えます。それは 5 分間洗ってみましょう。MABT の完全な除去を確実に 2 回これを行います。</li>
	<li>Ap 通信バッファーを削除し、3.5 μ 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate AP バッファー (BCIP) および 4.5 の 1 mL に置き換える、ニトロ ブルー テトラゾリウム (NBT) の μ L。作りたて AP バッファー/NBT/BCIP 反応まで 1 時間おきが完了したら置き換えます。呈色反応染色の必要なレベルを達成するまで場所を取ることを許可するように、15 分毎にチェックを密接に監視します。沈殿物は、フォームに開始された場合は、早くソリューションを取り付けます。</li>
	<li>(背景の汚損の最小限の量) と信号の最適なレベルが達成されるまで (NBT/BCIP) なしの新鮮な 100 %ap バッファーで胚を洗浄によって PBT で 5 分続行リンスの呈色反応を停止します。Ap 通信バッファーの PBT の希釈液を次のように増加の標本をリンスし続ける: 25 %pbt (PBT、ap 通信バッファーの 750 μ L の 250 μ L)、リンス 5 分。50 %pbt 樹脂 (PBT、ap 通信バッファーの 500 μ L の 500 μ L)、リンス 5 分。75 %pbt 樹脂 (PBT、ap 通信バッファーの 250 μ L 750 μ L)、5 分間洗浄します。</li>
	<li>ならびにミキサー必要最低限の背景を汚すまでの PBT に達する 100% 〜 5 mL に胚をすすいでください。スイッチ アウト新鮮な PBT で数回。これは数日取ることができます。</li>
	<li>500 μ L のプラットフォーム シェーカーで滅菌 PBS で洗浄、完全な胚が洗浄します。5 分の 2 回このすすぎを実行します。4% の 500 μ L の試料を後修正 PBS 洗浄後、PFA プラットフォーム シェーカーで RT で 1 時間。また、一晩 4 %1 mL に修正 4 ° C で冷蔵庫に PFA</li>
	<li>定着剤を交換して、新鮮な滅菌 PBS。100% 滅菌 PBS の 〜 4 mL の胚を 5 分場所に対して 2 回以上このすすぎを実行し、4 ° C で長期保存</li>
</ol>12. イメージング
<ol><li>3% の agarose と TAE バッファーを使用してシャーレにイメージング プレートを確認します。 注: 量は、どのように多くのプレートが必要に依存します。プレートは、数回を再利用できます。プレートに胚を含むのための不況を作成するためにゲルを冷却しながら、ペトリ皿に浅い長方形型を格納することをお勧めします。</li>
	<li>PBS のプレートに胚を配置します。 注: そっと注ぎ、彼らはプラスチック製のピペットの中に固執することを発見したので、それらをピペットではなくプレートの上に胚をお勧めします。</li>
	<li>それぞれの胚を視覚化するために光学顕微鏡を使用します。目的の位置に胚を操縦するのに鈍プローブを使用します。</li>
	<li>目的の位置、胎児のときに、イメージを取る。汚れの潜在的な劣化を避けるために完成した染色の数週間内の胚の画像を取ることが重要であるに注意してください。</li>
</ol>

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</ol>

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劣化する RNA の脆弱性によりプロトコルの最も重要な手順の 1 つは RNA プローブの滅菌の合成にかかわる。ただし、プローブが生成されます慎重に良い結果を提供し場合、は、その後染色反応では使用できます。2 番目の重要なステップは、プロトコルで使用されるすべての試薬の慎重な生産です。このプロトコルには、数日、多くの小さなステップが含まれているのでそれが必要し、滅菌方法で格納されているすべての試薬が正確にであります。さらに、調査官がプロトコルの各ステップの追跡をします、根本的に重要です。我々 は、手順のチェックリストこのプロトコルの各側面の正確かつ正確な完成を確保する上で非常に役に立つことを発見しました。
私たちはしばしば、私たちがここで提示されたプロトコルを変更しません。ただし、捜査官が示唆されたものよりも異なる温プローブ孵化を実行可能性があります (すなわち、70 ° C)。ハイブリダイゼーション温度のわずかな変化は RNA プローブの結合に影響を与え、最適な交配の温度を求めることができる染色の品質に影響積極的にしたがって。トラブルシューティングに関してはこの記事 (<stro...

In situ ハイブリダイゼーションは、遺伝子発現パターン1を視覚化する固定ティッシュの汚損のための一般的な方法です。この手法を他の伝統的な2および非伝統的な3モデル システムでは、さまざまな生物学的研究の年行った。ただし、いくつかの手順と試薬は、この手順を正常に実行する必要です。この手法を実行したことがない者は、プロセスを開始する多くの手順のおかげで威圧的なことができます。さらに、この手順の長い性質は、トラブルシューティングに挑戦することができます技術的なエラーに適しています。
この記事の全体的な目標は、幅広い視聴者にアクセス可能なこの交配の技術を表示するシンプルで簡単な方法を提示することです。エラーの概要を減らすためには、質の高い遺伝子式染色が得られますし、非固有バック グラウンド信号を最小限に抑える簡単な方法を提案する.この手順は、他の動脈分布4などの伝統的なモデル システム開発のアプローチに似ています。ここでは、慎重に慎重に実装されたプロトコルを促進するためにダウンロード可能なチェックリスト (補足ファイル 1) を使用して各ステップの実装を容易にするために目指しています。これを行うための理論的根拠は、この手順に関与する多くのステップを介して組織を促進することです。この記事が、初期胚ホール マウント in situ ハイブリダイゼーションを行うに興味がある研究者の適切な手順をまだ実行していません。アステュアナクス研究者の選択した方法の利点はことそれが試され、血脈の表層魚群モーフ、これにより比較表現の分析を促進します。アステュアナクスおよび他のシステムの研究で研究者によって提示されたメソッドを使用できます。

<table><tbody><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL ろ過ユニット</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐形</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清ピペット</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>250 mL ろ過ユニット</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清ピペット</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカル</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500 mL ろ過ユニット</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-AP、ファブフラグメント</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td><td>1 g</td></tr><tr><td>ブロッキングソリューション</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50 g</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A104-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>DIG RNA ラベリングキット (SP6/T7)</td><td>Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャーデコン</td><td>04-355-223</td><td>1 ガロン</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>ガラスドラムバイアル</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>1 Dr</td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>熱科学Pharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム結晶</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>M33-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>シグマ</td><td>M0375-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A452-4</td><td>4L</td></tr><tr><td>分子グレード水 (RNase-free)</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>NaCl</td> フィ<td>ッシャー・サイエンティフィック</td><td>S271-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>NaOHペレット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>NBT基質粉末</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>34035</td><td>1 g</td></tr><tr><td>ノーマル・ゴート・セラム</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Nutating Mixer</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma</td><td>158127-500g</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>Proteinase K (200mg/10ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>プラスチックピペット</td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>振とうウォーターバス 12 L</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 L</td></tr><tr><td>標準アナログ シェーカー</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500 g</td></tr><tr><td>tRNA 酵母</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>15401011</td><td>25 mg</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50mL</td><td>50mL</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>塩化リチウム (LiCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203637-10G</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

in situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の wholemount

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

近年、たくさんの遺伝子のシーケンスの身元を明かす、盲目のメキシコの血脈 (アステュアナクス メキシコ) のゲノムがリリースされています。この新たなモデル システムに先行研究は、様々 な洞窟を伴う表現型に関連付けられている多数の量的形質遺伝子座 (QTL) を識別した広範囲のゲノム広い調査の資本金。ただし、表現型変化の遺伝の基礎に興味のある遺伝子を接続する能力は重要な課題です。Troglomorphic の進化の役割のより深い理解を容易にすることができます 1 つの方法は、ホール マウント in situ ハイブリダイゼーションです。この手法を実装して、直接洞窟と表面の住居形態の間の遺伝子発現を比較、確立された QTL を根底にある遺伝子の候補者を指名、次世代シーケンシングの研究から興味のある遺伝子を識別または他を開発できます。検出ベースのアプローチ。このレポートで広く研究から開発されたシステムを越えての使用のために合わせることができる柔軟性の高いチェックリストによってサポートされている単純なプロトコルを提案します。このプロトコルのアステュアナクスコミュニティの内外に広範なリソースとして使用できることが望まれます。

本報告では、高品質遺伝子発現解析のための胚のアステュアナクス標本のラベル付けを実行するシンプルで簡単なアプローチを提供します。この手法は、4 つまたは 5 日間で行うことが、各主要なステップの手順では、色分けされたフローチャート (図 1) で表されます。完了すると、ステンド グラスの胚は興味の特定の遺伝子を表現する組織の暗い紫色色ラベルを抱く必要があります。我々 は Pachón 血脈 (図 2 a-B, E) と表層魚群 (図 2-D, F) 胚の両方でこのプロトコルを実装しました。
血脈の胚は、そのラベルの初期神経の頂...

このプロトコルは、胚のアステュアナクス血脈遺伝子発現可視化を実現。 にします。このアプローチは非特異染色を最小限に抑えながら遺伝子式信号を最大の目標としてきた.

In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

私たちのin situプロトコルは、最小限のバックグラウンド染色で遺伝子発現パターンを視覚化する簡単な方法を提供するため、重要です。この手法により、複雑で長いプロトコルを比較的簡単に実行できます。Benchtop は提案とチェックリストを設定し、このプロトコルを正しく実行し、再現することがさらに容易になります。ここで示す技術はアスティヤナックスメキシカーヌスに固有のものですが、プロトコルにわずかな調整を加えた同等のサイズの個人の他のシステムに適応する可能性があります。まず、色付きのラボテープを使用して、各遺伝子のバイアルとピペットを指定します。パスツールピペットを使用して、胚をソートします。通常、バイアルあたり12個以下の胚は、一度ソートされる。次に、振れる水浴を摂氏70度に設定します。慎重に選別胚のバイアルにメタノールを引き出し、新鮮な100%メタノールの500マイクロリットルに置き換えます。プラットフォームシェーカーで約1分間、胚を短時間洗います。この後、テキストプロトコルで概説されているように、プラットフォームシェーカー上のTween 20で1x PBSの濃度を増加させるに胚を再水和する。まず、メッシュ底の小さなガスケットを、摂氏70度に予熱された回転ウォーターバスに入れます。ハイブリダイゼーションバッファーマイナスとハイブリダイゼーションバッファープラスのアリコートをガスケットに入れます。調製したPK溶液を胚のバイアルに静かに加え、すべての組織が完全に溶液で覆われていることを確認します。バイアルをプラットフォームシェーカーに移し、プロテイナーゼKの働く溶液で約12分間消化させます。この後、PK溶液をそっと引き出し、PBTでバイアルを短時間フラッドして残りのPKを希釈します。PBT溶液を500マイクロリットルの新鮮なPBTに交換し、プラットフォームシェーカーで5分間溶液をすすいでください。その後、PBT溶液を解凍した4%PFAの500マイクロリットルに交換してください。胚を室温でプラットフォームシェーカーに20分間インキュベートさせます。プレハイブリダイゼーションを開始するには、胚含有バイアルに500マイクロリットルのプレウォームハイブリダイゼーションバッファーマイナス溶液を加えます。5分間振らずに70°Cの水浴中のガスケットにバイアルを慎重に入れます。次に、ハイブリダイゼーションバッファーマイナス溶液を引き出し、500マイクロリットルのプリウォームハイブリダイゼーションバッファーと溶液でバイアルをフラッディングします。バイアルを水浴のガスケットに戻し、4時間または一晩揺れでインキュベートします。ハイブリダイゼーションを開始するには、バイアルからハイブリダイゼーションバッファプラスを引き出し、500マイクロリットルのフレッシュプリウォームハイブリダイゼーションバッファプラスに置き換えます。各バイアルに2マイクロリットルのRNAプローブを慎重に追加し、プローブの均等な分布を確保するために穏やかに旋回します。40 RPMで振りながら、一晩摂氏70度で水浴中にインキュベートします。まず、テキストプロトコルで概説されているように、ハイブリダイゼーションバッファーに加えて、目的のRNAプローブの遺伝子を標識したマイクロ遠心チューブを調製する。2つの15ミリリットルの円錐形チューブをセットし、0.2グラムのブロッキング試薬と10ミリリットルのMABTを加えます。試薬が溶液に完全に溶解するまで、両方のチューブを栄養ミキサーの上に置きます。ガラスパスツールピペットを使用して、ハイブリダイゼーションバッファープラスとプローブ溶液を取り出し、滅菌標識マイクロ遠心チューブに入れます。このチューブは、将来の使用のためにマイナス20°Cで冷凍庫に保管してください。500マイクロリットルの温かい生理食塩水ナトリウムとハイブリダイゼーションバッファーから希釈液を差し引いたものを慎重に加えます。順次溶液でそれぞれ10分間、揺れる水浴でインキュベートし、次にテキストプロトコルで概説されているようにプラットフォームシェーカー上の室温でインキュベートする。最後のインキュベーションの後、MABTの500マイクロリットルで各バイアルから100%PBTを交換してください。このプロセスを 5 分間繰り返します。まず、各バイアルからMABTを取り出し、15ミリリットルの円錐管の1つからプレミックスブロッキング溶液であふれます。両方のバイアルを、常温で4時間、栄養ミキサーに置きます。調製されたブロッキング溶液と短い渦の第2のチューブに抗体断片の2マイクロリットルを追加します。その後、ブロッキング溶液で各バイアルをほぼ完全に充填し、摂氏4度の冷蔵庫で一晩栄養ミキサーに置きます。まず、MABTで10%NGSのストックバイアルを準備します。各バイアルのブロッキング溶液を、このNGS溶液の500マイクロリットルに交換してください。プラットフォームシェーカーの室温で25分間インキュベートします。この後、NGS混合物を100%MABTの500マイクロリットルに置き換えます。プラットフォームシェーカーを室温で30分間インキュベートします。このすすを1日を通して、30分ごとにさらに11回繰り返します。その後、100%MABTで各バイアルを充填し、摂氏4度で冷蔵庫で一晩栄養ミキサーに置きます。まず、各バイアルのMABTを1ミリリットルのAPバッファに交換し、5分間洗浄します。この洗浄を2回繰り返してMABTを完全に取り除きます。次に、3.5マイクロリットルのBCIPと4.5マイクロリットルのMBTを含む新鮮なAPバッファの1ミリリットルにAPバッファを交換してください。反応が完了するまで1時間ごとにBCIPとMBTを含むAPバッファの新鮮な混合物と交換し、反応を注意深く監視し、所望のレベルの染色が達成されるまで15分ごとにチェックしてください。プロトコルで概説されているように、APバッファ内の1X PBTの濃度を増加させて胚をリンスすることにより、着色反応を停止する。目的の最小バックグラウンド染色に達するまで、栄養ミキサーで約5ミリリットルの100%PBTで胚をリンスします。すすいが完了したら、プラットフォームシェーカーで500マイクロリットルの無菌PBSで胚を洗浄し、テキストプロトコルに概説されているように標本を後置します。胚をすすいだ後、100%無菌PBSの4ミリリットルに入れ、必要に応じて摂氏4度で長期間保存する。本研究では、胚性アスティアナックス標本は、高品質の遺伝子発現解析のために標識されている。このプロセスは、パチョン洞窟魚と表面魚の胚の両方で正常に実装されています。Sox9発現に標識された洞窟魚の胚は、発達中の分岐アーチおよび胸部フィンにおける明確な標識を示す。黄身嚢または脇腹の発育中のスマイトには、染色が事実上存在しない点に注意してください。同様に、Tfap2a発現は、胚の側側側領域に沿った早期移行神経堤細胞として発達中頭部の部分に明らかである。洞窟魚の胚のために提示された3番目の遺伝子、Phf20aは、骨組織を生み出す運命にある体細胞中胚および後頭部の部分に見られる。CXCRに標識された表面魚の胚は、頭部および側面の単離された領域における陽性標識を示すとともに、黄身嚢の上にあるいくつかの個々の細胞を示す。遺伝子Adcyap1aは下垂体細胞を含む中枢神経系の領域で発現される。胚の後ろ面における細胞の対両側クラスターにおける非常に特異的な発現と、正中線発現のより大きな領域に注意してください。洞窟魚の胚について最後に調べた遺伝子Sox10は、後部胚の左右の神経堤の初期マーカーとして明らかである。その後、我々は通常、光顕微鏡を使用して結果を画像化します。染色の劣化を避けるために、完了後2週間以内にこれを行うことをお勧めします。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ-...

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

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RNAのホールマウントするための方法を組み合わせることにより、...

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高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

Xenopus laevisの胚は、その大きなサイズと操作の容易さから、初期発生の研究において非常に有用であり続けています。  このモデルシステムにおける特定の臓器の同定に使用できる、全マウントin...

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ゼブラフィッシュ胚は、発生生物学の研究のための優れたモデルである。胚発生の間に、ゼブラフィッシュは、試料観察および分析のための3次元の課題が卵黄塊で開発しています。このプロトコルは、その場でホールマウントの準備を取り付ける2次元の平面を作成する方法について説明します（WISH）は、ゼブラフィッシュ胚の標本を染色した。...

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

ここでは、遺伝子操作マウスの開発における感覚軸索成長表現型を評価する効果的な方法として、全動物の末梢侵害受容器軸索突起のイメージングのために胎児マウスを遺伝子型決定し、染色し、準備するための最適化されたプロトコルを提示します。...

マウスの胚感覚軸索投影のホールマウントイメージング

いくつかのテクニックを使用して視覚化することができますマウス初期胚のオーガナイザーをシグナリング過渡では脊索板とノードです。ここでは、我々 は詳細にその構造と形態形成を研究する技術の 2 つを行う方法をについて説明: 1) 走査電子顕微鏡 (SEM);2) 全台紙蛍光...

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

ここで提示されるゼブラフィッシュおよび管形成アッセイにおけるその際の全実装RNAハイブリダイゼーション分析のためのプロトコルは、血管形成におけるエンドグリンの役割を研究する患者由来の誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞におけるアッセイである。...

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

学ぶAstyanax mexicanus胚のin situハイブリダイゼーション法。最小限の背景染色で遺伝子発現パターンを可視化し、発生生物学と神経科学の研究を支援します。再現性の高いプロトコルで洞窟魚の進化的適応を解明します。

In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount

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