Name: アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶアグロバクテリウムを用いたジャガイモの遺伝子導入法。A. tumefaciensとA. rhizogenesの両手法を比較し、GUS染色でプロモーター活性を評価する。根の形態形成と遺伝子機能解析に有用な植物バイオテクノロジー手法を習得できる。

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この作品は、ジローナ大学 (博士号付与 SF とグラントと資金 (AGL2012 36725, AGL2015 67495 C2 1 R) のフェダー Ministerio デ Economía y Competitividad Ministerio デ Innovación y サイエンス (AGL2009 13745、PB に FPI グラント) によって支えられました。SING11/1)。A. 体の獲得とA. 根頭がんしゅ病菌株を提供するため、著者は博士インゲ Broer (ドイツ ・ ロストック市土地利用、ロストック大学研究所) および博士サロメ ・ プラット (セントロ ナシオナル ・ デ ・ Biotecnología、マドリード、スペイン) に感謝してそれぞれ、博士施されたソレルとヘルプとサポートA. 体の獲得変換実験を開始する受信博士アンナ プラセンシア (トゥールーズ III ポール ・ サバティエ大学、CNRS、植物研究所 (LRSV)、カスタネット Tolosanフランス)。著者は研究所の仕事の遂行としていた間、実験のいくつかの植物・ フェラン Fontdecaba くださったカーラ ・ サンチェスの世話で彼女の貴重な援助ありがとうサラ ・ ゴメス (局・ デ ・ Biologia、UdG、ジローナ)彼らの最終的な程度のプロジェクト。

A. 体の獲得の変形のプロトコルは適応し、ホーンら7から変更し、テスト遺伝子型はs. ニラssp. 結節性(品種デジレ)。A. 根頭がんしゅ病菌変形のプロトコルだった合わせたし、バネルジーら22から変更され、テスト遺伝子型s. ニラssp. 結節性(品種デジレ)および s. の結節の ssp andigena。それぞれ図 1 と図 2は、両方の手順の主な手順をまとめます。
注:体外の転送を実行する手順のすべての手順で急速に、そうと可能な場合維持プレートや鍋を閉じると、萎凋現象と汚染を避けるために空気に植物の露出を最小限に抑える。それ以外に、すべての植物の孵化は暗い 20 の ° C および 67 µmol m-1の-1の 24 ° C 光/12 h の 12 h の条件の下でキャビネットで行われました。それ以外に、転送を実行すべて細菌操作と体外植物層流フードの無菌条件で。表 S1は、アグロバクテリウムと体外の植物文化のすべてのメディアのレシピを提供しています。
注意:すべての遺伝子組み換え細菌や充当の廃棄物コンテナーに植物を入金します。
1アグロバクテリウム文化変換の使用。
注: A.体の獲得変換用ひずみ (博士インゲ Broer によって提供された) C58C1:Pri15837 , A. 根頭がんしゅ病菌のあった GV2260 (博士サロメ プラットによって提供された)。A. 体の獲得バイナリ ベクトル PK7GWIWG2_II-場 (VIB-Universiteit ゲントのプラント システムの生物学の部門; http://gateway.psb.ugent.be)、T-DNA 変換マーカーを運ぶ毛状根を監視するを含むと共に、変貌しました。形成します。A. 体の獲得とA. 根頭がんしゅ病菌によって生成された変換後の根を比較するには、とβ-glucoronidase (GUS)レポーターの遺伝子を運転 FHT プロモーターを運ぶ T DNA を含むベクター pKGWFS7 両方変形しました。選択可能なマーカー15としてカナマイシン耐性遺伝子。
<ol><li>アグロバクテリウムのコロニーをピックアップし、200 rpm で振とうしながら 28 ° C で 50 mL の遠心管にして一晩 (O/N) 抗生物質 (表 S1) YEB 培の 5 mL の成長します。</li>
	<li>A. 根頭がんしゅ病菌変形のため OD600をする必要があります光の密度を測定 = 0.6 1.0。<ol>
<li>なら OD600に下げるサブカルチャーの光学密度は高く、文化に達する外径 φ600まで新鮮なメディアと待機 0.3 を = = 0.6-1。</li>
	</ol>
</li>
	<li>室温で 10 分間、ベンチトップ遠心分離機で 3,000 x gでアグロバクテリウム文化の 1 mL を遠心します。</li>
	<li>ピペットで上澄みを除去し、抗生物質なし YEB 培の 1 mL の細胞を再懸濁します。抗生物質の完全な除去を確実にこの手順を繰り返します。<ol>
<li>A. 根頭がんしゅ病菌変形のための最後の再懸濁の OD600の最後の光学密度を得るため適切な YEB ボリュームを追加 = 0.8。</li>
	</ol>
</li>
	<li>感染植物の準備しながら氷の上の細胞を保ちます。</li>
</ol>2. 植物の変換のための材料
<ol><li>頂または滅菌体外ジャガイモ植物 (ドナー); から補助芽を含むいずれか 1 つまたは 2 つのノード幹挿し木を作る3 〜 4 週間 (図 1 a 図 2 a) の鍋の固体 2 ms 培地でそれらを育てます。</li>
</ol>3. A. 体の獲得(図 1) を使用して変換を植える
注: この手順は、変換された毛状根の取得できます。導入遺伝子の発現を評価、否定的な制御が必要です。ネガティブ コントロールを準備するには、変形されてないか変換マーカー遺伝子を含む空のベクターで形質転換体の A. 獲得ひずみを用いた手順に従います。
<ol><li>新鮮なメディア プレートを使用します。また、プレートは、メディアの脱水症状を避けるために透明フィルムで密閉蓋側を上、4 ° C で保存することができます。正方形のメディア版を準備するには、傾斜それら ~ 15 °、MS、40 mL で塗りつぶし、固めるみましょう。これは培地の植物の地上部との接触を最小限に抑えます。</li>
	<li>120 mm × 120 mm の正方形のプレートに 2 ms 培地からのドナー工場転送非常に慎重に。</li>
	<li>手術針を使用してa. 体の獲得文化の 1 つの茎節 3 μ L に注入し、可能な場合は別の節で工場に 2 回それを繰り返します。 注: 独立した変換イベント (図 1 b) としてそれぞれの注入を検討してください。</li>
	<li>すぐに全体の植物に転送正方形板 0.1 mM acetosyringone を添加した固体の MS 培地で。プレート当たり 2 工場に対応します。 注: 1 M acetosyringone 原液 DMSO の準備は、-20 ° C で保存することができます。</li>
	<li>サージカル テープを使用してプレートをシールし、4 日間成長キャビネット内部それを縦方向に整列します。</li>
	<li>A. 体の獲得を殺すためにセフォタキシム ナトリウム [500 μ g/mL] を添加した MS 培地と新しい正方形のプレートに工場を移転します。</li>
	<li>10-12 日後毛状根は (図 1、1 D) を表示する開始されます。植物のネイティブ ルーツを切除し、セフォタキシム ナトリウム [500 μ g/mL] を添加した MS 培地と新しい正方形のプレートに工場を移転します。 注: 変換された毛状根は下流変換マーカー (図 3 D) を使用する場合、赤い蛍光性でチェックできます。</li>
	<li>複合植物 (図 1E) を得るためには、セフォタキシム ナトリウム [500 μ g/mL] を添加した MS 培地で 3-4 週間の成長形質の毛状根を聞かせて (媒体毎週に変更)。</li>
	<li>目的に応じて、以下の通りトランスジェニック毛状根と負のコントロールを反映します。<ol>
<li>養液栽培 (表 S2) または地盤に大規模な開発を行うために全体の複合工場を移転します。</li>
		<li>個別に変換された毛状根を繁殖させるメスを使用して赤い蛍光変換マーカー (下流蛋白質) を表現する根をカット長さ 4-8 cm (図 1E) は、彼らのと Gamborg B5 固体培地をシャーレに移して2% ショ糖とセフォタキシム ナトリウム [500 μ g/mL] を補充しました。プラスチック研究所映画でプレートを密封し、20 ° C で暗闇の中でそれらを育てる 注: 装備 (材料表参照) 無菌条件下で蛍光を検出する顕微鏡の下で根を操作できます。</li>
		<li>バイオマス (すなわち、遺伝子発現解析)、5 cm 長い毛状根をカットし、Gamborg B5 液体培 2% ショ糖とセフォタキシム ナトリウム [500 μ g/mL] の 20 mL と 150 mL の三角フラスコに伝達します。20 の ° C および 60 rpm で暗闇の中で 6 週間の成長します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3.jpg"> A. 体の獲得を用いたトランスジェニックの毛状根のポテトを取得する図 1: タイムライン。変換プロセスは、毛状根を成長する後続の手順の各段階に到達する累積的な週間が表示されます。さまざまな段階の代表的なイメージが描かれている: A. 体の獲得(B)、増殖性の形成を注入することにより植物の (A)、その後、感染症を植物体外3 週齢を使用してプロセスの開始新たな毛状根 (D) と組織 (C矢印) と開発した毛状根の赤い蛍光変換マーカーした DsRed (E) を表現します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
4. A. 根頭がんしゅ病菌(図 2) を使用して変換を植える
注: この手順は、変換された植物の取得できます。遺伝子の効果の評価、否定的な制御が必要です。1 つは、空のベクターに変換するA. 根頭がんしゅ病菌を使用して手順を実行することです。また、野生型の植物が使用できます。
<ol><li>切断し、ペトリ皿で (図 2 a) の 3-4 週齢植物から葉を置きます。メスを使って、葉柄を除外し、(図 2 b) それらを切断を回避するエッジに葉の中心から横カット (葉のサイズによって 1-3) を加えます。</li>
	<li>すぐを背軸側のペトリ皿に液体メディア新鮮な 2 ms の 10 mL に浮かぶ葉っぱを置き、プレートを閉じる。収容最大 15 ステップ葉品種デジレと 25 は、ssp の葉 (葉のサイズ) によってndigenaを繰り返します。</li>
	<li>すぐに OD600 A. 根頭がんしゅ病菌文化 80 μ L を追加 = 液体媒体で 0.8 と細菌のソリューションを配布する 1 分の手動でプレートをホモジナイズしてください。</li>
	<li>慎重にフィルムをシールで封印、アルミ箔でカバー、発生変換させる 24 の ° C で商工会議所で 2 日間孵化させなさい。</li>
	<li>CIM 媒体 (図 2 b) まで背軸側を保つ葉を転送し、キャビネットの成長で 1 週間それらを孵化させなさい。<ol>
<li>ピンセットで CIM 媒体をこすり、葉がより良いメディアに対応できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SIM 培地 (図 2) まで背軸側を保つ葉を転送し、キャビネット、さわやかな媒体ごとの 7-10 日、シュートが約 2 センチまで成長にそれらをインキュベートします。<ol>
<li>葉はメディアに完全に囲まれて ことができますように、ピンセットで SIM 培地をこすり。浮上の芽が蓋に達したら、背の高いペトリ皿で動作 (100 × 20 mm、高さ × 直径)。 注: 6-7 週間 (図 2 e) 後 SIM 培地 (図 2 D) とシュートで 2-3 週間後、カルスが形成されます。撮影は、独立した傷から形成されたカルスから現れるときに独立した変換イベントとみなされます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 カット撮影 (同じ変換イベントを考慮) 各カルスから現れた (図 2 e) MG 培地で培養フラスコにそれらはようにセフォタキシム ナトリウム 250 mg/L を添加した転送数とサブセットのラベル、応援とキャビネット、3-4 週間または撮影が活発 (図 2 f) まで成長で孵化させなさい。 注: シュートをカットするときルートを形成しないそれ以外のカルスを削除もします。<ol>
<li>独立した線が必要な回数だけステップを繰り返します。5 の異なる変形までさまざまなイベントから植物は混合されていない完全な自信で動作する 8 cm の直径を持つ培養用フラスコにイベントを配置できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各イベントの最も活発な植物を選択、3-4 節で撮影の頂のセグメントをカット、セフォタキシム ナトリウム 250 mg/L と 2 ms 培が新しい培養用フラスコにそれを置きます。 植物が効率的に成長する 3-6 週間で注: 積極的なシュートと根の開発。<ol>
<li>戻す商工会議所非選択シュート選択植物が完全に開発されるまで。</li>
	</ol>
</li>
	<li>少なくとも 1 つの節、頂芽の植物から幹セグメントをカットし、セフォタキシム [250 mg/L] 新しい 2 ms 培に転送。キャビネットの成長にそれらを孵化させなさい。<ol>
<li>3-4 週間ごとにレプリケート生体外の変換ラインを確立します。 注: セフォタキシム ナトリウムは殺す必要がある 2 ms 中少なくとも 3 つの後続の転送でことを確認A. 根頭がんしゅ病菌;その後、 a. 根頭がんしゅ病菌の増殖が見られる場合メディアに転送植物再度 2 ms セフォタキシム ナトリウムを添加しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>植物の表現型を特徴付けるための完全のキャラクタリゼーションのための土またはルート検査用養液栽培植物を転送します。<ol>
<li>塊茎伝播し、確立したラインを維持する土壌で生産を続けます。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig2.jpg"> 図 2: ジャガイモを取得するタイムラインの変形A. 根頭がんしゅ病菌を用いた植物。変換プロセスは、植物を育てるための以降の手順の各段階に到達する累積的な週間が表示されます。さまざまな段階の代表的なイメージが描かれている: (A) 3 週間の古い培養植物から葉のプロセスを使用して開始、CIM メディア (B)、葉への転送時に葉の負傷者と感染の転送SIM メディア (C)、SIM メディア (D)、SIM メディア (E)、9-11 週間後シュート形成と MG メディア (F) への転勤後撮影で 2-3 週間後に負傷した領域の周りのカルスの可視化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
5. 水耕栽培
<ol><li>半分の力川砂の準備 (0.5 x) (表 S2) 10 L バケツに。</li>
	<li>均質性と適切な酸素条件を維持するために水槽のポンプを浸します。</li>
	<li>暗いところで根を成長するアルミ箔でバケツの壁をカバーしてください。</li>
	<li>養液栽培植物体外に転送ルート損傷を避けます。 注: は、慎重に水に浸漬根を揺することによって潜伏中の微生物増殖を避けるために根からあらゆる残りの in vitro媒体を削除します。</li>
	<li>十分な順化し成長の商工会議所で孵化させなさい温室のような透明なフィルムが付いている植物をカバーしてください。</li>
	<li>3 日後、フィルムの穴を作る、後 1 週間完全に取り外します。</li>
	<li>新鮮なメディア 10 日ごとに置き換えます。</li>
</ol>6ガス化学レポーター遺伝子アッセイ。
注: 我々 の場合、ガス分析が 2-3 週間水耕栽培や体外で栽培の根で実行されていました。
<ol><li>冷蔵 90% アセトン (v/v) で根を修正し、氷の上 20 分インキュベートします。</li>
	<li>蒸留水洗浄 2 つを実行します。</li>
	<li>新鮮な GUS 染色液 (表 1) を追加し、真空を適用 (-70 Pa) 20 分。</li>
	<li>37 ° c 4 h または青の色が表示されるまでの感光性のガスを保護するために暗闇の中で孵化させなさい。 注: フェリ ・ フェロシアン化ガスのソリューションの存在反応生成物の拡散を最小限に抑えるためより正確なローカライズを提供します。 注意: ヒューム フードを使用して、GUS ソリューション (フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム) の有毒なシアン化合物誘導体を処理するときは、防護服を着用します。ガス基板と廃棄物は安全に破棄されなければなりません。</li>
	<li>GUS 染色液を削除し、適切なコンテナーに破棄します。</li>
	<li>エタノール 70% (v/v) と 2 つの洗浄を実行します。</li>
	<li>明視野顕微鏡下で観察します。 注: GUS 染色は安定して数週間です。ただし、最初の週の間にガス信号は明らかですし、隣接するセルに以下を拡散させます。長期保管のためチューブをシールし、4 ° C で保存</li>
</ol><img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59119/59119tbl1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> 表 1:GUS 染色ソリューション レシピ。

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<li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+maize+%28Zea+mays+L.%29+mediated+by+Agrobacteriumtumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).</li>
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</ol>

著者はある利益相反を開示します。

ジャガイモ, 安定した完全な遺伝子組換え植物を取得する最も一般的なシステムは、外因性のホルモンを使用して器官を必要とアグロバクテリウム菌株によって変換を使用します。アグロバクテリウムによるプロトコル非 T DNA ベクター シーケンス25を統合する潜在性があるが、この方法は、まだ最も、安価バレイショを変換できます。A. 体の獲得に関心最後年の間に-仲介された変換は、 A. 根頭がんしゅ病菌を使用してよりも短い期間で遺伝子ルーツを取得できるようにして研究者の注意を持っています。A. 体の獲得はまだ植物ホルモンのオーキシン制御とサイトカイニン合成酵素をコードする遺伝子のセットを運ぶルート誘導 (Ri) プラスミドを保持され、26は監督のエンコーディングします。Ri T-DNA はホストのゲノム DNA に挿入されると、新しいホルモンのバランス欠ける新興感染症27の時点での毛状根と呼ばれる増殖の根の形成を誘導する...

経済的利益は別として遺伝子組換え植物の世代は、独自の関連性研究遺伝子の究極の機能を示すため、植物生理学と開発を理解します。最も広く法植物 DNA の挿入はアグロバクテリウム-変換を介した。アグロバクテリウムは、その腫瘍を誘発する (Ti) プラスミドの作用によって多くの植物種の感染組織におけるクラウン苛立つを生成することです。プラスミドには、植物ゲノムに組み込まれる予定、組織分化1,2を誘発する遺伝子のセットを持つ T DNA 領域が含まれています。遺伝子による T DNA 内でこれらの遺伝子の交換は表現型効果3を回避する特定の植物の変更の生成を許可しています。T DNA へのクローニング遺伝子のため、Ti プラスミドの遺伝子の残り中のバイナリのプラスミドと呼ばれる独立したプラスミドの DNA 領域が削除されて (T-DNA 転送と挿入メカニズムを許可する病原性遺伝子) がされています。ヘルパー プラスミドに配置されます。A. 根頭がんしゅ病菌による変換は、植物バイオ テクノロジー研究、いくつかの利点: それは高価な装置を必要としない、安定性と過渡工場変換とコピーに統合されている遺伝子の低い数字の両方を生成することができる、染色体4。ただし、ほとんどの植物がないシロイヌナズナ,安定形質転換細胞の生成に単一または外因性ホルモンは、骨の折れる、時間がかかり、このプロセスを作るを使用して少数の細胞からの植物体再生が必要です。A. 体の獲得は植物ゲノムを変更することができます毛状根や不定根 (Ri) のルート誘導プラスミド5でエンコードされたrol (根軌跡) 遺伝子の発現による感染部位での生産します。A. 根頭がんしゅ病菌より少ないが、 A. 体の獲得も遺伝子ルーツを取得する使用されます。この場合、 a. 体の獲得には、2 番目 T-DNA 遺伝子を運ぶとで Ri プラスミドとバイナリのプラスミッドの T-DNA 元にはが含まれています。感染サイトが茎や胚軸、野生型撮影から新興新しい毛深い遺伝子ルーツを持つ、複合植物が得られます。また、変換された毛状根育つことが自律的体外炭素ソース入力メディアで。A. 根頭がんしゅ病菌遺伝子組換え組織を生成するのではなくa. 体の獲得の使用は植物体再生は必須ではありません、それ故にそれはより速くより少なく高価なためルートに標的臓器と関連性を得ています。以前の研究は、ルート特定の遺伝子6,7,8,9表現型特性の充当方法論を実証しています。
塊茎はビタミンの良いソースであることの人間の消費のための栄養の関連性を持っているので、じゃがいも (ジャガイモ) は食糧および農業機構の国際連合 (FAO) によれば、世界で第 4 最も重要な作物やミネラル。そのため、ジャガイモは、農業バイオ テクノロジーのスポット ライトに置かれているし、遺伝と発達の良い生体モデルの研究10,11としてまた考慮されます。ジャガイモの変換は遺伝子の特徴を基になる suberized 組織スベリンに関与し、生合成12,13,14 をワックスの分子機構の理解に貢献 ,,1516,17、スベリン モノマーのトランスポート18と転写調節の19。FHT、スベリン フェルロイル トランスフェラーゼ遺伝子はこれらの特徴生合成遺伝子の 1 つそのダウンレギュレーションがスベリン型フェルラ酸エステルの強い減少やジャガイモ塊茎14ワックスと相関周皮の保護の強い障害を生じさせる。付随して、根およびシロイヌナズナの種子は、その推定の細胞 (ASFT/RWP1) のノックアウトもスベリン20,21アルキル ferulates の生産に於いての役割を示した。ジャガイモ、 FHT転写記者行と FHT 抗体を示したプロモーター活性およびタンパク質、外皮、内皮細胞は、一層誘導体と傷ついた組織15に位置して.
この作品は、 a. 体の獲得を使用して野生型撮影で保持されている遺伝子組換えの毛状根を生成する、複合ジャガイモ植物の生成や体外の自律的成長を摘出プロトコルを詳しく説明します。A. 根頭がんしゅ病菌を使用して完全なトランスジェニックバレイショを取得するプロトコルもあります。事例研究としてA. 体の獲得とA. 根頭がんしゅ病菌と同じバイナリ ベクトル変換は、 GUSレポーター遺伝子発現を運転FHTプロモーターと根を取得する使用されます。結果報告し、比較します。

<table><tbody><tr><td> アセトン </td><td> Panreac </td><td> 1.310.071.21 </td><td></td></tr><tr><td> アセトシリンゴン </td><td> Acros </td><td> 115540050 </td><td></td></tr><tr><td> アクアリウムポンプ </td><td> Prodac </td><td> MP350 </td><td></td></tr><tr><td> オートクレーブ </td><td>Ragpa Strelimatic </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Bacteriological agar </td><td> Lab Conda </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> BAP </td><td> Duchefa </td><td> B0904 </td><td></td></tr><tr><td> 牛肉抽出物 </td><td> Lab Conda </td><td> 1700 </td><td></td></tr><tr><td> 植物栽培キャビネット </td><td> Nuaire </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> カルベニシリン </td><td> Duchefa </td><td> C0109 </td><td></td></tr><tr><td> セフォタキシムナトリウム </td><td> Duchefa </td><td> C0111 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Merck </td><td> 1029310161 </td><td></td></tr><tr><td> Ecotron infors </td><td> HT </td><td> 29378 </td><td></td></tr><tr><td> エタノール </td><td> Merck </td><td> 1,009,831,011 </td><td></td></tr><tr><td> Falcon tube </td><td> Control tecnica </td><td> CFT011500 </td><td></td></tr><tr><td> フェリシアネート </td><td> Sigma </td><td> 101001081 </td><td></td></tr><tr><td> フェロシアネート </td><td> Sigma </td><td> 100979088 </td><td></td></tr><tr><td> フラスコ(直径8.06cm、高さ11.3cm)、in vitro培養用プラスチック蓋 </td><td> Apiglass </td><td> ref16 </td><td></td></tr><tr><td> GA3 </td><td> Sigma </td><td> G7645 </td><td></td></tr><tr><td> Gamborg B5 media </td><td> Duchefa </td><td> G0210 </td><td></td></tr><tr><td> Gelrite </td><td> Duchefa < </td><td>p>G1101 </td><td></td></tr><tr><td> グルコーサ </td><td> Sigma< </td><td> p>G5767 </td><td></td></tr><tr><td> カナマイシン </td><td> Sigma </td><td> K1377 </td><td></td></tr><tr><td> ロイコポールテープ </td><td> BSN ロイコポリ </td><td> BDF47467 </td><td></td></tr><tr><td> ルーペ </td><td> Wild-Heerbrugg </td><td> M420 </td><td></td></tr><tr><td> マグネティックシェーカー </td><td> Agimatic </td><td> 7000243 </td><td></td></tr><tr><td> MES水和物 </td><td> Sigma </td><td> M2933-25G </td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Panreac </td><td> 131404 </td><td></td></tr><tr><td> 顕微鏡 </td><td> オリンパス </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Minufugue遠心分離機 5415R </td><td> エッペンドルフ </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> 村重・スクーグ培地 </td><td> Duchefa </td><td> M0254.0050 </td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td> Panreac </td><td> 131679 </td><td></td></tr><tr><td> NAA </td><td> Duchefa </td><td> N0903 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Panreac </td><td> 131659 </td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td> Sigma </td><td> 58282 < </td><td></td></tr><tr><td> p>NightSea Stereo< </td><td> p>SFA Moonting Adapter </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm < </td><td>p>Anorsa </td><td> PRFL-001-001 </td><td></td></tr><tr><td> Peptone < </td><td> p>Lab Conda </td><td> 1616 </td><td></td></tr><tr><td> ペトリ皿 (90 x 14) </td><td> Anorsa </td><td> 200200 </td><td></td></tr><tr><td> pHmetre </td><td> Crison < </td><td>p> </td><td></td></tr><tr><td> Phytotron </td><td> Inkoa </td><td> RFTI-R5485 </td><td></td></tr><tr><td> 植物寒天 </td><td> Duchefa </td><td> P1001 </td><td></td></tr><tr><td> Refrigeratot </td><td> Liebherr Medline </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Rifampicin </td><td> Duchefa </td><td> R0146< </td><td></td></tr><tr><td> p>Spectinomycin </td><td> Sigma </td><td> 59007 </td><td></td></tr><tr><td> 分光光度計 </td><td> 島津 </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> 角板 (120 x 120) </td><td> Deltalab < </td><td>p>200204 </td><td></td></tr><tr><td> ストレプトマイシン </td><td> Sigma </td><td> S6501 </td><td></td></tr><tr><td> スクロース </td><td> Panreac </td><td> 131621 </td><td></td></tr><tr><td> 外科用ブレード </td><td> スワン・モートン </td><td> 201 </td><td></td></tr><tr><td> 手術針 </td><td> NIPRO </td><td> 015/0204 </td><td></td></tr><tr><td> Triptone </td><td> Lab Conda </td><td> 1612 </td><td></td></tr><tr><td> Triton </td><td> Serva </td><td> 37240 </td><td></td></tr><tr><td> Unimax 1010 シェーカー </td><td> ハイドルフ </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> 真空 </td><td> Dinko </td><td> < </td><td></td></tr><tr><td> p>x-GlcA (5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-β-D-グルクロン酸、無水ナトリウム塩) </td><td> Biosynth </td><td> B-7398 </td><td></td></tr><tr><td> 酵母抽出物 </td><td> Lab Conda </td><td> 1702.00 </td><td></td></tr><tr><td> Zeatin riboside </td><td> Sigma<td> > 1001042850 </td><td></td></tr></tbody></table>

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと gus 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

アグロバクテリウムの sp は、転送および独自の T-DNA を植物のゲノムに統合する能力があり、形質転換植物を得る最も広く使用されている方法の一つです。ここでは、遺伝子組み換えポテト (ジャガイモ) 植物を変更する 2 つの変換システムを提案する.A. 根頭がんしゅ病菌の変換で葉が感染している、変換されたセルが選択されて、新しい完全な形質転換体が 18 週間でホルモンを使用して再生成されます。A. 体の獲得変換で茎は針で細菌を注入することにより感染している、新登場の変換された毛状根は赤い蛍光マーカーを使用して検出されます、非変形の根が削除されます。5-6 週間で得られた植物は完全に開発された変換された毛状根と野生型撮影のコンポジットです。バイオマスの増加に変換された毛状根は摘出し、自己反映できます。我々 は両方アグロバクテリウム-仲介された変換方法スベリン生合成遺伝子プロモーターによるGUSレポーター遺伝子を表現する根を取得するを適用されます。GUS 染色手順は、プロモーター発現誘導の細胞局在化をことができます。両方の方法で変換したバレイショの根を示した GUS GUS 活性 suberized 内皮、外皮、およびさらに、 A. 体の獲得変換根を染色も根の出現で検出されました。A. 体の獲得が根に表現される遺伝子を研究する高速代替ツールをすることができますが示唆されました。

サツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモ変換を介した
本稿では、手順A. 体の獲得と変換されたルートを取得するように設定が表示されます。図 1は、完全 (完全に開発された毛状根を取得するA. 体の獲得の注射) から 5-6 週間くらいは、プロシージャの概要を示します。その後、工場は複合材料 (野生型撮影、トランスジェニック ルート) や遺伝子組換えの毛状根クローンを切除し、2% のショ糖を添加した固体の Gamborg B5 培地の自律的に成長することができます学ぶことができます。また、毛状根超伝播できる液体 Gamborg B5 メディアを使用しています。示す手順は、 s. ニラ属性臭素疹(品種デジレ) で行われています。
<p ...

ここでは、ジャガイモを変換する 2 つのプロトコルを提案する.サツマイモネコブセンチュウ生成トランスジェニック植物毛状根自己伝達することができます野生型撮影アグロバクテリウム変換完了形質転換植物に します。我々 は、ガス変換された根の染色によるプロモーター活性を検出します。

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

アグロバクテリウム媒介性の形質転換は、遺伝子組み換えジャガイモ植物を作り出す簡単な方法である。特定の遺伝子機能と臓器生理学への貢献を理解するために。アグロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換は、遺伝子機能根を迅速に評価するための堅牢なツールであり、同様の結果がアグロバクテリウム・トゥメファシエンによる形質転換によって得られる。この手順をデモンストレーションするには、ポストドクターのサンドラ・フェルナンデス=ピナンと、私たちの研究室のmaste5rの学生であるジェニファー・ロペスです。1回のアグロバクテリウムコロニーを5ミリリットルの酵母エキススープ(YEB培地)で一晩で成長させることから始め、50ミリリットルの遠心分離管で抗生物質を28°C、毎分200回転で補う。タメファシエンス変換の場合は、翌朝の光学密度を測定します。600ナノメートルで光学密度、またはOD600が0.6対1に達すると、遠心分離1ミリリットルの農業用細菌培養液培養液を抗生物質なしで1ミリリットルの新鮮なYEB培地で再懸濁する。2回目の洗浄後、抗生物質を使わずに新鮮なYEB培地中のペレットを再懸濁し、適切な濃度にして0.8の最終OD600を得、細菌細胞を氷の上に置く。A.rhizogenesを用いた植物の形質転換のために、ドナー植物を2MS培地培養から120×120ミリメートル平方プレートに慎重に移し、外科用針を用いて、A.rhyzogenes培養物から異なる茎間節に3マイクロリットルを注入する。その後、すぐに0.1ミリモルアセトシリンギロンを補充固体MS培地を含む新しい正方形のプレートに植物全体を転送します。同じプレートに第2の植物を配置した後、同じ方法で変換し、外科用テープでプレートを密封し、4日間成長キャビネットの中にプレートを垂直に置きます。植物をセフォタキシムナトリウムを添加した正方形のプレートに移し、A.rhizogenesを殺し、密封されたプレートを成長キャビネットの中に垂直に4日間置きます。10~12日後、新しい毛深い根が現れます。それらの変換は、蛍光ステレオ顕微鏡によって確認することができる。このとき、各植物の天然根を切除し、植物をMS培地で新しい正方形プレートに移し、セフォタキシムナトリウムを添加してA.rhizogenesを殺す。複合植物を得るために、トランスジェニック毛状根をMS培地でさらに3〜4週間成長させ、セフォタキシムナトリウムを添加する。A.tumefaciensを使用した植物の変換のため。生後3~4週間の植物の葉をシャーレに切って置き、メスを使って葉の中央から端まで1~3回横切りします。そしてペチオールを除外する。すぐに新鮮な2MS液体媒体の10ミリリットルを含むシャーレに葉を置き、腹立ち側を上に、プレートを覆います。A.tumefaciens培養液を80マイクロリットル素早く液体培地に加え、1分間穏やかに攪拌して細菌溶液を均質に分配します。その後、慎重にシールし、24度の摂氏室で2日間のインキュベーションのためのアルミニウム箔でプレートをカバー。変態期間の終わりに、葉を腹軸側に移し、無神経誘導媒体に、成長キャビネット内で1週間のインキュベーションのためにピンセットで削った。インキュベーションの終わりに、葉を移し、腹軸側を上に、ツイーザー掻き取りシュート誘導媒体に、成長キャビネットに葉をインキュベートする。出現したシュートが約2センチメートルの高さである場合、各無神経から3つの新興シュートをカットします。発根を可能にするためにセフォタキシムナトリウムを添加したMG培地を含む個々の培養フラスコに最大5つの異なるシュート変換イベントを配置し、シュートが活発になるまで成長キャビネット内の3〜4週間のインキュベーションのためにサブセットに適切なラベルを付けます。インキュベーションの最後に、各事象の最も活発な植物を選択し、各プラントから3〜4つのノード間でシュートの素端セグメントを切断します。セフォタキシムナトリウムを添加した2MS培地を含む培養フラスコにセグメントを入れ、活発なシュートと根を発達させるまで植物を栽培します。β-グルクロニダーゼまたはGUSの化学レポーター遺伝子アッセイを実行するには、氷上で20分間、90%チルドアセトンで2〜3週間のインビトロ植物培養から根を固定します。固定の終わりに、蒸留水で根を2回洗い、20分間真空下で新鮮なGUS染色液で根を処理します。真空処理の終わりに、約4時間暗闇の中で37°Cの根を置きます。青色が見える場合は、70%エタノールで2回根を洗い、明るいフィールド顕微鏡で染色を可視化します。形質転換された毛状根は緑色光で照らされると赤色の花色を呈し、陰性対照未形化の農細菌はこのような蛍光を示さないが、トランスジェニック毛根を同定するためのDS赤色変換マーカーの適合性を示す。ここで、A.tumefaciensおよびA.rhizogenesにより得られたトランスジェニック毛状根によって得られたトランスジェニック植物の根におけるGUS染色が示されている。観察されるように、Aで形質転換した根、トゥメファシエンス、およびインビトロで成長し、皮質とsteleの間の細胞層である内皮における青色染色を示す。より発達した根では、青色のラベルは、エキソデルミに対応する外部層にパッチリである。A.rhizogenesによって得られた形質転換された毛深い根において、そして水耕栽培で成長したGUSマーカーは、特に損傷した領域およびエキソデルミの内側根の出現において内皮内に位置する。迅速な方法であることに加えて、アグロバクテリウム・リゾゲネスで得られたトランスジェニック・ルーツは、根を誘発するプラスミドからDNAを運び、直接制御されたプロセスの一部を調節解除する可能性がある。アグロバクテリウム・リゾゲネスで得られたトランスジェニック毛状の根は、撮影中に維持することができますが、代わりに大規模なトランジット生産のためにインビトロに伝播されるまでオンサイトにすることができます。ジャガイモの変換は、遺伝子機能とプロモーター活性化をチェックし、また高い農業性関心の種で方法論的ルールを生成するための良いツールを提供します。遺伝子組み換え生物は、環境汚染を避けるために使用後に安全に廃棄する必要があります。また、ガス溶液は有毒シアン化物誘導体を含むので、保護を着用し、溶液を安全に廃棄する。

agrobacterium-tumefaciens-agrobacterium-rhizogenes-mediated

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