Name: 主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学ぶ、活性化ヒトCD4陽性T細胞を用いた低ミトコンドリアDNA汚染ATAC-seq法。新規溶解バッファーによりミトコンドリアDNAを50%から3%以下に低減し、シーケンスコストを50%削減する高品質な染色質アクセシビリティ解析を実現する。

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この改良されたプロトコルは、データ解析 (図 1) による全血の原料から cd4 陽性リンパ球の ATAC seq を実行するための手順を説明します。
1. 全血からの cd 4 + T 細胞の分離
注:このプロトコルのための開始材料は研究の要件に基づいて選択する開始材料の源の標準手続きを使用して収集した新鮮な全血の 15 mL です。必要に応じて、プロトコルをスケールします。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 2% ウシ胎仔血清 (FCS) 部屋の温度 (RT) をあらかじめ暖かいし、cd4 陽性 T 細胞濃縮手順を開始する前に RT する遠心分離機を調整します。
<ol><li>50 mL コニカル チューブにおける全血 15 mL に人間 cd 4 + T 細胞濃縮カクテル 750 μ L を追加、逆転で軽く混ぜます。室温で 20 分間インキュベートします。培養が完了したときは、チューブに 15 mL の PBS + 2% の FCS を追加、インバージョンによる軽く混ぜます。</li>
	<li>密度媒体の 15 mL と 50 mL の新鮮な円錐管を準備します。慎重に層形成密度媒体/血インターフェイスを混乱しないように確認して密度媒体の上に希釈した血液サンプル。設定 1 を降順のブレーキの加速gと RT × 1,200 で 20 分間遠心します。 注:加速度を 1 と密度培地で細胞層の混乱を避けるために遠心分離機にオフ ブレーキを降順に設定するが重要です。</li>
	<li>狭い幹転送ピペットを使用して密度媒体/プラズマ インターフェイスから豊かな cd4 陽性 T 細胞を収集します。新鮮な 50 mL の円錐管に集められたセルを転送します。Gおよび RT x 423 で 8 分間収集した cd4 陽性 T 細胞を遠心分離します。 注:手順 1.3 とすべて次の手順のために 9 と下降ブレーキに遠心加速度を返すことを確認します。</li>
	<li>上澄みを廃棄、PBS + 2% の FCS の 50 mL の 2 回細胞ペレットを洗浄、最終的な上澄み 423 x gで RT。 破棄 8 分間遠心分離を洗浄し、2 ml の PBS + 2% の FCS の洗浄細胞ペレットを中断します。</li>
	<li>診断を使用してセルをカウントします。ATAC seq を続行するには、2.3 の手順に進みます。後で処理のための細胞を凍結するには、1.6 をステップに進みます。</li>
	<li>新鮮な凍結媒体 (90% の FCS + 10% ジメチルスルホキシド) 100 万セルごとの 1 つの mL を追加します。中低温安全管の凍結細胞の分注 1 mL。遅い凍結コンテナーで一晩-80 ° c 管を配置します。次の日は、長期保存用液体窒素にチューブを転送します。 注: 100 万の cd4 陽性 T 細胞は元全血量の 2 mL あたり隔離されます。凍結培地 1 mL 因数で 500,000 セルをフリーズします。使用するたびに新鮮な凍結媒体を作る。</li>
</ol>2. アクティブにし、cd 4 + T 細胞を浄化
注:48 h なり、95%、活性化 cd 4 + T 細胞を活性化し、cd4 陽性 T 細胞のみを浄化のこの急速なプロトコルが必要です。プロトコルを開始する前に、4 ° C に遠心分離機をクールします。
<ol><li>氷が溶けるだけまで、37 ° C の水浴中の cd4 陽性 T 細胞の 1 バイアル (500,000) を解凍します。優しく細胞を予め温めておいたロズウェル パーク記念研究所-1640 年 (RPMI 1640 年) 培地 10 %fcs、完全な RPMI として以下の 9 mL を含む 15 mL の円錐管に転送します。 注: セル DMSO への暴露を避けるために完全に雪解けてはいけないです。</li>
	<li>1500 x gと 4 ° C で 6 分間遠心上澄みを廃棄し、優しく完全 RPMI 2 mL にペレットを中断します。下回転を繰り返す、上澄みを廃棄し、優しく完全 RPMI 0.5 ml を中断します。</li>
	<li>診断を使用してセルをカウントします。細胞懸濁液 200 μ L/96 ウェル丸底プレートのウェルに 50,000 の細胞をプレートに完全な RPMI の密度を調整します。 注:1 から 500 K cd4 陽性 T 細胞、50,000 の cd4 陽性 T 細胞を 200 μ L/ウェルのプレート 10 井戸の管を凍結します。</li>
	<li>
人間の T 活性化抗 CD28 と抗 CD3 抗体で共役磁気ビーズを準備します。
	<ol>
<li>1.5 mL チューブに ATAC seq サンプルあたり人間 T 活性化 CD3/CD28 ビーズの分注 12.5 μ。1 ml の 1x PBS のビーズを洗浄し、1 分のための磁石にチューブを配置します。</li>
		<li>慎重に削除しクリアの上澄みを廃棄、磁石からチューブを削除および 13 でビーズを中断 μ L は、ATAC seq サンプルあたり RPMI を完了します。 注: は、処理されている ATAC seq サンプルの数に基づいて必要なビーズの量を計算します。このプロトコルでは、12.5 μ あたり 500,000 細胞 CD3/CD28 ビーズ ATAC seq サンプルを 1 つを構成する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cd4 陽性 T 細胞をアクティブにします。15 mL の円錐管に完全 RPMI 培地の 2.1 mL の 500,000 の細胞を収集し、事前洗浄人間 T 活性化ビーズの 12.5 μ L を追加します。チューブを反転で優しく混ぜます。</li>
	<li>優しくビーズと細胞を滅菌タンクとプレート 200 μ L/マルチ チャンネル ピペットを使用して丸底 96 ウェル プレートのウェルのビーズでセルに転送します。48 h 37 ° C、5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>423 x gと/ウェルの 96 ウェル プレート、ビーズの損失がないように破棄する前に円錐形の管にそれを収集から媒体のルート削除 100 μ L で 8 分の 96 ウェル プレートを遠心分離機、インキュベーションを投稿します。残り 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁します、1.5 mL チューブのすべてを収集します。 注:活性化 T 細胞の 10 の井戸は、1 mL のボリュームで収集されます。</li>
	<li>Cd 4 + の分離を実行します。完全な RPMI の 1 mL の 500,000 セルに中古洗浄共役 CD4 ビーズの 50 μ L を追加します。ピペットによってビーズと細胞を結合します。冷蔵庫の中に 4 ° C で 20 分間インキュベートします。ビーズと混合セル 6 分毎を揺り動かしなさい。 注:このプロトコルは 500,000 のセルの 1 つのサンプルに使用します。50万の 2 つ以上のサンプルを必要に応じて調整します。</li>
	<li>孵化が完了したら、2 分を削除、クリア時の上澄みを廃棄、磁石にチューブを置きます。磁石からチューブを削除する、1 mL の PBS + 2% の FCS のビード区切セルの中断、1 分のための磁石にチューブを取り付け、明確な上清を廃棄してビード区切細胞を洗浄します。3 洗浄の合計のためのこのプロセスを繰り返します。 注:洗浄中に、ビーズを破棄しないように注意します。</li>
	<li>最終的な洗浄の後 1 分削除のための磁石にチューブを配置、上澄みを廃棄し、氷の上にペレットを配置します。3 (ATAC seq) に進みます。</li>
</ol>3. ATAC seq
注:この手順では、核は、atac 試験シーケンスの活性化 cd4 陽性 T 細胞から分離このプロトコルで使用する換散バッファーはより効率的な消化と質の高い成果の結果、核で穏やかに改善されました。4 ° C で維持固定角度の遠心分離機のセクション 3 ですべての遠心分離手順を実行します。プロトコルを開始する前に、遠心分離機をクールします。
<ol><li>核の分離を実行します。ビーズと冷たい換散バッファー (トリス-HCl、pH 7.4 では、10 mM の NaCl、3 mM MgCl2、0.03% ポリソルベート 20 10 mM) で細胞を再懸濁します。すぐに 4 ° C で 10 分間 500 × gで遠心します。削除し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>転移反応を行います。Tn5 トランスポザーゼ ミックス (表 1) の 50 μ L で隔離された核ペレットを中断します。完了の 4 ° C で 40 ° C のふた付きの 37 ° C で 30 分間たちで孵化させなさい。</li>
	<li>熱サイクル後、すぐにダウン クイック ベンチトップ遠心分離機スピンを実行し、製品からビーズを削除する 1 分のための磁石にチューブを配置します。</li>
	<li>DNA 精製カラムをチューブから磁石上の明確な上澄みを転送します。列バッファー PB の 250 μ L で 1 回と 2 回バッファー PE の 750 μ L を洗います。溶出バッファーの 10 μ L のサンプルを溶出します。3.5 の手順に進みます。 注:この手順は、結紮のアダプターは、ここで ATAC seq ライブラリというと DNA のフラグメントを増幅します。NGS 片側一車線上で実行するいくつかの ATAC seq ライブラリを多重化するためにすべてのサンプルの個々 のサンプル (表 2) の異なるインデックス付きプライマー 2 インデックス プライマー 1 を使用します。プライマーは、1.25 μ M の濃度の作業で使用されます。</li>
	<li>ヌクレアーゼ フリー PCR チューブ、順序で指定したボリュームのコンポーネントを組み合わせることで初期の PCR 増幅反応を表 3.PCR チューブをたちに置き、表 4に指定したとサイクリング条件で PCR 増幅プログラムを実行します。</li>
	<li>
QPCR による反応を監視します。ヌクレアーゼ フリー PCR チューブ、順序および表 5 に指定された量のコンポーネントを組み合わせることで qPCR 反応を設定します。QPCR 機械・ サイクルで指定した表 6 としての場所。
	<ol>
<li>残り 45 μ L 反応サイクル追加の増幅の最適な数を調べるには、x 軸と y 軸に相対的な蛍光 (RFU) にサイクル数をプロットを作成します。最適な追加の増幅サイクル数は、高原に到達する qPCR 反応にかかるサイクル数の 3 分の 1 です。 注: は qPCR による反応をモニタリング PCR サイクル GC コンテンツとサイズ バイアスを最小限に抑えながら最適なライブラリ フラグメントの増幅を取得するための最適な数を決定するためにことができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR の反作用の残り 45 μ L の最終的な PCR 増幅を完了します。たちに戻ってステップ 3.5 から増幅反応と PCR チューブを置き、テーブル 7で説明したように、プログラムを実行します。 注:サンプルはこのプロトコルで記述されているように処理、12 に最適な総 PCR 増幅サイクル数を求めた。</li>
	<li>増幅の完了後、次の製造元のプロトコル、25 μ L の溶出バッファーで溶出 PCR クリーンアップ キットを使用してライブラリを浄化します。 注:増幅されたライブラリを 48 h までの 4 ° C で保存または長期保管のための-20 ° C で凍結できます。</li>
</ol>4. ATAC seq ライブラリの品質分析
注:次世代シーケンスの前に ATAC seq ライブラリの量と質を検証することが重要です。ライブラリの量と質は、市販キット (材料の表を参照) を使用して評価する必要があります。
<ol><li>マイクロ ベースのプラットフォームを使用してサイズ変更、定量化および DNA の品質管理のため ATAC seq ライブラリの量と質を評価します。代表的な品質評価の結果は、図 2を参照してください。 注:ATAC seq ライブラリの集中する必要があります > 1 ng/μ L 品質シーケンス処理の結果を取得します。平均、30 日 25 μ L で nM が得られました。</li>
</ol>5. シーケンス データ解析
注:この解析パイプラインでは、手順のマッピングの読み取りの品質を制御し、実験的なデザインの座標を調整する下流解析のためのピークを呼び出すことができます。コマンド行と実行の説明を次に示します。データ分析パッケージ (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq) で可能です。
<ol><li>サンプルあたり 4200 万読み取りの平均読み取り深度に次世代シーケンサーに準備されたライブラリをシーケンスします。</li>
	<li>コマンドを使用して FastQC12ソフトウェア パッケージによって生成されたファイルを確認することによって配列読み取りの品質を推定します。 fastqc -o < output_directory >< fastq_file ></li>
	<li>コマンドを使用して、FastQC 品質チェックによって決定される、必要な場合に Trimmomatic13ソフトウェアによって読み取りの拠点をトリム (のペア終了)。 java-jar ファイル < trimmomatic jar ファイルへのパス > < input1 >< PE input2 >< ペア output1 >< 不対 output1 >< ペア output2 >< 不対 output2 > HEADCROP: < トリミング拠点 ></li>
	<li>Bowtie214ソフトウェアによって人間の参照ゲノム (hg38) に対する読み取りを配置します。 bowtie2 - x < 参照ゲノム >-1 < 入力ペア 1 >< 入力ペア 2 > S < 出力 SAM ファイル > 注:引数 x は参照ゲノムのインデックスのベース、サム形式出力の -S です。</li>
	<li>Samtools15 flagstat パッケージを使用してマップされたリードの質を確認します。 samtools flagstat < BAM ファイル ></li>
	<li>マップされた読み取りファイルを並べ替えるし、ピカード16ツールを使用して重複の削除します。 java-jar picard.jar SortSam 入力 = < 入力 SAM ファイル名 > 出力 = < 出力をソート BAM ファイル名 > 並べ替え順序 = 座標」と「java-jar picard.jar MarkDuplicates 入力 = < 並べ替えられた BAM ファイル > 出力 = < 出力 BAM ファイル重複なし >REMOVE_DUPLICATES = TRUE</li>
	<li>インデックス BAM ファイル未使用染色体の読み取りをトリミングし、ATAC seq17の実験のための座標のシフトします。 java の jar picard.jar BuildBamIndex 入力 = < BAM ファイル > samtools idxstats < 入力 BAM ファイル > |カット -f 1 |grep-v 詳細 |grep-v いる |grep-v chrUn |xargs samtools -b < 入力 BAM ファイル >>< を表示出力は、BAM ファイルをトリミングされます > bedtools bamtobed -i < 入力トリム BAM ファイル >>< 出力トリミング ベッド ファイル > awk ' 開始 {OFS ="\t"};{場合 ($6 = =「+」) 印刷 $1、$2 + 4、$3 + 4、$4、$5、$6; 他印刷 $1、$2-5、$3-5、$4、$5、$6}' < 入力トリム ベッド ファイル >< トリム シフト ベッド ファイル ></li>
	<li>負の協調にシフトされて読み取りを削除します。 awk '{if ($2 > 0) 印刷 $1"\t"$2"\t"$3"\t"$4"\t"5 ドル"\t"$6}' < ファイル入力ベッド >< 出力非負調整ベッド ファイル >。</li>
	<li>ベッド ファイルを次の DiffBind18分析用の BAM ファイルに変換します。 bedtools bedtobam-i < 入力ベッド ファイル >-g < 参照ゲノム >< 出力 BAM ファイル ></li>
	<li>ピーク呼び出しを実行 DiffBind18ソフトウェア パッケージによって。 macs2 callpeak -t < 入力 BAM ファイル >-f BAM g hs - nomodel-nolambda - 維持 dup すべて呼び出しサミット-outdir < 出力ディレクトリ パス > n < 出力名 > B-q 0.01 - bdg - シフト-100 - extsize 200 注:フィルタ リング後、3700 万読み取りサンプルごとの中央値を予想します。ミトコンドリア DNA 汚染 0.30%-5.39% (平均 1.96%) からの範囲です。乗算マップリード (平均 6.7%-56%、19%) の率が低い、核使用の比較的高い割合 (60%-92%、平均 79%) を読み取ります。</li>
</ol>

<ol><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li>
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<li>Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq%3A+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li>
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<li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
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</ol>

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この記事で紹介した修正の ATAC seq プロトコルは、最小限のミトコンドリア DNA 汚染で再現性のある結果を提供します。人間プライマリ PBMCs10、ひと単球 (未発表) マウス樹状細胞のクロマチン アーキテクチャの特性し、培養メラノーマ細胞線11正常にプロトコルが使用されています。この改良の換散を見込んで条件他のセルタイプのために働く可能性があります。それはまたこの核の隔離のプロトコルが単一核 ATAC seq プロトコル、シーケンス処理の結果を改善するために、ミトコンドリアの DNA 汚染を最小限に抑えることと互換性があることが予想されます。
この修正されたプロトコルの追加の利点は、患者サンプルの可用性に応じて異なる時点で PBMCs から孤立した cd4 陽性 T 細胞のバッチを凍結する能力です。すべてのサンプルに合わせて ATAC seq が同時に実行されることができます、潜在的なバッチ効果バイアス トランスポザーゼ反応とシーケンスは最小<sup class="xref"...

トランスポザーゼ アクセス クロマチン (ATAC seq) をシーケンス用急速にクロマチン アーキテクチャを尋問のため主要な方法となっています。ATAC seq は tagmentation、断片化、シーケンスが全ゲノムにわたってクロマチン アクセシビリティを判断できますライブラリを生成する、同じ酵素によって DNA のタグ付けのプロセスを介してアクセス可能なクロマチン領域を識別できます。この tagmentation プロセスは、のみ nucleosomic 立体障害によるクロマチンの開いている領域をカット非常に活発の Tn5 トランスポサーゼによって媒介されます。それはカット、Tn5 トランスポザーゼはまたを可能にする PCR による迅速なライブラリ構築およびゲノムワイド アクセス クロマチン1,2次世代シーケンス シーケンス アダプターを挿入します。
ATAC seq クロマチン アクセシビリティ比較的単純で高速なプロトコル、品質とその結果、および開始に必要な材料の少量から判断できる情報の範囲のための領域を特定する最寄りの方法となっています。MNase seq4 (オープン ゲノム領域のヌクレオソームの位置が決まります)、(これはまたゲノム クロマチン接近性を測定) DNase seq3と比較して、ホルムアルデヒドを介した FAIRE seq5、ATAC seq はより速く、安く、そして再現性1。また、出発の数として DNase seq3に必要な 5000 万の核と比較して 500 の核物質の使用より敏感です。ATAC seq クロマチン アーキテクチャの詳細については、転写因子結合、ヌクレオソームの配置、クロマチン領域1の地域を含む他の方法よりもを提供することがあります。効果的な単一セルの ATAC seq プロトコルが検証されて、単一細胞レベル6,7クロマチン アーキテクチャに関する情報の提供します。
ATAC seq はクロマチン アーキテクチャを特徴づける植物8人間9、および他の多くの有機体を含む研究と細胞のタイプの広い範囲にわたって使用されています。また病気状態7のエピジェネティック制御を識別するに重要だった。しかし、最も広く使用されている ATAC seq プロトコルには、ミトコンドリア DNA から汚染シーケンス読み込みの主な欠点が含まれています。一部のデータ セットでこの汚染レベルは配列結果1の 60% と高いすることができます。ATAC seq7,10,11のより効率的なアプリケーションを可能にするためにこれらの汚染のミトコンドリアの読み取りを削減するフィールドに協調された努力があります。ご紹介わずか 3% にミトコンドリアの DNA 混入率を減らす向上の ATAC seq プロトコル シーケンス コスト10で約 50% の削減をできるようにします。これはミトコンドリアの DNA 汚染を最小限に抑える重要な改善の換散バッファーと活性化 cd 4 + リンパ球の隔離の合理化されたプロセスによって可能です。
この modifiedATAC seq プロトコルは、初代培養細胞、ひとの主な末梢血単核球 (PBMCs)10、人間の主要な球 (未発表) マウス樹状細胞などの広い範囲で検証されています。要素の非コード11クラスター化定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) 画面の悪性黒色腫細胞を尋問する正常にそれ使用されているも。さらに、このプロトコルで記述されている、GitHub 上で提供されるデータ分析パッケージは、ATAC seq データを分析するツールと新しいと経験豊富な研究者を提供します。ATAC seq クロマチン接近性を全体のゲノム全体マップに最も効果的な試金、ここで紹介されている既存のプロトコルに変更になります低のミトコンドリア DNA 汚染と高品質なデータを生成する研究者シーケンス処理のコストを削減し、ATAC seq のスループットの向上します。

<table><tbody><tr><td>1x PBS、滅菌済み</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>5810/5810&nbsp;R Swing Bucket 50 mL、15 mL、1.5 mLチューブバケット付き冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td>他の同等の製品を使用することができます。</td></tr><tr><td>96ウェル丸底プレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>163320</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>Agilent 4200テープステーションシステム</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>品質評価に推奨されます。</td></tr><tr><td>クライオチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>374081</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>Dynabeads ヒト T-アクチベーター CD3/CD28</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11131D</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>Dynabeads 手つかずのヒト CD4 T 細胞キット</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11346D</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>ダイナマグネット</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>12321D</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>他の同等のものを使用できますプロダクツ。</td></tr><tr><td>高感度DNAキット</td><td>アジレント</td><td>50674626</td><td>品質評価に推奨されます。</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム、六水和物、分子生物学グレード</td><td>シグマ</td><td>M2393</td>他の<td>同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>NaCl、分子生物学グレード</td><td>シグマ</td><td>S3014</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>Nextera DNA ライブラリ調製キット (2x TD バッファー、Tn5 酵素)</td><td>Illumina</td><td>FC1211030</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー 滅菌 dH20</td><td>Gibco</td><td>10977015</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>ポリソルベート20(Tween20)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>プレシジョンウォーターバス</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>品質評価に推奨されます。</td></tr><tr><td>Qubit FlouroMeter</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q33226</td><td>品質評価に推奨されます。</td></tr><tr><td>ロゼット Sep Human CD4+ Density Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>ロゼット Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15022</td><td>クリティカルコンポーネント</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>滅菌済み Resevoir</td><td>Thermo Scientific</td><td>8096-11</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>T100 サーモサイクラー 加熱蓋付き</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>他の同等の製品を使用できます。</td></tr></tbody></table>

主なヒト cd4 陽性 t リンパ球から低ミトコンドリア dna 汚染 atac seq 試金

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC seq ゲノムワイド アクセス クロマチンのマッピングへの迅速かつ簡単なアプローチによるエピジェネティクスの研究で広く使われている方法論となっています。本稿ではミトコンドリア DNA の読み取りを汚染を減らす向上の ATAC seq プロトコルを提案する.以前の ATAC seq プロトコルに苦労している間ミトコンドリア DNA の汚染 50% の平均を読み取ると、この議定書で導入された最適化された換散バッファー 3% の平均にミトコンドリア DNA の汚染を軽減します。この改良の ATAC seq プロトコルは、シーケンシング コストに近い 50% 削減できます。データの分析を通じて全血からの cd 4 + リンパ球の隔離からのステップバイ ステップの手順を提供する活性化 cd4 リンパ球からこれらの高品質の ATAC seq ライブラリを準備できる方法を紹介します。改良されたこの ATAC seq プロトコルは細胞のタイプの広い範囲で検証されている、クロマチン接近性を勉強して研究者にすぐに使用されます。

新鮮な全血の 15 mL からは、このプロトコルは 100 万の cd4 陽性 T 細胞の平均を生成します。これらは、後で処理するため冷凍またはすぐに使用できます。新鮮なまたは解凍、cd 4 + T 細胞の生存率は一貫して &gt; 95%。Cd4 陽性 T 細胞分離のこの方法は、柔軟性、ソースの材料とコレクションの時間この改良の ATAC seq プロトコル シーケンスの 1 ng/μ L を超える最後のライブラリを生成します。市販のシステムを用いて品質管理は、200 〜 1000 bp (図 2) との間の DNA のフラグメントを示す必要があります。シーケンスは、高品質ライブラリでのみ実行してください。
すべてのライブラリは、4000 万サンプルあたりを読む以上の平均深さに配列されました。ミトコンドリア DNA 配列読み取り1合計の 50%...

ここでは、活性化 cd4 人間リンパ球を (ATAC seq) をシーケンス処理トランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイを実行するプロトコルを提案します。プロトコルは、新しい換散バッファーの導入により 3% に 50% からミトコンドリア DNA の読み取りの汚染を最小限に変更されています。

主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

この改変ATAC-seqプロトコルは、ミトコンドリアの汚染読み取りを50%から3%未満に減少させる新しいリシスバッファーを導入し、ミトコンドリア汚染の減少により、研究者はシーケンシングコストの50%減少でより効率的なATAC-seqを実行することができます。我々は、ヒトの一次PBMC、ヒト一次単球、マウス樹状細胞、および黒色腫細胞株におけるこの新しいATAC-seqプロトコルを検証した。幅広い細胞種に効果があると考えています。ATAC-seqを使用して高品質の結果を得るためには、細胞の活性化および選択プロセス中のサンプル損失を最小限に抑えることは重要です。基本的な実験装置を用いて、貴重なサンプルから少数の細胞を扱う方法を実演します。まず、氷が溶けるまで、以前に単離されたCD4+T細胞のバイアルを37°Cの水浴で解凍します。その後、細胞を9ミリリットルの完全RPMIを含む15ミリリットルの円錐管にそっと移します。細胞を1、500倍G、摂氏4度で6分間遠心分離する。その後、上清を捨て、完全なRPMIの2ミリリットルにペレットを穏やかに再懸濁する。遠心分離を繰り返した後、上清を捨て、完全なRPMIの0.5ミリリットルで細胞を穏やかに再懸濁する。細胞を数えるために、ヘモサイトメーターを使用してください。完全なRPMIを使用して、96ウェルの丸底プレートのウェルあたり200マイクロリットルの50,000 CD4+セルに細胞懸濁密度を調整します。次いで、磁気ビーズを調製し、1.5ミリリットルチューブに対して1.5ミリリットルのチューブに対して、ヒトT-アクティベーターCD3/CD28ビーズのアリコート12.5マイクロリットルをATAC-seqサンプルに調製した。1倍のPBSをチューブに1ミリリットル加え、磁石の上に1分間置いてビーズを洗います。清澄上清を慎重に取り出して捨て、マグネットからチューブを取り出します。ATAC-seqサンプル当たり完全なRPMIの13マイクロリットルでビーズを再懸濁します。調整された濃度でCD4+T細胞を活性化するには、15ミリリットルの円錐管に完全なRPMI培地の2.1ミリリットルで500,000細胞を集める。12.5マイクロリットルのヒトT-アクティベータービーズを追加し、前のステップで調製して洗浄し、チューブを反転して穏やかに混合します。その後、ビーズで細胞を滅菌貯蔵所に静かに移します。マルチチャネルピペットを使用して、ラウンドボトム96ウェルプレートのウェルあたりビーズを含む200マイクロリットルのセルをプレートし、37°C、5%CO2インキュベーターで48時間インキュベーターします。完全なインキュベーションの後、423倍Gでプレートを遠心分離し、室温を8分間処理する。各ウェルから100マイクロリットルの培地を取り出し、ビーズの損失を確認するために、廃棄する前に円錐形のチューブに集めます。次に、培地の残りの100マイクロリットルの細胞ペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのチューブにすべてを集める。CD4+細胞を単離するには、完全なRPMIの1ミリリットルで500,000個の細胞にあらかじめ洗浄されたCD4コンジュゲートビーズ50マイクロリットルを加え、反転して混合します。摂氏4度で20分間インキュベートし、6分ごとに手でフリックして混ぜます。上清がはっきりするまでチューブをマグネットに2分間置き、取り出して捨てます。マグネットからチューブを取り外します。ビーズ結合細胞をPBSの1ミリリットルに加えて2%FCSで再懸濁して洗浄し、チューブを磁石に1分間戻します。透明な上清を捨て、このプロセスを合計3回の打ち上げに繰り返します。最後の洗浄の後、マグネットにチューブを1分間置きます。それを取り除き、上清を捨て、ペレットを氷の上に置きます。次に、核単離を行うために、50マイクロリットルの冷たいリシスバッファーでビーズおよび細胞を再懸濁し、遠心分離機を500G、摂氏4度で直ちに10分間再懸濁する。上清を取り除き、捨てます。トランスポザーゼ反応を行うために、分離された核ペレットを50マイクロリットルのTn5トランスポザーゼミックスで再懸濁する。サーモサイクラーで摂氏37度で30分間インキュベートし、蓋を摂氏40度に設定し、完成したら摂氏4度で保持します。サーモサイクリングの直後に、素早いベンチトップ遠心分離機のスピンダウンを行います。チューブをマグネットに1分間置き、ビーズを製品から取り除きます。マグネットからチューブを取り外さずに、透明な上清をDNA精製カラムに移します。250マイクロリットルのPBバッファーでカラムを1回洗浄し、750マイクロリットルのPEバッファーで2回洗浄します。その後、溶出バッファーの 10 マイクロリットルを追加して、サンプルを溶出します。ヌクレアーゼを含まない PCR チューブに初期 PCR 増幅反応を設定します。PCR チューブをサーモサイクラーに入れ、PCR 増幅プログラムを実行します。次に、原稿に記載されているように、残りの45マイクロリットルのPCR反応の最終的なPCR増幅を完了する。PCR チューブをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。完全な増幅後、PCRクリーンアップキットを使用してライブラリを浄化し、メーカーのプロトコルに従い、溶出バッファーの25マイクロリットルで溶出します。サンプルごとに平均読み取り深さ 4,200 万読み込みまで、次世代シーケンサー上の準備済みライブラリをシーケンスします。この改良されたATAC-seqプロトコルは、シーケンシング用にマイクロリットル当たり1ナノグラム以上の最終ライブラリを生成した。品質管理は、200と1,000塩基対の間のDNA断片を示し、さらにシーケンシングは、これらの高品質のライブラリで行われました。このプロトコルに従って作製されたライブラリーは、わずか3%ミトコンドリア汚染を示した。使用できる読み取りの高い割合は、生物学的複製全体で十分に一定です。このプロトコルは、生物学的複製だけでなく、技術的な複製全体にわたって非常に再現性の高い結果を提供しました。さらに、このプロトコルは、前述のように1週間以上ではなく48時間かかり、再現可能なシーケンスの結果によって示されるように、一貫した効率的な活性化をもたらしました。さらに、予測されたATAC-seqピークは、分析パイプラインによって正確に呼び出されました。シーケンシング結果分析は、ヒトT細胞活性化中のクロマチン状態の明確な変化を明らかにした。開いたクロマチンの差動可能な領域は、活性化の前と48時間後の6つのサンプルの間で同定された。核の回収を最大限にするため、核の反応を冷やされた試薬と材料で行ってください。当社の修飾核リシスバッファーは、細胞に優しく、ミトコンドリアDNAの汚染を最小限に抑えます。この改変されたライシスバッファーが単核ATAC-seqにも適用されることを楽しみにしています。このプロトコルは、研究者がコストを削減して高品質のATAC-seqデータを生成し、エピジェネティック分野を前進させるのに役立つことを知っています。このプロトコルは簡単で迅速で、危険な試薬や機器を必要としないため、ATAC-seqに新しい人にとっては簡単にアクセスできます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

高スループット シーケンス (seq ATAC) と相まってトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、アクセス可能なクロマチンを明らかにするゲノム広い方法です。これは最終的な計算の分析は、人間のリンパ球 (Th1 ・ Th2) 用に最適化する分子からのステップバイ ステップ ATAC seq...

ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

ここで同時に量的に従うメソッドとアルカリ加水分解とその後 5´ エンド ゲノム DNA の酵素の開裂を組み合わせて単一ヌクレオチド分解能で高度そのまま DNA...

同時マッピングとヒトのミトコンドリア DNA のリボヌクレオチドの定量

代謝適応は、分化、持続性、および細胞毒性を決定するため、T細胞にとって基本的である。ここでは、サイトカイン分化型ヒト初代T細胞の エクスビボ でミトコンドリア呼吸をモニタリングするための最適化されたプロトコールが提示される。...

サイトカイン分化型ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング

ここでは、単一細胞における絶対ミトコンドリア(mt)DNAコピー数とmtDNA欠失ヘテロプラスミーレベルを測定するためのプロトコルを紹介します。...

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語)

ATAC-seqは、多動変異トランスポザーゼTn5を使用して、転写因子によって媒介されるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングするDNAシーケンシング法です。ATAC-seqは、がん細胞の表現型変化の根底にある分子メカニズムの発見を可能にします。このプロトコルは、がん細胞を含む上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順の概要を示しています。...

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

パイロシーケンシングアッセイは、ヘテロプラズマ細胞または組織におけるミトコンドリアDNA一塩基多型の堅牢かつ迅速なジェノタイピングを可能にします。...

パイロシークエンシングによるミトコンドリアゲノムの一塩基多型のジェノタイピング

このプロトコルは、腫瘍形成プロセスにおけるミトコンドリアの役割を研究するためのツールとして、浮遊増殖癌細胞からサイブリッドを生成するための技術について説明しています。...

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

mtDNAの合成と分布を検出および定量するためのマルチウェルプレートフォーマットおよび自動免疫蛍光イメージングを使用して、細胞内のミトコンドリアDNA(mtDNA)代謝のダイナミクスを研究する手順について説明します。これはさらに、mtDNA代謝に対するさまざまな阻害剤、細胞ストレス、および遺伝子サイレンシングの影響を調べるために使用できます。...

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

ナイーブおよびエフェクターCD8 T細胞のミトコンドリア機能の測定

免疫細胞の生理学的に関連する基質濃度の下でミトコンドリアの生体エネルギーを研究する方法は限られています。私たちは、高分解能蛍光肺活量測定法を使用して、ヒトT細胞、単球、および末梢単核細胞のエネルギー需要に対するミトコンドリア膜電位の応答の変化を評価する詳細なプロトコルを提供します。...

ヒト免疫細胞におけるミトコンドリア膜電位の動的変化を評価するための高分解能蛍光スパイロメトリー

この原稿では、マウスの骨髄から好中球のATAC-seqライブラリーを調製するためのプロトコルを概説し、最適な好中球の生存率と高いライブラリー品質を保証することを目的としています。BMCの調製、免疫磁気ソーティング、およびライブラリ構築に関するステップバイステップの説明を提供し、特に好中球の研究に新規参入する人にとって貴重なガイドとして機能します。...

マウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製

学ぶ、活性化ヒトCD4陽性T細胞を用いた低ミトコンドリアDNA汚染ATAC-seq法。新規溶解バッファーによりミトコンドリアDNAを50%から3%以下に低減し、シーケンスコストを50%削減する高品質な染色質アクセシビリティ解析を実現する。

主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

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