フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。
2019年2月12日
プロトコルでは、小さな細胞小胞 (EV) の表面の抗原を検出する細胞培養上清を使用のために設計された再現可能な方法について説明します。それは、CD63 と CD81 CD9、表面抗原を認識する抗体が結合したビーズを用いた特定の EV 免疫沈降を利用しています。メソッドは、下流の流れフローサイトメトリー分析に最適です。
細胞外小胞は、多くの分野で診断バイオマーカーおよび潜在的な治療ツールとしてますます使用されています。フローサイトメトリクスは、スーツ直面マーカーによって特徴付けるための最も簡単な前方分析方法であり、このプロトコルは、アスサイズ粒子の分析に使用することができ、高速であり、特別な設定や専用の機器を必要とせずに従来の地震計に適用可能です。このプロトコルは、前記の状態および媒体から細胞外小胞を分類するために使用されるが、それは患者の侵襲的な組織生検を置き換えるために、血液到着したAVの分類に向けて拡大することができる。
このプロトコルに新しい研究者にとって、セットアップ方法セクションに記載されている手順を実行し、PBSで02%ブタの皮膚ゼラチンで55センチメートル平方のペトリ皿をコーティングすることで始まる実証された取得戦略に密接に従うことが重要です。15分後、イコーブの修飾されたダルベッコ培地(IMDM)の7ミリリットルの各皿に皿とプレートを4.4回10回洗浄し、20%の胎児性ウシ血清を添加し、1%ペニシリンとレンサプトマイシンを37°Cで孵化させます。細胞が約80%の合流度に達したら、カルシウムとマグネシウムを使わずにダルベッコのPBSで培養液を2回洗浄し、10ミリレターの血清遊離エキソソーム産生培地で細胞を供給する。
7日後、各プレートからコンディショションされた培地を、単一のポリプロピレン遠心分離管にプールし、培地を遠心分離して、任意の細胞の破片を除去する。スーパーナテントを100キロダルトン遠心分離フィルターチューブに移し、クリア、コンディショニング、追加の遠心分離を伴う培地を濃縮する。濃縮物をマイクロ遠心管に移して最終的なベンチトップ遠心分離を行い、スーパーナテントをポリカーボネート厚い壁のマイクロ遠心分離管に加えます。
3.2ミリエーターの最終容積にPBSでチューブを充填し、チタン固定天使ローターにサンプルをロードします。次にローターを卓上超遠心分離機に積み込み、新鮮なPBSを100マイクロリットルで再懸濁します。ナノ粒子追跡および分析定量のために、PBSの999マイクロリットルで、超遠心サンプルの1マイクロリットルを希釈し、泡なしで1ミリリットルシリンジにサンプルをロードする。
検査室の入口口に注射器を積み込み、レーザーをオンにします。キャプチャボタンを使用してカメラを開き、フォーカスを調整します。次に、それぞれ60秒の少なくとも3つの異なるフレームを記録し、ソフトウェアのバッチ処理オプションを使用して、3つの異なる取得を分析します。
サンプルを取得するために準備するために、まず適切な実験的モノクローナル抗体結合捕捉ビーズを1:1比で加え、マイクロ遠心管に、そして得られた捕獲ビードプールをボルテックスする。次に、適切な量のサンプルを1マイクロリットルの捕獲ビードプールに加え、8粒子に10倍10を生成し、試験濃度あたり5番目のビーズに1.2倍の10を加えた。マイナスコントロールとしてビーズとラベル付けされたチューブに1マイクロリットルのビーズを加え、新鮮なPBSで各チューブの体積を100マイクロリットルに調整します。
その後、1分間に400回転、摂氏4~10°Cで一晩、サーモミキサーにチューブを入れます。翌日、サンプルをラウンドボトム96ウェルプレートに移し、適切な蛍光共役抗体を各ウェルに加える。摂氏4~10度で1時間のインキュベーションを行った後、各井戸に100マイクロリットルのPBSを加え、取得ソフトウェアを開きます。
サイトメーターとシステム起動プログラムを選択して、計器を起動し、新しい実験を開きます。実験テンプレートを作成し、プレートを選択してプレートを追加します。プレート上のサンプルの位置を選択し、サンプルとして設定をクリックします。
命名規則にサンプル名を入力し、チャネルタブを開き、適切な蛍光信号チャネルを選択します。今度は、プレートを機器にロードします。そして、ドットプロットをクリックして、新しい前方散乱領域対側面散乱領域ドットプロットを作成します。
初期化を選択してレーザーと流体を開始し、[実行]をクリックして取得を開始します。前方散布図と側散布図の中間に母集団を表示するようにスケールを調整し、サンプル母集団全体の周囲にビーズゲートを描画して破片を除外します。[ストップ]および[ドット プロット]をクリックして、前方散乱高さと前方散乱領域ドットプロットを作成し、ビーズの母集団にサンプルをゲートします。
より大きな集団の周りに新しいゲートを描き、Singletsという名前を付け、ドットプロットをクリックして、使用した実験的なフルオロフォアごとに1つの蛍光信号対側散乱領域ドットプロットを作成します。シングルの新しいドットプロットをゲートします。次に、記録するイベントの数を選択し、レコードを選択して、実験的な取得を開始します。
解析の最後に、取得ファイルを適切な解析ソフトウェアにロードし、新しいプロトコルを開きます。ちょうど示したように、各ファイルのドット プロットを作成し、すべての散布軸を線形スケールに、すべてのフローレス軸をログ スケールに設定します。次に、関連するシグナルチャネルにおける蛍光幾何平均を示し、平均蛍光強度の全変化を、異なる細胞外小胞調製物において計算する。
異なる条件をテストして細胞外小胞の最小総量を平均蛍光強度曲線の初期指数相に到達するように設定した後、最小粒子数は染色ごとに8粒子に10倍であると判断した。非特異性抗体結合を伴わない最高シグナルを達成するために10〜8粒子の抗体の最適濃度は、抗CD9_FITCおよび抗CD63_PE抗体の両方に対して1ミリリットル当たり10マイクログラム、抗体CD81_PE抗体に対して5マイクログラムであると判断した。この方法の適合性を確認するために、膜内の破片ではなく、カップ状の細胞外小胞を分析するために、細胞外小胞を超音波処理し、平均蛍光強度の減少をもたらし、わずか30秒の超音波処理の後、機械的破壊の1分後に全く蛍光が検出されなかった。
示されているように心臓前駆細胞からのX自身の精製は、細胞外小胞を生み出し、両方の細胞集団から低レベルのCD9およびCD63およびCD81の高レベルを発現する。さらに、X自身の表面マーカーは超遠心分離なしで明確に識別可能であるが、この濃縮ステップは、これらのマーカーの平均の蛍光強度を大幅に高める。細胞外小胞を扱う場合、より不注意なナノ粒子ペレットが簡単に見逃すことができます。
したがって、プロトコルで示されているように、すべての手順に従う必要があります。細胞外小胞をバイオマーカーとして使用することは、現在最も新しい分野研究の1つです。そして、すぐに、代替スクリーニングツールとして使用される臨床診断に翻訳されてもよい。
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概要
このプロトコルは、細胞培養上清を使用して小型細胞外小胞（EV）の表面エピトープを検出するための再現可能な方法を説明しています。この方法は、抗体結合ビーズを用いた特定のEV免疫沈降を用いて、フローサイトメトリ分析用に最適化された表面抗原CD9、CD63、およびCD81を特定します。
主要な研究構成要素
研究領域
- 細胞外小胞（EV）
- 診断バイオマーカー
- 細胞培養技術
背景
- EVは重要な診断ツールとして浮上しています。
- フローサイトメトリはEVの特徴付けを行う簡単な分析方法を提供します。
- このプロトコルは様々な生物学的源からのEVの分類を容易にします。
使用された方法
- 特定の抗体を用いた免疫沈降
- 心臓前駆細胞の細胞培養
- 標識されたEVの分析のためのフローサイトメトリ
主要な結果
- この方法はEVの表面マーカーを成功裏に同定し、定量化します。
- 検出のための抗体濃度の最適条件を示します。
- 異なるEV集団を分析するのに適していることが証明されています。
結論
- この研究は非侵襲的にEVを特徴付ける方法を示しています。
- このアプローチは様々な分野における診断と治療開発に重要な意味を持っています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Flow cytometric analysis of extracellular vesicles (EVs) from cell-conditioned media enables semi-quantitative, high-throughput profiling of EV surface antigens, supporting early-stage biomarker discovery and mechanistic de-risking. This approach provides scalable, reproducible data on vesicle populations, facilitating confident target validation and translational continuity across discovery and preclinical pipelines. The method's compatibility with conventional flow cytometers enhances accessibility and enterprise-wide adoption for EV-based research initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV surface marker expression to clarify cellular communication pathways.
- Supports biological de-risking by distinguishing intact vesicles from membrane debris through sonication controls.
- Provides quantitative MFI data to inform predictive confidence in target selection and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated EV samples for downstream phenotypic or biomarker assays.
- Standardizes assay conditions using antibody-conjugated beads and defined particle counts for reproducibility.
- Delivers scalable, quantitative outputs suitable for screening and comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV marker profiling with emerging translational biomarker strategies for non-invasive diagnostics.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation by supporting robust EV characterization.
- Reduces risk of false positives by confirming specificity for intact vesicles over debris.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust EV marker analysis from cell culture supernatants, supporting both early hypothesis testing and downstream translational research.
- Discovery Biology: Provides quantitative, reproducible EV marker data for hypothesis-driven pathway analysis.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility through standardized bead-based capture and MFI quantification.
- Analytics: Generates linear MFI-concentration correlations and enables statistical comparison of EV populations.
- Translational Research: Supports biomarker alignment for non-invasive diagnostic development when validated in relevant fluids.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly implementable protocol for EV analysis across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV-based target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible EV analysis using widely available instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative EV data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EV-related discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and EV biology for optimal assay setup and interpretation.
- Needs access to conventional flow cytometers and ultracentrifugation equipment for sample preparation.
- Demands cross-team standardization of antibody panels and particle quantification protocols.
- Adaptable to various cell types and biological fluids with appropriate validation.
- Careful handling of nanoparticle pellets is essential to avoid sample loss, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Conditioned Medium Collection and Processing
2:45
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Quantification
3:27
Sample Preparation
4:17
Sample Acquisition and Analysis
6:32
Results: Representative Flow Cytometric Analyses of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Medium
7:58
Conclusion
