Name: 分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ、分裂酵母における成長欠損を緩和する抑制変異を同定するための変異原不使用のハイスループットスクリーニング法。このプロトコルは遺伝的相互作用の理解と疾患関連遺伝子の研究に応用可能です。

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この作業によって、国立科学研究所の一般医療助成金 1R15GM119105-01 K.Z. を受けましたすべての校閲者の洞察力に富んだコメントに感謝いたします。我々 もありがとうジェームズ ・ タッカー、アリシア ・ アンダーソン、エリザベス ブラックとグレン Marrs ディスカッションとコメントこの原稿。

1. 歪みの構築と準備
<ol><li>突然変異や遺伝子 (yfm、あなたのお気に入りの突然変異) の26を前述のように標準のサイト指示された突然変異 (SDM) を使用して削除を生成します。</li>
	<li>画面を開始する前に遺伝的背景をきれいにし、親系統として新鮮な生まれた突然変異細胞を生成する野生型株の突然変異系統を交雑 (最適)。標準的なリッチ メディア プレートの個々 のコロニーに親株を連勝します。プレート リーダーの試金のため目的の変異を持つ 8 から 16 の独立したコロニー (生物的複製) をランダムに選ぶ (3.1 参照)。 注: このプロトコルは、親の系統 (最小限または金持ちや薬物、なしまたは成長欠陥を引き起こす温度変化で) 液体培地における欠陥の成長がある場合にのみ有効です。すべての親系統は半数体およびこうして遺伝的相補的な交配型と他の半数の株と交差することをする必要があります。</li>
</ol>2. プレート リーダー アッセイ
<ol><li>滅菌アプリケータ手順 1.1 (接種開始に必要な正確な金額は文化なし) で作製した植民地のそれぞれの少量を取るし、ポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートに配置。適切な液体メディア (リッチまたは最小限に抑え、薬剤の有無) を 200 μ l 添加の植民地のそれぞれを中断します。同じメディア (電池なし) 200 μ L を含むプレート上のすべての行の空白も含まれます。</li>
	<li>自動マイクロ プレート リーダーに接続プレート リーダー検出ソフトウェアの次のプロトコル実行: 連続高速軌道の振動 (425 cpm、3 mm 振幅) 30 ° C で 24 時間、温度の運動プログラムを設定します。光学密度 600 ナノメートルの波長で光の拡散を測定する光学読み取りし 2 分 (721 総読み取りウェルあたり 24 時間の期間にわたって) 読む頻度でプレートの下から読むことに光を設定します。</li>
	<li>24 h、最後の非光学密度の測定値 (ブランク OD600) を記録し、それぞれの外径にサンプルを希釈するために必要なボリュームを決定する次の数式を使用した後は、0.1 を = します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59133/59133eq1v2.jpg"> 注: プレート リーダー ソフトウェアからデータをエクスポート、バッチに関数を処理する各実験も使用する希釈ボリュームに上記の数式を挿入する表計算ソフトを使用します。</li>
	<li>すべての 24 h 希釈外径を 0 日目として同じメディアを使用してサンプルのそれぞれ 0.1 (約 1.5 倍の 106セル/mL) = 2.3 の手順に記載されている数式を使用して。すべての成長曲線は毎日生成され、増加の成長率は、同じ遺伝的背景を持つコホートの残りの部分よりかなり高く最終的な外径のような成長曲線を判断を示す個々 の植民地を注意してくださいに保存します。野生型コロニー。 注: この試金は通常約 7-14 日間になります。生殖不能の条件の下ですべての手順を実行します。</li>
</ol>3. 各種サプレッサーのコロニーそしてフェノタイプの確認です。
<ol><li>プレート リーダーの試金 (ステップ 2.4) の最後の日、おそらく親の突然変異の表現型を軽減することができますサプレッサー突然変異を得ることによって著しく回復した成長率を持つ液体文化を保存します。転送し、50% のグリセロールの 250 μ L を含む cryotube に 250 μ L の液体培養をミックスします。フラッシュ セルを液体窒素で凍結し、無期限に 80 oc - 系統保存します。</li>
	<li>サプレッサー突然変異遺伝子遺伝的要素であることを確認するため yfm P を渡る標準的な遺伝的交差メソッドを使用して (の親は、ひずみは、プレート リーダー アッセイの初めの使用) yfm S (サプレッサー、ひずみを終了時に保存のためにプレート リーダー アッセイ)。サプレッサー突然変異は遺伝子遺伝的要素場合、 yfm P × yfm S 2 人のコロニー、親株の病気の表現型があるし、2 人のコロニーはサプレッサーの回復成長率を持っているテトラッドを得られるはずひずみ。</li>
	<li>ステップ 3.2 のクロスからサプレッサー表現型 (S ひずみ) と 3 人のコロニーを拾うと同じ遺伝子から親の表現型 (P ひずみ) と 3 人のコロニー (3 の生物レプリケートしますごと) を渡るし、ゲノム DNA の抽出を続行し、シーケンスは、次の手順します。 注: 手順 3.2 と 3.3 は強くお勧めしますが、必須ではありません。また、採集者 3.1 豊富な媒体シングル コロニーに回復された液体文化を広げて、さらに遺伝確認なしの全ゲノム シーケンスの生物をトリプリケートとして 3 人のコロニーをランダムに選択できます 1 つ。この場合、ゲノム配列比較のためには、親株の 3 つの生物学的トリプリケートを使用ください。</li>
</ol>4. ゲノム DNA 抽出、ライブラリ生産およびシーケンス。
<ol><li>Yfm P株あたり 3 つの生物学的複製をランダムに選択 DNA 抽出、ライブラリの準備、およびシーケンス、および 3 つの生物をそれぞれ個別に起こられたyfm S系統遺伝的交雑 (ステップ 3.2) からまたはからの複製のため、プレート S ひずみ (ステップ 3.3 注) のシングル コロニーを取得に広く使われています。</li>
	<li>中間ログ フェーズにリッチ メディアで 10 mL の培養株を成長 (外径 = 0.5-0.8、0.75 – 1.2 × 107セル/mL について)、振動インキュベーターを使用して継続的に 250 rpm で振とうしながら 30 ° C で液体文化を育てると。4 ° c 1000 × gで 5 分間遠心分離によって細胞を収集します。</li>
	<li>DNA 抽出バッファーの 400 μ L の小球形にされたセルを中断 (2% トリトン X-100, 1 %sds、100 mM の NaCl、10 mM-トリスの Cl (pH 8.0)、1 mM ナ2-EDTA)、ガラスビーズの 400 μ L および 25:24:1 フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールの 400 μ L を追加。4 ° C で 2 分間精力的に渦</li>
	<li>数回反転による DNA 抽出バッファーとミックスの追加の 200 μ L を追加します。4 ° C 20,000 × gで 5 分間遠心します。</li>
	<li>きれいな管に水相を転送 RNase A/T1 ミックスの 20 μ g を追加して、15 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>25:24:1 フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール、20,000 × g、4 ° C で 5 分間スピンの等しいボリュームを追加し、水性相をクリーン チューブに転送。</li>
	<li>クロロホルムの等しい量を追加、複数回の反転でミックス、20,000 × g、4 ° C で 5 分間スピンし、クリーン チューブに液相を転送します。</li>
	<li>100% エタノールの 2 つのボリュームに加えて、少なくとも 2 時間、-20 ° C で 3 M NaOAC (pH 4.3) の 10% のボリュームが付いている沈殿物 DNA は 20,000 gとペレットを収集 × 4 ° C で 5 分間、スピンします。</li>
	<li>チルドの 70% エタノール (4 ° C、5 分 20,000 × gで遠心分離) で 2 回ペレット (沈殿させた DNA) を洗って、10 mM Tris バッファー (pH 7.4) の 50 μ L で、ペレットを中断します。</li>
	<li>全ゲノム シーケンス ライブラリを準備する製造元が推奨あたり図書館準備キット (材料の表を参照) を使用します。 注: それは PCR の拡大の中に生成されたエラー変異が最小となる PCR 増幅なしゲノム ライブラリーの構築を可能にするため、材料表に記載されているキットをお勧めします。さらに、ゲノム ライブラリーの準備中にできないようにするためにビーズ ビーズ乾燥 1-2 分に時間を短縮することによって完全に乾燥。</li>
	<li>パラメーターは、ライブラリの準備中にシャーリング、集束超音波発生装置を使用して (材料の表を参照) とデューティー比を 20%、バースト、あたり 200 サイクルで 175 W、ピーク電力に設定と周波数 45 5.5oC に 6 ° C で抜本的なモード s の代わりを使用して、DNA および切断機 chomatin (材料の表を参照) 以下の設定で: 4 パルス モード、15 ° C で 50% 振幅 s オフ 10 分、20 分の合計処理時間と 15 秒。</li>
	<li>注意この手順で使用される有害物質を処理するために不可欠です。NaOAC、エタノール、25:24:1 フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール、クロロホルムを処理するため、適切な安全性データー シートと機関の環境衛生と安全管理室を参照してください。</li>
	<li>得られたゲノム ライブラリーをシーケンスします。全体配列読み取りは、単一のヌクレオチドの範囲で解像度全体のゲノムの少なくとも 3 倍をカバーするべき。ペア終了シーケンス (または最新の技術) をお勧めします。</li>
</ol>5. バイオインフォマティクス解析サプレッサー突然変異の同定
<ol><li>親の間一貫して識別されるゲノムの変更に焦点を当てるバイオインフォマティクス解析を実行し、抑制されたyfm系統すべての生物のレプリケートします。 注: 完全なパイプライン プロセスは、以下に説明が、さらに、プレーン テキストの BASH スクリプト ファイルは、fastq_to_vcf.sh、vcfprocess.sh、VCF のバリアントに読み取りの処理からワークフローの例を表示する補足資料として掲載ファイルと処理や交差点、VCF のファイル、それぞれ。</li>
	<li>トリム ショート リードせん断 (https://github.com/jbpease/shear) 次のコマンド ・ ライン (すべて他オプション既定値) を使用しています。 shear.py - fq1 $FASTQ1 - fq2 out1 $FASTQ2--$OUTFQ1--out2 $OUTFQ2 \ ― ― barcodes1 $BARCODE ― ― プラットフォーム TruSeq - trimqual 20:20 \ -trimpolyat 0 trimambig-filterlength - 50 - filterunpaired</li>
	<li>マップは、BWA v0.7.1527を使用して PomBase (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) から得られたs.pombe参照ゲノム v2.30 に読み取ります。次のコマンドライン (すべて他オプション既定値) を使用します。 bwa mem t 8 $GENOME $OUTFQ1 $OUTFQ2 &gt; $SAM1</li>
	<li>GATK を介して配置 SAM ファイルを置くベスト プラクティスはパイプライン28 GATK v3.629、PicardTools v2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard) および SAMtools v1.3.130を使用してバリアントを呼び出すのためです。次のコマンドラインとパラメーター (すべて他オプション既定値) を使用します。 java-Xmx30g-picard.jar AddOrReplaceReadGroups 入力を jar SAM1 $ を = \ 出力 $BAMMARKED RGID を = = 1 RGLB = lib01 RGPL イルミナを = \ RGPU = $BARCODE RGSM = $SAMPLENUMBER samtools fixmate - O bam $BAMMARKED $BAMFIXED samtools ソート-O bam -o $BAMSORTED -T/home/peasejb/tmp $BAMFIXED samtools インデックス $BAMSORTED java-Xmx30g-GenomeAnalysisTK.jar -T の jar HaplotypeCaller \ -R $GENOME-私の $BAMSORTED - genotyping_mode 発見 \ -stand_emit_conf 10 - 30 stand_call_conf -o $VCFRAW</li>
	<li>タビックスを使用して圧縮およびインデックスの VCF ファイル: bgzip $VCFRAW.vcf タビックス $VCFRAW.vcf.gz</li>
	<li>親の間で VCF ファイルを比較サプレッサー株 BCFtools v1.3.127を使用してシーケンスの複製と。次のコマンドラインとパラメーター (すべて他オプション左のデフォルト) を使用します。 bcftools isec n + 1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \ $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz &gt; common_variants.list 注: このコマンドをもたらした最初突然変異体だけ登場の配列変異すると「000100」、「000010」、「000111」としてすべての 3 つの変異としてのみ 2 番目の変異としてバイナリ エンコード バイナリ パターンでエンコードされたファイルなど。これらのファイルは、親の各セットに対して生成され、変異体は、VCF のファイルをレプリケートします。</li>
	<li>UNIX の grep コマンドを使用して各ラインに追加されますファイル名と共にバリアント交差点リスト ファイルをコンパイルします。 grep"."*.list &gt; all.list</li>
	<li>カスタムの Python スクリプト (variant_characterize.py) を使用して現在の GFF3 アノテーション ファイル (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3) と完全なバリアントのリストを相互参照します。蛋白質のコーディング領域 (同義および非同義)、5 'と 3' の UTRs、ncRNA の一貫した SNP サイトを識別します。 python3 variant_characterize.py - リスト common_variants.list \ -gff schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \ -fasta Schizosaccharomyces_pombe。ASM294v2.30.dna.genome.fa \ -000100 - all.list.filter.000100 アウトのパターン このスクリプトを変更するを繰り返します-パターンと出力ファイルのサフィックス (-うち) バイナリを使用 パターン: 000010、000001、000110 000011、000101、000111</li>
	<li>スプレッドシートとして表示するためのタブ区切りのファイルでこれらのすべてのスクリプト実行からの出力を結合します。亜種の注釈付きのテーブルには背景に対していずれか 1 つまたは両方の突然変異体系統で表示されるものが含まれます。バイナリ フラグ フィールドを示しますいずれかの外観 (000100、000010、000001)、単一の変異株の 2 つの変異株 (000011, 000101, 000110)、またはすべての 3 つの突然変異系統 (000111)。</li>
	<li>親のサンプルが見つかりませんが、1 つ、2 つ、または 3 つの突然変異体サンプルのバリエーションの注釈付きの出力リストを分析します。注釈は、ゲノムの位置と変形 (同義/非同義的コーディング領域、3'/5' UTR、非コーディングなど。) のクラスの両方を示します。候補の突然変異のこのリストから強く関連する候補者の例は一貫してすべての 3 つの系統に現れる非同義コーディング バリアントかもしれません。別の種類の有力な候補の表示近く一緒にしたり、同じ遺伝子内の突然変異系統の非同義または推定の規制突然変異の蓄積になります。</li>
</ol>

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著者には、このメソッドはしない競合する金銭的な利益で使われる楽器の製造業者によって推薦宣言しません。

ここで説明したプロトコルを表します小説と自発的なサプレッサー突然変異分裂酵母 s.pombe における 400 以上の遺伝子の特徴的な表現型の低成長を授与の突然変異の表現型の回復を検出可能なシンプルな画面、多くの部分は機能不明な2,32のまま。以前の方法は、画面の温度感受性突然変異体背景33の原物21の使用または温度シフトの適用を含む微生物のサプレッサー変異する他の方法をとっています。表現型の回復が追加の環境/化学干渉することがなく発生し、最終的に液体で利用できるリソースを引き継ぐ抑制変異の上昇のフィットネスの利点を強調表示対照的に、このプロトコルを示しています文化。この画面をバイパス抑制または相互作用抑制隔離できるelf1∆やfal1∆などの両方の損失の機能突然変異、点突然変異clr6 1, 変異体限りなどの効果があるので液体培養でフィットネス欠陥を示してください。
これまでのところ、調べたすべての回復した S 系統は、表現型の回復の度合いを示しています。遺伝的交差によって検出されると、回復した表現型は単一遺伝的要素に起因する、遺伝的 (例図 2に示すように)。これは多くの場合複数のゲノム遺伝子を対象とする化学物質や紫外線抑制画面と比較してこの方法の最も重要な利点の 1 つです。16 植民地/ひずみ (約 10%) から回復 1 つまたは 2 つのコロニーを観察するが一般的一週間以内。しかし、我々 はelf1Δセル31Rrp6、核固有エキソソーム サブユニットほぼ野生型成長率に回復したことの損失の機能など、特定の変異体が観察されることを通知しました。Rrp6 の関数できますだけは他の変異体テスト、 fal1∆、規制でその重要な機能を通じて深刻な減数分裂の欠陥を原因に示されていたなどの関数とは異なり、抑制によっても部分的に償われるそうです。34をスプライシングします。Yfgは細胞の成長に非交換可能なユニークな役割を持つとき、代替抑制のスクリーニング法が同じ問題の対象となると考えています。
ゲノム シーケンスを実行、する前にバック クロス プレート リーダーと遺伝的背景をクリアし、生物の複製を取得する親系統から識別される表現型回復のコロニーに最適です。さらに、深い全ゲノム シーケンスは、何百ものほとんどはスクリーニングのための少し興味の生物的複製と同一ではない単一のヌクレオチドの変更を識別します。たとえば、2 elf1Δ P と 5 つの異なる S 系統 (図 3) のすべての 3 つの染色体の間で 660 のゲノムの変化の合計を発見します。我々 一般的観察しなかったシーケンスされた生物間の変異が同じレプリケート各菌株のゲノム ライブラリーの構築前にelf1Δ細胞の培養中に新しい突然変異が生じることがありますか、またはランダムなエラー可能性がありますを示唆図書館の建設とシーケンスの間に導入されました。したがって、生物的複製間で一貫性のある突然変異を隔離するは、全ゲノム シーケンスを使用して抑制の成功の識別の重要な側面です。
我々 は識別され、5 つのシーケンス S 系統の CD 地域で 2 つの抑制を確認します。SPBPJ4664.02の突然変異は、S A1 と A2 S 型菌の両方で検出された、S A1 と A2 S が含まれないため同じ遺伝子抑制 (互いに相補的ではないために、 SPBPJ4664.02が有効な抑制である可能性はありません。データは表示されません)。我々 も確認していないrli1 S-A3、共同elf1Δととき S の表現型と分離でしたないの。代わりに、我々 は S A1、A2 S と S A3 の非コーディングの地域で特定の突然変異を見つけた。これらの変更された非コーディング ゲノム領域が今後の研究課題で解決される予定のelf1Δの表現型を軽減することが可能です。S 表現型をイネの要素に原因を確認した後 2 ヶ月以内 2 つの抑制遺伝子の突然変異をマップする何年もかかる可能性があります、リンケージのアッセイなどの従来の方法と比較してわかりました。全ゲノム塩基配列決定技術の急速な発展、このメソッドが予見可能な将来的に一貫性のある遺伝子の突然変異を識別するために効率的でしょうと楽観的です。
要約すると、このプロトコルが正常に液体文化で成長の遅い欠陥に関心の任意の遺伝子をサプレッサー突然変異を識別するためにステップバイ ステップの指示を提供します。この試金のシンプルさは、少し実践的な訓練と興味の複数の遺伝的背景の大規模スクリーニング。さらに毎日希釈する液体ハンドリング ロボットを使用してプロセスを自動化する余地があります。このプロトコルは細菌などの他の大規模な人口のモデル生物に広く適用できること提案する微生物の実験操作で液体培養、フィットネス、本質的に選択的なプロセスの成長が必然的に必要ですので、その他の酵母の種。

遺伝子間の機能的なリンクを理解することの基礎は、複雑な遺伝的形質の分岐1多様な表現型を生成する分子機構を識別する能力に依存しています。蛋白質コーディングの遺伝子の大半は、分裂酵母、分裂酵母(S. 酵母)、生存率2のため不可欠であります。この結果は、これらの遺伝子のからだに、そのような遺伝子が所属する生化学的経路の複雑な代償的なメカニズムを話すことはありません。これらの代償機構を解剖明らかに包括的な遺伝的相互作用と機能の生化学的経路3,4の私達の理解を拡大エピスタシス マップを生成しています。
高スループット方法 (例えば、合成遺伝子配列解析、または SGA) は、出芽酵母におけるゲノム遺伝的相互作用を識別し、分裂酵母5,6で使用するために展開されている開発されています。このようなアプローチは、多くの場合すべて実行可能な単一タンパク質コード遺伝子の削除を含む系統のライブラリに依存 (カバー約 3,300 半数体欠失変異分裂酵母ゲノムの 92% 以上)、遺伝的交雑を実行するロボット アームを必要とし、関心と、library6 のすべての可能な系統のひずみ。さらに、適正かつ効率的な交配してライブラリ系統の能力に依存する SGA のテクニック、444 に異常になっている表現型特徴s.pombe2遺伝子です。
遺伝子相互作用の複雑さにもかかわらず各遺伝子の個々 の突然変異を運ぶ 2 つの系統の表現型に 2 つの遺伝子の突然変異を運ぶひずみの表現型を比較することができますが 2 つの注目すべき成果の一つ: 1) 二重突然変異表現型が予想される乗法親表現病気の形でまたは、極端な場合、致死率よりも悪い。これは負の遺伝的相互作用と呼ばれます、平行に生物学的経路で行動する 2 つの遺伝子記号は、一般的に。2) 二重突然変異形質は親表現型とも呼ばれる肯定的な遺伝的相互作用の予想の組み合わせより良い。それはこれらの遺伝子が同じプロセスで機能することを示すために、肯定的な遺伝的相互作用は特に興味深いです。積極的に相互作用する 2 つの遺伝子が 3 つの潜在的な関係を持っている: 突然変異遺伝子がアップ-制御並列経路で他の遺伝子の発現、2 つの遺伝子は、互いに同じ経路下流内コンサートで動作可能性がありますまたは 2 つの遺伝子を符号化互いに直接相互作用するタンパク質。したがって、肯定的な遺伝子相互作用が遺伝子規制ノードをマップし、生化学的経路7,8, 遺伝子を分類する使用できます。
サプレッサーは通常 2 つの遺伝子の9,10の肯定的な遺伝的相互作用を表す別の遺伝子の突然変異の病気の表現型を軽減することができる突然変異です。サプレッサー突然変異の突然変異を抑制するから別の軌跡には、extragenic の抑制と呼ばれます。彼らは、合成致死表現型 (ラザロ効果として知られている)11を曝け出して非実行可能な遺伝的変異の研究に特に役立ちます。また遺伝性疾患12,13の治療の潜在的な治療への応用があります。
すべてのこれらの理由から、様々 なモデル生物におけるサプレッサー突然変異の同定は、様々 な生化学的経路14,15,16の私達の理解を容易にするために広く利用されています。抑制のためのスクリーニングは、通常問題の突然変異の表現型に基づいており、表現を緩和する突然変異を隔離するランダム変異導入を行う必要があります。ほぼすべてのモデル有機体は、ランダムな突然変異誘発方法を確立しています。たとえば、N-エチル-N-ニトロソウレア (ENU) とエチルメタンスルフォネートによる (EMS)、DNA に点突然変異を誘導することができる、マウス17,18,19に細菌からさまざまなモデルで広く採用されている、2 つの変異原性物質.さらに、塩化マンガンは長い酵母の使用 DNA 修復経路20を阻害するマンガン イオンの能力されています。ゲノム変異原性ピリミジン二量体21,22を生成する紫外線誘発突然変異する一般的な方法です。
サプレッサー突然変異を識別するために化学的突然変異誘発の使用率が増えている、メソッドは余分な交絡変数の導入、高い変数成功率、危険な化学物質の使用を含む多くの欠点複数の細胞プロセス23,24の変異原物質の否定的な副作用を提示しました。さらに、化学変異はしばしばゲノム遺伝的使用の複雑さと生物25でサプレッサーの表現型を与えられた正確な突然変異を識別するシーケンス技術に追加で複数の突然変異を誘導します。
現在の突然変異誘発のアプローチの欠点に対処するため、変異原物質または削除ライブラリに依存しない分裂酵母の自発的なサプレッサー突然変異の画面に手法を提案します。メソッドは、正の選択の試金による抑制を分離します。この方法の原理は、自動プレート リーダーによって監視することができます液体の文化でサプレッサー変異個体の成長の優位性に基づいています。嵌合と減数分裂は、1 つは遺伝的バック グラウンド クリーンアップまたは全ゲノム シーケンスの前に抑制のイネ遺伝子の存在を確認したい場合にのみ使用されます。抑制表現型は単一の突然変異によって引き起こされる、サプレッサー表現型は親の系統との交配後 2:2 を分離します。サプレッサー突然変異は、全ゲノム シーケンスを使用して識別できます。このメソッドは人口が多い液体文化で育つことができるすべての微生物の抑制をスクリーニングするために適用を提案します。

<table><tbody><tr><td>アデニン、粉末</td><td>Acros Organ</td><td>147441000</td> icsは<td>、液体および固体のリッチメディア(YEA)細菌</td></tr><tr><td>学ペトリ皿</td><td>コーニング、ファルコン</td><td></td><td>C351029 100&timesを作るために75 mg / Lで使用します。15 mm、固体リッチメディア</td></tr><tr><td>D-グルコース無水、粉末</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>D16-1</td>上の単一コロニーにひずみを成長させるために使用 <td>30 g / Lで使用して液体および固体リッチメディア(YEA)</td></tr><tr><td>Difco Agar、Granuated</td><td>Becton、Dickinson and Co.</td><td>214530</td>固体<td>リッチメディアを作るために20 g / Lで使用(YEA)</td></tr><tr><td>DNA抽出緩衝液</td><td></td><td></td><td>2%Triton X-100、1%SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris-Cl(pH 8.0)、1mM Na2-EDTA</td></tr><tr><td>集束超音波装置</td><td>Covaris Inc.</td><td>S220</td><td>または、QSonica Q800R sonicator/DNAおよびchromatinのせん断システム</td></tr><tr><td>Gen5データ収集および分析ソフトウェア</td><td>Biotek、Inc.を使用して下さい。</td><td>GEN5SECURE</td><td>または同等品は、マイクロプレートリーダーと互換性がある必要があり、マイクロプレートリーダーからのデータ読み取りをエクスポートするために使用します</td></tr>塩<tr><td>酸1N、液体</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>SA48-4</td>液体<td>および固体のリッチメディアでpHを5.5に調整するために使用します</td></tr><tr><td>液体リッチメディア(液体YEA)</td><td></td><td></td><td>30 g / L D-グルコース、5 g / L酵母抽出物、75 mg / Lアデニン、 pH を 5.5 に調整した 1 M HCl</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー、Synergy H1 ハイブリッドマルチモードリーダー</td><td>Biotek, Inc.</td><td>BTH1MG</td><td>または同等品は、600nmの波長範囲で可視光を読み取る必要があります</td></tr><tr><td>リッチメディア寒天プレート(YEAプレート)</td><td></td><td></td><td>30 g / L D-グルコース、5 g / L酵母抽出物、75 mg / Lアデニン、20 g / L寒天、pHを5.5に調整し、1 M HCl。</td></tr><tr><td>RNase A/T1 mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0551</td><td>メーカー推奨による使用</td></tr><tr><td>滅菌ポリスチレン接種ループ</td><td>Corning, Inc.</td><td>OS101</td><td>または同等品、寒天プレートから96ウェルプレートへのコロニーの移し替えに使用</td></tr><tr><td>滅菌ワークスペースとバーナー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート、96ウェル光学平底、低蒸発蓋</td><td>コーニング、ファルコン</td><td>C353072</td><td>または同等のもの、マイクロプレート対応の光学平底が必要です</td></tr><tr><td>TruSeq DNA PCRフリー LT/HT ライブラリ準備キット</td><td>Illumina, Inc.</td><td>20015962</td><td>全ゲノムシーケンシングライブラリの調製に使用</td></tr><tr><td>酵母抽出物、粉末</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>BP1422-500</td><td>5 g/Lで使用して液体および固体のリッチメディア(YEA)を作るために</td></tr></tbody></table>

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

突然変異による表現型の欠陥を抑制する突然変異体の対立遺伝子の遺伝学的スクリーニングは、密接に関連の生化学的経路に属する遺伝子を識別する強力なアプローチです。合成遺伝子配列 (SGA) の解析、およびランダム変異導入技術の uv (紫外線) またはメタンスルホン酸エチル (EMS) または N-エチル-N-ニトロソウレア (ENU) のような化学物質を使用してなど従来広く使用されているが、高価なことが多いし、骨の折れる。また、これらの変異原物質ベースのスクリーニング方法は頻繁、抑制を分離することの複雑さを加える複数の突然変異を誘発する生物の重篤な副作用に関連付けられます。分裂酵母の成長障害を与える突然変異体のサプレッサー突然変異を識別するために簡単で効果的なプロトコルを紹介します。長期間にわたって自動 96 ウェル プレート リーダーを使用して回復の標準の豊富な液体メディアまたは総合的な液体媒体の成長の欠乏を持つセルのフィットネスを監視できます。セル取得する文化のサプレッサー突然変異と、その子孫は親の細胞のそれらを害さない。親セルに競争力のある成長の優位性がある回復細胞の分離および親細胞とできます。サプレッサー突然変異は、全ゲノム シーケンスを使用して識別されます。このアプローチを使用すると、AAA + 家族核内の mRNA 輸送とゲノム安定性の維持に重要なある ATPase Elf1 の損失によって引き起こされる深刻な成長欠陥を軽減する複数の抑制を正常に分離しています。現在 400 遺伝子s.pombeしている変異体成長欠陥を授与します。これらの遺伝子の多くは特徴付けられたとおり、本手法はこのアプローチで使いやすい、高スループット小説の機能的相互作用の同定を早める提案します。

突然変異体の成長の遅い液体文化で表現型の回復を示す、 我々 はさまざまな病気で、成長の遅い表現型と生物学的経路に関与する 3 つの突然変異体を選択: AAA ファミリー ATPase Elf1、ヒストン脱アセチル化酵素 Clr6、エキソン接合複雑なコンポーネント Fal1。野生型株と野生型株目印されていたこれらの 3 つの遺伝子の突然変異を運ぶ緊張された個々 の植民地に縞し、豊富な液体媒体として 96 ウェル プレートで培養するため 16 のシングル コロニーを無作為上記で説明しました。個々 のコロニーの成長曲線は、常時監視をプレート リーダーを使用して初期の時点 (0 日目) で、6 日間を記録しました。予想通り、野生型のコロニーと実験31 (図 1) 全体の成長曲線には顕著な変更表示されません。特に、 elf1∆の背景を持つ 4 つの植民地と植民地fal1∆ 1 つで表示する劇的な変化成長のいくつかのさまざまなレベルに成長の遅いから成長と同様または野生型植民地に近い。劇的に、変異体clr6 1すべてはアッセイ31 (図 1) の終わりによってより高速な速度で成長して一貫した表現型の回復を示します。異なった表現型を特徴付ける「P 系統」(または親系統) としてゆっくりと成長を元系統と「S 系統」(または抑制された系統) として表現型の回復を示す系統に私たちを参照してください。図 1スクリーニング実験の 1 つのラウンドの例で、識別され、次の代表的な結果のシーケンスの合計の非相補的な抑制を表さないことに注意してください。
表現型の回復は遺伝特徴に起因します。 S.pombeのリッチ メディアで半数が窒素飢餓下で相補的な交配の種類仲間と 2 つの半数体系統として育てることができます。分裂酵母における減数分裂では、重複の細胞分裂の 2 つのラウンド後のラウンドを伴います。2:2 (図 2 a) 古典的なメンデル遺伝学の規則に従って遺伝的形質の分離と、親株の遺伝物質を運ぶ 4 つの半数体の胞子の形成で起因する性のサイクル。後ろ交差すべて抑制する系統の親系統 (P 系統) 小 2 (成長障害) と 2 大 (サプレッサー表現型) につながった (S 系統) 2:2 偏析を確認したときに時間の同量の同じプレート上に成長した、植民地。抑制されたelf1∆ clr6 1 、 fal1∆細胞の個々 の例を図 2 bに示します。すべての孤立した S 系統が、P 系統 (データは示されていない) の成長の遅い表現型を抑制するイネの遺伝的要素を運ぶことを確認しました。
全ゲノム シーケンスが正常にサプレッサー突然変異を識別します。 例として、ペアエンド全ゲノム配列をelf1∆ S系統の表現型の回復を担当する遺伝的要素を識別するために使用されます。データ分析の詳細については、利用可能なオンライン31です。簡単に言えば、2 つ独立して生成されたelf1∆ P系統の生物をトリプリケートとelf1∆ S株、それぞれは異なる抑制を含む 5 つの非相補的なグループの生物の複製を採用しました。バイオインフォマティクス解析 (6.1 10) から注釈付きの変種のリストを得た後、我々 の分析に関連した亜種の特定のクラスを優先しました。(図 3および補足表 1-4 の親elf1∆ P系統と比較して個々 のelf1∆ S系統の生物の複製のすべてで同一であった一貫性のゲノム変化の同定に着目).すべて 5 elf1∆ S系統、 rli1 +、 SPBPJ4664.02 cue2 + rpl2702 +を含む CD 領域でさらに 5 機能変化がわかりました。S A1 と S A2 種類のアミノ酸で発生する突然変異変異SPBPJ4664.02が含まれます。SPBPJ4664.02は繰り返しの何百もの長い遺伝子 (11,916 ヌクレオチド)、突然変異したシーケンス続いて PCR を実行することによって確認することができます。S A3 には、両方の生物学的重複で一貫性のあるrli1の削除の突然変異体が含まれています。ただし、変異しなかったない共同elf1∆バック グラウンドで S の表現型と分離します。396 400 に不足しているアミノ酸と S - b1、 cue2変異 (cue2 1) を同定しました。S B2 にはrpl2702変異 (rpl2702 1)、アスパラギン酸31グリシンから 45 の位置にアミノ酸を変更するが含まれます。Cue2 1 rpl2702 1は、次のようにelf1∆の抑制として確認されました。
回復表現型は遺伝的に識別されたサプレッサー突然変異の遺伝学的確認のことを確認します 特定された率の変更、 cue2 1 rpl2702 1の 2 つはサイト指示された突然変異誘発のための標準プロトコルを使用してラボに再建したもの。二重変異株cue2 1 elf1∆ Pとrpl2702 1 elf1∆ P無料elf1∆ Pひずみ31 (図 4) と交差しました。さら突然変異この画面を通じてがelf1∆ Pを抑制するのに十分な、結果テトラッドが表示 2:2 比の大きなに小さな各テトラッド 4 胞子から生じるコロニー。確かに、識別されたサプレッサー突然変異がelf1∆ Pの成長の遅い表現型を抑制することに成功、遺伝性遺伝的交差を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig1v2.jpg"> 図 1: 表現型の回復をプレート リーダーの成長曲線を記録することによって監視できます。野生型 (WT)、 elf1∆、 clr6 1、およびfal1∆の 16 のシングル コロニーは、96 ウェル プレートに配置されました。成長曲線は、24 時間にわたって記録された、植民地がリッチ メディアで毎日再希釈。成長障害は、0 日目に 24 時間の期間の終わりに低い吸光度 (外径) によって明らかです。表現型回復系統は、同様に、または近くの成長曲線を表示する 6 日目に 24 h の期間にわたって野生型。Elf1∆、 fal1∆のコロニー、 clr6 1のすべての植民地の 4 つの植民地は、6 日後様々 なレベルの表現型の回復を示した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig2v2.jpg"> 図 2: 遺伝的交差は表現型の回復は単一の遺伝の対立遺伝子に起因することを確認できます。(A) 分裂酵母細胞は窒素飢餓、相補的な交配型と 2 つの半数体セルの影響を受けることができます 4 胞子テトラッドを生成する sporulates、受精卵を生成します。親の遺伝物質はメンデル遺伝学の規則に従って減数分裂分離します。(B) は、表現型の植民地を回復した (ラベルの付いた S 抑制のため) と親の遺伝子型がその無料親植民地と戻し交配が示された (P、ラベル表示されている表現型の回復を示すない親)。交配小 2:2 を示す (貧しいフィットネス) 大規模な (回復されたフィットネス) の植民地には表現型の回復は継承可能であることを実証してから、単一の遺伝的要素に起因することができます。赤い箱サプレッサー遺伝子を運ぶの植民地、ブルー ボックスは、植民地の親の対立遺伝子を運ぶします。この図は、2018年31Marayati らから変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig3v2.jpg"> 図 3: 表現型の回復の遺伝要素を識別するゲノム シーケンス データの解析。3 生物学的親"P"の 2 系統の複製 (P A P b)、表現型を回復 5 の 2 つの生物学的複製スイッチ (S A1 ・ S A2 ・ A3 s; P A から回復"S"系統とS-B1 と P B から S B2)、クローニングされた突然変異は、それは (例えば、P-A 対 S A1、等) から派生した親株のゲノムと比較して回復したひずみで個々 の突然変異のリストとして組織されたと。このようなすべての対比較ゲノム全体にわたって検出された変異の合計数は 660 だった。同じ"S"歪みの両方の生物の複製で発生する唯一の突然変異が選択されたとき、合計 44 の突然変異が同定されました。突然変異は 44 12 変異が挿入/削除 (塩基) または非同義変異。12 から塩基、非同義変異 5 が蛋白質シーケンスをコードで発生しました。5 つの突然変異は潜在的表現型回復系統担当単一の遺伝的要素と相関: SPBPJ4664.02における非同義変異を発見した S A1 と A2-S rli1の塩基 S A3、 cue2 の塩基のS ‐ B1 と非同義変異rpl2702 S B2 で発見で発見します。突然変異とフィルター選択された背景については詳細なシーケンスは、補足表 1-4に含まれます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig4v2.jpg"> 図 4: 全ゲノム シーケンスによって識別される抑制確認します。全ゲノム シーケンスからの結果が独立して突然変異を生成、および実行によって確認されたelf1∆ P株とelf1∆ elf1∆ cue2 1株を交配することによって表現型の回復を確認する遺伝学的交差rpl2702 1 elf1∆ P株。3 代表的な垂直テトラッドが表示されます。赤い箱は二重変異コロニー (elf1 cue2 1、または elf1 rpl2702-1);ブルー ボックスは、 elf1∆の植民地です。この図は、2018年31Marayati らから変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足表 1.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。 
補足テーブル 2.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。 
補足テーブル 3.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。 
補足テーブル 4.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_4.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。 
補足ファイルをコーディング.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">ファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

酵母分裂簡便なサプレッサー スクリーンのプロトコルを提案します。この方法は、効率的な変異原無料、頻繁に単一の genomic 位置で起こる突然変異の選択です。 プロトコルは、突然変異や薬物によって引き起こされる液体文化で成長欠陥を緩和抑制を分離することに適しています。

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

このプロトコルは、分裂酵母の成長欠陥を有する変異体のサプレッサー突然変異を同定するための、単純で効果的なサプレッサースクリーンを記述する。従来の突然変異誘発法は、細胞内に複数の変異を発生させることができる有毒な化学物質またはUVを使用する。逆に、このプロトコルは、変異誘導法を用いることなく、個々の細胞における単一のサプレッサー変異体を濃縮することができる。テキスト プロトコルで説明されているように、ひずみの構築と準備を行い、この手順を開始します。96ウェルのポリスチレンマイクロプレートの各ウェルに200マイクロリットルの液体培地を加えます。滅菌アプリケーターを使用して、調製されたコロニーのそれぞれを少量取り、液体培地を含む個々の井戸で各コロニーを中断する。同じ媒体の200マイクロリットルを含むプレート上のすべての行のためのブランクウェルを含める。今度は、自動マイクロプレートリーダーに接続されたプレートリーダー検出ソフトウェアにプロトコルを設定します。温度を摂氏30度に設定し、2分の読み取り頻度で24時間運動プログラムを設定します。これにより、井戸あたり24時間にわたる合計読み取り時間は721件になります。連続的な速い軌道振に揺れを設定します。光読取を設定して、600ナノメートルの波長で光散乱を測定し、光密度を測定し、プレートの下から読み取る光を設定します。24時間後、最終的な空の光密度測定値を記録し、テキストプロトコルの式を使用して、各サンプルを0.1の光学密度に希釈するのに必要な量を決定します。各実験井戸から使用する希釈量をバッチ処理するには、プレートリーダーソフトウェアからデータをエクスポートし、関数と同じ式を挿入するスプレッドシートソフトウェアを使用します。24時間ごとに、ゼロ日と同じ培地を使用して、各サンプルを式を使用して0.1の光学密度に希釈します。すべてのウェルを0.1の光学密度まで希釈するために、必ず式を使用してください。これには、成長欠陥の回復を示し始めた可能性のある井戸が含まれます。毎日生成されたすべての成長曲線を保存します。同じ遺伝的背景を有するコホートの残りの部分よりも有意に高い最終的な光学密度または野生型コロニーと類似した成長曲線によって判断される成長速度の増加を示す個々のコロニーに注意してください。このアッセイは通常、約7〜14日かかります。滅菌条件下ですべてのステップを実行します。プレートリーダーアッセイの最終日から、一部の液体培養物は、親の突然変異の表現型を緩和できるサプレッサー突然変異を得ることによって、顕著に回復した増殖速度を有すると考える。平種的に回収した培養物を保存するために、250マイクロリットルの液体培養液を、50%グリセロールの250マイクロリットルを含むクライオチューブに移し、混合する。フラッシュは液体窒素で細胞を凍結し、マイナス80°Cで無期限に株を保存します。サプレッサー変異が遺伝的に遺伝性の要素であることを確認するには、標準的な遺伝的交差法を使用して、お気に入りの変異体P細胞を好きな変異体S細胞と交差させます。無料の交配タイプを持つ2つのハプロイド細胞が混合され、窒素飢餓にさらされると、4つの胞子の四面体を形成するために胞子を生成することができます。親の遺伝物質は、メンデリア遺伝学の規則に従って、meiosの間に分離されます。胞子形成後、同じ四面体からの個々の胞子を解剖し、プレート上で垂直に観察されるように4つの個々のコロニーを形成することができる。マイクロニードルを使用して、プレート上に胞子を一つずつ均等に置きます。解剖後、コロニーが現れるまで、細胞を30°Cの培養器で数日間成長させます。サプレッサー突然変異が遺伝的に遺伝性の要素である場合、この十字架は、2つのコロニーが親株の病気表現型を有し、2つのコロニーがサプレッサー株の回復増殖率を有する四面体を生じるべきである。同じ遺伝的十字架からサプレッサー表現型と親の表現型を持つ3つのコロニーを選び、テキストプロトコルで詳述されているようにゲノムDNA抽出とシーケンシングステップを進めます。次に、テキストに詳述されているようにサプレッサー突然変異の同定のためのバイオインフォマティクス分析を行う。個々のコロニーの成長曲線は、プレートリーダーを用いた連続モニタリングを用いて、初期時点および6日間に記録した。予想通り、野生型コロニーは実験を通して成長曲線に顕著な変化を示さない。特に、elf1欠失の背景と1つのfal1欠失コロニーを持つ4つのコロニーは、成長の遅い成長から野生型コロニーと同様の成長の様々なレベルへの成長の劇的な変化を示しています。劇的に、すべてのclr6変異体は、アッセイの終わりまでにより速い速度で成長する一貫した表現型の回復を示す。同定された非同義的変化のうちの2つは、cue2突然変異およびrpl2702突然変異を、部位指向突然変異の標準的なプロトコルを使用して実験室で再構成された。Cue2 elf1二重変異体およびrpl2702 elf1二重変異体は、無料のelf1欠失変異株と交配した。遺伝子交差は、同定されたサプレッサー突然変異がelf1欠失変異体の成長が遅い表現型を抑制することに成功し、遺伝性であることを示した。96ウェルプレートの毎日の希釈時には、人工的な成長回復を避けるために、すべてのウェルを同じ濃度に希釈することが重要です。この方法は、高スループットでサプレッサー突然変異の単離を可能にし、分裂酵母および他の微生物において十分に特徴づけられていない何百もの遺伝子の発見をスピードアップする。この方法は、成長欠陥を引き起こす突然変異を有し、液体培養中の大規模な集団に成長することができるすべての微生物のサプレッサーを分離するために使用することができる。分裂酵母のサプレッサー突然変異を同定することは、特に酵母からヒトへの高度に保存された経路に関しては、重なり合う経路で病気を引き起こす遺伝子を見つけるのに潜在的な影響を及ぼす可能性があります。

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JoVE Journal

Genetics

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タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe は、ミトコンドリアを研究するための魅力的なモデルとして浮上しています。ここでは、 S.

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学ぶ、分裂酵母における成長欠損を緩和する抑制変異を同定するための変異原不使用のハイスループットスクリーニング法。このプロトコルは遺伝的相互作用の理解と疾患関連遺伝子の研究に応用可能です。

分裂酵母分裂酵母のディープシーケンスアシスト、自発的な抑制画面

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分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

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