Name: 平滑筋細胞系譜トレース マウスの高度な動脈硬化病変における細胞構成の定量的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶマウス動脈硬化病変の細胞構成解析法。免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡を用いて、頭腕動脈の単一細胞計数と定量的解析を行う標準化プロトコルです。疾患組織の表現型解析に有用です。

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彼らの支援のためピッツバーグの大学で生物学的イメージング (NIH 1S10OD019973-01 でサポート)、中心に感謝しますこの作品が支持された総局 R.A.B. に米国心臓協会からの 15SDG25860021 によって支えられた科学的な開発補助金によってサポートは NIH F30 HL136188 を付与します。

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<li>Majesky, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Smooth+Muscle+Cells+Generate+a+Subpopulation+of+Resident+Vascular+Progenitor+Cells+in+the+Adventitia+Regulated+by+Klf4%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4.</a> Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).</li>
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研究とアテローム性動脈硬化を勉強の技術進歩の数十年にもかかわらずフィールド臨床治療34,35の科学的知見を翻訳の残念な歴史があります。この現象は、動物モデル、実験デザイン、および病変の解析での不具合によって部分的に説明されるかもしれない。ここで、リネージュ トレース マウス7を使用して高度な動脈硬化病変における細胞の組成を分析するために使用私たち実験的パイプラインについて述べる。細胞運命マッピングと表現型解析、綿密な調査により、このメソッドは、高度な動脈硬化病変における再生の潜在的なメカニズムによって制御される主要なパラメーターであります。
SMC リネージュ トレース マウス モデルは、アテローム性動脈硬化発症機序に運命とこの系統およびその貢献の表現型の変調を正確に追跡する強力なツールです。タモキシフェン誘導Cre loxPシステムは、アテローム性動脈硬化の開始前に MYH11 を表現する血管の成熟...

動脈硬化は、罹患率と死亡率の世界的冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳卒中の大半の基になる主要な原因です。後期冠動脈アテローム性動脈硬化は、心筋梗塞会計世界人口の死亡率1,2のほぼ 16% を含む重篤な合併症につながります。衝撃その壊滅的な公衆衛生上、新規治療戦略の開発を行うとともに、動脈硬化の進行を駆動メカニズムを解読する実質的な努力をしました。まだ、心血管疾患の臨床試験の承認の可能性 (LOA) 率は最低水準 (8.7% 相) のみ他の臨床フィールドと比較すると3です。これは説明することができます一部で多くの障壁によってその動脈硬化のポーズをほぼユビキタス性質、臨床的に無声進行の重要な病気の不均一性など効率的な医薬品開発へ。さらに、前臨床動物実験の準最適設計に臨床的翻訳の成功の欠如説明もできます。具体的には、治療戦略の有効性を調査するため可能な限り介入研究を実施する必要があると考えています。また、運命のマッピングおよび表現型解析によって末期動脈硬化病変の細胞構成の高度な特徴を含む病変解析の標準化された手順を実行するための重要な必要性があります。
アテローム性動脈硬化研究の大半は薬物治療や遺伝子操作 (ノックアウトまたはノックアウトの) 病気の開始そして進行の前に、健康な若いマウスの動脈硬化予防のモデルに焦点を当てます。これらの研究は、多数の遺伝子と動脈硬化の進展に関与するシグナル分子を発見されています。ただし、これらのターゲットのほとんどは人間の効率的な治療に翻訳できませんでした。確かに、治療法が高度な動脈硬化病変を有する高齢者患者に健康な若いマウスに及ぼす影響を推定することは困難です。など、可能性が臨床実験的パイプラインにおける介入研究の実装では、関連性と有効性の新しい治療のより正確な描写を提供します。アイデアは、プロ炎症性サイトカイン インターロイキン 1 β (il-1) を阻害する予防4,5,6または介入戦略7を採用の著しく発散効果によってサポートされます。予防と介入研究の違いは、異なる細胞プロセスが動脈硬化の進展のさまざまなフェーズで発生し、予防の研究の可能性があるという事実を強調を示唆している臨床のシナリオをモデル化するが不足しています。適切に。
アメリカ心臓協会は最近、適切な実験計画、手順の標準化、分析、および動物の動脈硬化研究8のレポートの推奨事項を詳述した科学的な声明を発表しました。これは、利点と制限フィールドで使用される支配的な技術をハイライトします。たとえば、最初の読み出しとしてアン顔スーダン IV は、大動脈の染色はしばしば実行されます。脂質沈着のアン顔スーダン IV 染色はグローバル プラーク負担の評価に適した方法より高度な遅段階の病変を早期脂肪筋病変を区別することはないです。など、アンの顔を汚すの解釈はしばしばあいまいな、うわべだけの9です。慎重に分析組織の形態学的パラメーター容器、病変、および内腔のサイズと病変の安定性の指標の定量化を使用して断面積実験の効果のより正確な理解を提供します。
最後に、人間の病理組織学的研究は、細胞構成が平滑筋細胞 (SMC) 病変の貧乏人および10、破裂しやすくされているマクロファージが豊富と病巣の大きさ自体よりも破断のよりよい予測因子であることを示唆しています。 11。これらの観察は、古典的な細胞の識別に使用されるマーカーの染色に基づいていた (すなわち、SMC と LGALS3 または大食細胞の CD68 の ACTA2)。ただし、これらのマーカーの発現は SMC、血管内皮細胞、骨髄細胞の12を含む複数の系統の可塑性による動脈硬化病変における 1 つのセル型に厳密に制限されません。特に、動脈硬化病変内で SMC の明白な識別は事実上不可能過去 10 年まで「脱分化」と (プロセスと呼ばれる系統特異的マーカー遺伝子を抑制するこれら細胞特性のため表現型スイッチング) 負傷したまたは患部の血管13。SMC の識別にこの制限はリネージュ トレース7,14,15,16,17,18,の開発によって回避されています19,20,21,22,23,24. それ永久にラベリング Cre リコンビナーゼ SMC 特異的発現プロモーターによる発現の組み合わせを使用してアテローム性動脈硬化の進行中に彼らの運命と表現型進化を追跡するには、SMC と彼らの子孫成っている (すなわち、 Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23,24、26 Acta225、と、 SM22α14,16) と記者 (例えば、蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ) [Bentzon と Majesky で確認の活性化201827]。胚外 SMC リネージュ トレースを用いた最初の研究の 1 つは、シュペーアら14は、SMC 調節することが彼らの表現型と分化形質転換軟骨細胞に血管石灰化の間を使用して証拠を提供SM22α Cre R26R LacZ 系統のトレース モデル。これらの研究は、トレースする SMC 血統を開拓した、病気の設定で任意の与えられた非 SMC 表現する SM22α はレポーターによって分類されること、部分的に明白でした。この制限は開発と使用のタモキシフェン誘導 Cre ERT/LoxP 細胞ラベリングの時空間制御を許可によってバイパスされています。タモキシフェンの配信中にのみ発生する細胞ラベリングと代替セル型で Cre のアクティブ化の追跡を回避する運転 Cre ERT 式タモキシフェン露出の時にセル型固有プロモーターを表現するセルに限定されます、病気の進行の設定。動脈硬化、蛍光レポーター (eYFP7,15,17,18に関連付けられているタモキシフェン誘導Myh11- Cre/ERT2 transgene の SMC のトレースする血統の,21, mTmG19,25, 紙吹雪20,22,23クローン性増殖研究) 顕著な効率と SMC のラベリングの特異性を示しているし、は最近の研究で動脈硬化病変における運命地図 SMC 個体群に使用されています。重要なは、これらの研究は、それを明らかにした: 1) SMC の 80% 内高度動脈硬化病変は発現していない、従来 SMC マーカー (ACTA2、MYH11) 免疫組織学的解析のため、したがって系譜トレースせず誤認されているだろう17;2) SMC のサブセット エクスプレス マクロファージ マーカーまたは間葉系幹細胞マーカー16,17,19を含む代替セル型のマーカー・ 3) SMC 投資し、オリゴグローナル拡張、動脈硬化病変と SMC クローン保持可塑性表現型別の集団20,23に移行します。要約すれば、それは今オフに平滑筋細胞が動脈硬化病変における顕著な表現型の多様性を提示し、その表現型変化の性質に応じて病変発生機序に関する有益なまたは有害な役割を持つことができます。これらの発見は、SMC 末期動脈硬化の粥腫推進表現型転移をターゲットに顕著な新しい治療上の道を表しています。
ここで、動物解剖、埋め込み、断面、染色、腕頭動脈病変の定量化のための体系的なメソッドを含む後期マウスの動脈硬化病変を分析するための標準化されたプロトコルを提案する.SMC 運命と表現型に及ぼすインターロイキン 1 β 阻害を決定するには、SMC リネージュ アポ-/-マウス抗 IL1β 抗体の IgG アイソタイプ対照毎週注射を受ける前に 18 週間西部飼料をトレースを使用しました。

<table><tbody><tr><td>16% パラホルムアルデヒド水溶液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>RT 15710</td><td>組織灌流および固定</td></tr><tr><td>23G バタフライ針</td><td>フィッシャー</td><td>BD367342</td><td></td></tr><tr><td>25G 針</td><td>フィッシャー</td><td>14-821-13D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>A1 共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>ACTA2-FITC 抗体(マウス)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>Alexa-647 抗ヤギ</td><td>Invitrogen</td><td>A-21447</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>抗原アンマスキング溶液、クエン酸ベース</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td>抗原賦活化液</td></tr><tr><td>Chow Diet</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.7012</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td></td><td>Fisher 12-544-14</td><td>Any 50 x 24 mm cover glass</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Nucleus fluorescent counterstaining</td></tr><tr><td>Donkey Alexa-488 anti-rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Secondary antibody Donkey</td></tr><tr><td>Alexa-555 anti-rat</td><td>Abcam</td><td>ab150154</td><td>カルシウム</td></tr><tr><td>およびマグネシウムを含まない二次抗体 DPBS 10X</td><td>Gibco</td><td>14200166</td><td>PBS 溶液希釈および洗浄用。脱イオン水で1倍に希釈</td></tr><tr><td>埋め込みカセット</td><td>フィッシャー</td><td>15-182-701D</td><td></td></tr><tr><td>ETDA 真空管</td><td>フィッシャー</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 200プルーフ</td><td>デコン</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>フォームパッド</td><td>フィッシャー</td><td>22-222-012</td><td></td></tr><tr><td>冷水魚皮からのゼラチン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体 (ヤギ)</td><td>abcam</td><td>ab6673</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ IgG 制御</td><td>ベクターラボ</td><td>I-5000</td><td>IgG 制御</td></tr><tr><td>高脂肪食</td><td>ハーラン テクラッド</td><td>TD.88137</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>コンピュータプログラム https://imagej.nih.gov/ij/&nbsp;</td></tr><tr><td>LGALS3抗体(ラット)</td><td>シダーラン</td><td>CL8942AP</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>LSM700 共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、スーパーフロストプラス</td><td>フィッシャー</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームブレード</td><td>フィッシャー</td><td>30-538-35</td><td></td></tr><tr><td>マウスIgG制御</td><td>ベクターラボ</td><td>I-2000</td><td>IgG制御</td></tr><tr><td>NISエレメントイメージングソフトウェア</td><td>ニコン</td><td></td><td>z-stack画像取得用イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>ノーマルホースセラム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Pap Pen</td><td></td><td>Fisher 50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>ピーナッツオイル</td><td>Sigma</td><td>P2144</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold 退色防止封入剤</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>封入剤&nbsp;</td></tr><tr><td>ウサギIgGコントロール</td><td>ベクターラボ</td><td>I-1000</td><td>IgGコントロール</td></tr><tr><td>ラットIgGコントロール</td><td>ベクターラボ</td><td>I-4000</td><td>IgGコントロール</td></tr><tr><td>RUNX2抗体(ウサギ)</td><td>アブカム</td><td>ab192256</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1mlシリンジ</td></tr>タ<tr><td>モキシフェン</td><td>シグマ</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィ</td><td>ッシャーX55K-4</td><td></td></tr><tr><td>Zenイメージングソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Z-stack画像取得用イメージングソフトウェア</td></tr></tbody></table>

平滑筋細胞系譜トレース マウスの高度な動脈硬化病変における細胞構成の定量的解析

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

動脈硬化は世界における死亡の主要な原因と、有望な治療上のターゲットを記述する無数の前臨床研究にもかかわらず新規介入はとらえどころのない残っています。これは可能性が高いため、一部では、確立された病気ではなく、遺伝子操作や動脈硬化の進展に対する薬理学的治療法の効果を調べる臨床予防モデルに依存します。また、これらの研究の結果は、表在病変解析の使用と病変の細胞集団の特性の不足のため交絡しばしば。これらの並進のハードルを克服するためには、蛍光抗体染色および共焦点顕微鏡による単一細胞レベルでの細胞組成の変化の調査を用いる介入モデル依存の増加を提案します。このため、動物解剖、埋め込み、および断面、染色、腕頭動脈病変の定量化のための体系的なアプローチを含むマウス介入モデルで推定される治療上のエージェントをテストするためのプロトコルについて述べる。さらに、末期動脈硬化病変内のセルの表現型多様性によるセル固有の誘導の系譜トレース マウス システムとどのようにこれは公平な評価に利用できますを使用しての重要性を述べるアテローム性動脈硬化病変の細胞集団。一緒に、これらの戦略はより正確に治療上の介在をモデル化および動脈硬化性疾患を分析する血管生物学者を助けるかもしれない、臨床試験の成功のより高い速度に変換されますうまくいけば。

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP アポ-/-マウスは、高脂肪食を供給されて前に年齢 6 のそして 8 週の間タモキシフェンを注入しました。高脂肪食の 18 週で 8 匹の 2 つのグループは、マウス モノクローナル抗 il-1 抗体またはアイソタイプ一致 IgG コントロールで 8 週間 (図 1)710 mg/kg で毎週扱われました。マウスは犠牲にし、4% PFA PBS 溶液を灌流しました。腕頭動脈は、解剖、処理、および断面 (図 2および図 3) 上記のようだった。
BCA の 8-10 μ m の厚さリネージュ トレース記者 (YFP) と表現型マーカー (AC...

動物解剖、組織を埋め込む、断面、染色、腕頭動脈の分析の体系的な方法を含む後期マウスの動脈硬化病変の細胞構成を特徴づけるための標準化されたプロトコルを提案します。atheroprone 平滑筋細胞系譜トレース マウス。

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

我々のプロトコルは、研究者が免疫蛍光染色によって類似集団の表向きの特性評価を行うための標準化された実験パイプラインを実装するのに役立ちます。この技術により、研究者は複雑な疾患組織の類似した組成を厳密に分析し、目的とする細胞タイプの異型の質的および定量的分析を行うことができる。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるシドニー・マハンです。動物を腕頭筋動脈の収穫に備えるために、腹膜を胸骨まで切り、腹部組織に損傷を与えないように注意する。そして、心臓と肺に損傷を与えないように注意して、胸郭を通って中腋窩ラインで2つのカットを行います。次に、ダイヤフラムを切り、心臓を部分的に露出させた。マウスを多量に使用するには、プロフュージョン流体の圧力が平均マウス血圧に相当し、血管形態の一貫した拡散および維持を可能にするように重力拡散システムを設置する。次いで、5ミリリットルの室温PBS、10ミリリットルの4%の室温パラホルムアルデヒド、および5ミリリットルの室温PBSを用いて動物を使い過ごします。重力拡散システムに23または25ゲージの蝶の針を接続し、左心室に針を挿入する前に、チューブから空気を排出するために針を通してPBSを実行します。針を所定の位置に固定した後、虹彩はさみを使用して右心房に2センチ未満の切開を行います。目的の組織を新鮮な4%パラホルムアルデヒドに収穫する。腕頭筋動脈を露出するには、はさみを使用して胸骨の正中線を切開し、鉗子を使用して胸部の両側を引っ張って胸腔を完全に開きます。次に、動物を解剖顕微鏡の下に置いて頸動脈を部分的に視覚化し、右頸動脈、腕頭骨動脈、鎖骨下分岐、および大動脈弓が周囲の結合組織および脂肪を洗浄して分離するまで、細かいピンセットを使用して筋肉、結合組織、脂肪を引っ張ります。次に、鉗子を使用して、その分岐の下の右頸動脈をつかみ、鉗子の上に最初のカットを行います。それでも、頸動脈を保持し、鎖骨下動脈を通して2回目の切り口を作り、最後の2つは虚頭症動脈の両側の大動脈アーチを通って切り取る。次に、目的の他の血管組織を収集し、ブラキオセファル動脈および他の組織を室温で一晩4%パラホルムアルデヒド溶液に入れる。腕頭動脈の免疫蛍光染色の場合、大動脈が切り離され、腕頭頭動脈が見える光顕微鏡法によって確認されるまで、ミクロトームを使用してパラフィン埋め込み組織サンプルを通して10マイクロメートルの切片を得る。組織がミクロトームブレードに完全に垂直になるまでブロックの向きを調整し、ガラススライドごとに腕頭筋動脈の厚さ3つの連続10マイクロメートルのセクションを得て、鎖骨下分岐に達するまで。すべての切片が採取されたら、2つの5分間のキシレン浸漬で化学フードの下で組織サンプルを水和し、示された5分間の浸漬エタノールシリーズと2つの5分間の脱イオン水浸漬を行います。次に、抗原検索溶液中のスライドをインキュベートし、標準プロトコルに従い、続いてマイクロ波で20分間加熱する。室温で1時間冷やした後、疎水性ペンを使用して各組織セクションを囲みます。そして、室温で1時間のブロッキングバッファを有する非特異的な結合をブロックする。インキュベーションの終わりに、目的の一次抗体カクテル、またはアイソタイプがIgG対照抗体と一致して、一晩摂氏4度で組織サンプルを標識する。翌朝、PBSで3回、洗浄につき5分間スライドを洗浄し、続いて適切な蛍光共役二次抗体カクテルと核可視化用DAPIで1時間のインキュベーションを行う。次に、蛍光顕微鏡に適した取り付け媒体を使用して、スライドにカバースリップを取り付けます。標識された組織切片の共焦点顕微鏡イメージングでは、IgG制御と一次抗体で染色された切片を使用して、検出器の感度、レーザーパワー、および各チャンネルのオフセットを設定します。次に、Z スタック取得の上下の位置を設定し、イメージ化するスタックの厚みと数を決定します。すべての画像が取得されたら、ImageJで画像を開き、チャンネルツールパネルを開き、異なる染色チャンネルを疑似色にします。カラーチャンネルをマージします。すべてのチャンネルが同じ画像に表示されます。チャンネル ツール パネル内で個々のカラー チャネルのオンとオフを切り替え、カウント アイコンを右クリックしてマルチポイント ツールを選択します。カウントアイコンをダブルクリックしてポイントツールパネルを開き、セルのカウントに使用するアイテムのタイプとサイズを選択します。[すべて表示] をオンにして、チャンネル ツール パネルでのみ DAPI チャネルをオンにします。次に、カウンタ チャネル 0 を選択し、タグ付けする個々の核をクリックし、Z スタックをスクロールして、対象領域内で染色されたすべての核をカウントします。ポイント ツール パネルで、定量化された単一セル イベントの数を以下に示します。すべての核がタグ付けされたら、別の染色チャネルをオンにし、カウンターチャネル1を選択して、DAPIと抗体染色の間に共局在化している細胞にタグを付けます。細胞質染色の場合、必要に応じて複数のZスタックをチェックし、核の深さ全体にわたって核を囲む染色を有する細胞を選択します。その結果は、DAPI の陽性セルの合計数、または対象領域内の領域ごとのセル数に対するセル数として表すことができます。フェノチピッヒマーカーを標的とする抗体による免疫蛍光染色は、示されているように、単一細胞カウントの対象領域の線引きのために個々のマーカー染色および差動干渉コントラストの画像を取得することを可能にする。異なる平滑筋細胞由来集団の存在量を決定する単一細胞数カウントは、ImageJを使用して実行することができる。例えば、これらの代表的な断面の繊維状キャップ領域における単一細胞計数解析は、IgG対照に一致したアイソタイプで処理したマウスと抗IL-1β抗体で処置したマウスとの間の繊維状キャップ領域の細胞組成の顕著な違いを明らかにした。実際、IL-1 βの阻害は、YFP陽性平滑筋細胞の減少と、ガレクチン-3陽性細胞の増加と関連していた。また、YFP陽性平滑筋大動脈αアクチン陽性平滑筋細胞の数の減少が認められた。一方、平滑筋細胞由来YFP陽性ガレクチン-3陽性マクロファージの相対的な数は、両方の虚頭症動脈の位置で有意に増加した。特に、IL-1βの阻害は、病変内の骨軟骨細胞の総数、または平滑筋細胞由来またはマクロファージ由来軟骨細胞の割合に影響を及ぼさなかった。このプロトコルは、組織の採取、処理、切断、および単一細胞数などの主要なステップを標準化することにより、アテローム硬化性病変分析における厳格さと再現性を高めるために設計されています。このプロトコルは、大動脈および大動脈根を含むアテローム硬化性病変を呈しがちな追加の血管床を分析するために使用することができる。

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JoVE Journal

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平滑筋細胞系譜トレースマウスの高度な動脈硬化病変における細胞構成の定量的解析

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