眼微小循環の質量分析法を用いたプロテオミクス解析の前処理

眼サンプルの総合的なプロテオーム解析のための高品質の質量分析適合サンプルの調製は、健康と病気に関係する分子メカニズムとシグナル伝達経路を解明するために重要です。記載された作業フローは、眼微小血管などの質量限定サンプルの分析のために特別に提供される厳格なサンプル調製ステップに対する単純かつ堅牢なアプローチを表す。研究の主な目的は、眼血管のMS適合方法論を確立することであるが、記載された作業フローは、様々な細胞および組織ベースのサンプルに広く適用することができる。

一般的に、この方法に新しい個人は、選択された短い後毛様動脈、またはSPCA枝の同定と分離が困難であり得るので、苦労する可能性があります。新鮮なブタの目は、視神経および眼外組織と共に、すぐに死後に局所アバトワールから得られた。氷冷クレブス-ヘンセレイトバッファーを含む解剖チャンバーに目の地球儀を配置します。

鋭いマヨハサミで周囲の筋肉や組織を慎重に切り取ります。メスで切開し、目が前半分と後部に分離されるまで鋭いマヨハサミで赤道平面に沿って地球を切断します。標準的なパターン鉗子のペアを使用して、目の後半分からできるだけ多くの亜光体を取り除きます。

解剖ピンを使用して目の後部を慎重に固定した後、視神経を取り巻く結合組織をそっと切り取り、基礎となる後部のレトロブルバー血管構造を学生のVannasスプリングハサミで露出させます。5種類の精密ピンセットとVannasカプトロトミーはさみで、周囲の結合組織と一緒にパラオプティックおよび遠位後毛様動脈を分離します。余分な細かい先端のピンセットとはさみを使用して動脈セグメントから結合組織を静かに除去してから、氷冷PBSで孤立した動脈をすすいで汚染物質および血液残留物を除去する。

2つの目から動脈をプールして1つの生物学的複製を得て、次に分析バランスを使用してサンプルを計量する。各チューブに、0.5と1ミリメートルの酸化ジルコニウムビーズの混合物を加え、続いて組織タンパク質抽出試薬を加えます。次に、サンプルチューブをブレンダーホモジナイザーにロードします。

タイマーを 2 分に設定し、速度レベルを 6 に設定し、均質化を開始します。実行後、サンプルの均質化を確認し、各実行の間に氷の上にサンプルを保管してください。サンプルが完全に均質化されるまでサイクルを繰り返します。

ピペットホモネートを新鮮なマイクロ遠心チューブに入念に調整します。試料を10,000倍Gで4°Cで20分間ペレット不溶性タンパク質に遠心分離する。ペレット層に触れることなく可溶性タンパク質を含む上澄み物を慎重にピペットし、新鮮なマイクロ遠心チューブに移します。

各ペレットサンプルに抽出バッファー2A 2Aの200マイクロリットルとプロテアーゼ阻害剤カクテルの5マイクロリットルを加えます。その後、ペレットをピペットで数回懸濁します。ペレットを完全に均質化するために超音波ホモジナイザーを使用してください。

振幅を 60 に設定し、サイクルを 1 に設定します。少量のサンプルの均質化に適したチタン製プローブを使用してください。プローブをペレットに浸し、抽出バッファー混合物を氷の上に浸し、スタートボタンを押します。

ペレットの塊が完全に均質化されるまでサンプルを超音波処理し、各超音波処理の間に数秒間一時停止します。完全な均質化を視覚的に確認します。ホモジュネートをピペットと数回混ぜて、塊がないことを確認します。

この手順では、3キロダルトンカットオフの遠心フィルタデバイスを使用します。3キロダルトンカットオフフィルターユニットをマイクロ遠心チューブに挿入します。ピペット200マイクロリットルのサンプルホモジネートを1つのフィルター装置に加え、200マイクロリットルの脱イオン水を同じフィルターに加えます。

しっかりとキャップした後、フィルターユニットを遠心分離機に入れ、摂氏4度で15分間14,000回Gを回転させます。遠心分離後、試料濃縮物を含むフィルターユニットを、濾液を含むマイクロ遠心チューブから分離し、濾液を廃棄する。400マイクロリットルの脱イオン水をフィルターユニットに加えて濃縮物を再構成します。

濾過を3回繰り返した後、洗浄したサンプル濃縮物を清浄なマイクロチューブに慎重にピペットします。テキストプロトコルに記載されている1次元ゲル電気泳動用サンプルを準備し、ピペットとよく混ぜます。乾燥ブロックヒーターで70°Cでサンプルを15分間加熱し、室温まで冷却します。

ピペットを用いて1レーンあたり50マイクログラムのサンプルを慎重にロードし、分子マスマーカーとして予めタンパク質標準を使用します。ゲルを175ボルトの定電圧で約60分間動かします。ランの最後に、ゲルナイフを用いてカセットプレートからゲルを慎重に取り出し、ゲルをゲル染色ボックスに移します。

テキストプロトコルに記載されているようにゲルの固定と染色を行います。最良の全体的な結果を得るには、染色液中のゲルを一晩振ります。慎重に染色液をデカントし、バックグラウンドをクリアするために水で少なくとも7〜8時間ゲルを振る前に、200ミリリットルの脱イオン水に置き換えます。

きれいな新しいミクロトームブレードでゲルからタンパク質バンドを物品切り。バンドを小さく切り、ゲル片を慎重に1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。重炭酸アンモニウム100ミリモルとアセトニトリルを含む500マイクロリットルの脱染色溶液を加えます。

時折揺れで、室温で30分間インキュベートします。慎重に脱染溶液をピペットアウト。残りの汚れのあるチューブを視覚的に確認し、ゲル片がまだ青色に染まっている場合は、このステップを繰り返します。

約400マイクロリットルの新しく調製したDTT溶液を加え、摂氏56度で30分間インキュベートします。還元液をピペットで廃棄した後、約400マイクロリットルの作製したIAA溶液を加え、暗い温度で30分間インキュベートします。ピペットでアルキル化バッファーを取り出し、廃棄します。

ゲル片が収縮して不透明になるまで、室温で500マイクロリットルのきちんとしたアセトニトリルを10〜15分間加えます。アセトニトリルをピペットアウトし、ボンネットの下でゲル片を5〜10分間空気乾燥させます。次いで、各チューブに50マイクロリットルのトリプシン溶液をピペットしてゲル片を完全に覆い、チューブを摂氏4度でインキュベートする。

30分後、必要に応じてゲル片を完全に覆うのに十分な量のトリプシンバッファーを加える。摂氏37度で一晩サンプルをインキュベートします。ペプチド抽出を行うために、抽出したペプチド溶液をチューブから慎重にピペットし、きれいなマイクロチューブに移す。

遠心式真空蒸発器で上清を乾燥させます。ゲル片を用いて各チューブに100マイクロリットルの抽出バッファーを加え、振盪で30分間インキュベートします。ピペットをそれぞれのバンドに従って抽出したペプチドを含む同じマイクロチューブに上澄み、真空遠心分離機で乾燥させる。

テキストプロトコルに記載されているように、ペプチド精製および液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化MS/MS分析に進みます。各タイプの洗剤で抽出したサンプル中のタンパク質の総量を以下に示します。最も高い収率は、組織タンパク質抽出バッファーで抽出された組織から来て、次いでDDM、CHAPS、ASB-14、およびACNおよびTFAからの最低収量が続いた。

一貫して、同定された全タンパク質は、抽出されたサンプルの組織タンパク質抽出バッファーにおいても最も高く、総収量と同じ傾向に従った。ここに示されているのが、最適化されたサンプル調製および洗浄工程に供される前後のSPCAの一次元ゲル電気泳動タンパク質プロファイルの比較である。全体として、レーン3ではタンパク質バンドの高い塗りつぶしと分離不良が観察された。

このプロファイルは、サンプルが抽出試薬、および脂質および細胞破片などの汚染物質を含んでいてもよいことを示しています。しかしながら、上清とペレットに分離されたSPCA試料を、次に最適化されたプロトコルに供した結果、例示的な1次元ゲル電気泳動プロファイルが得られた。眼マイクロ血管からの迅速で堅牢で効率的なタンパク質抽出のための最適化された方法は、他の組織ベースのサンプルにも容易に適用できます。

ここに示されているのは、上清のタンパク質プロファイルとマウス脳および心臓組織サンプルのペレットである。この手順を試みている間、試料を対象に均質化を完了し、ペレットから上澄みを分離し、汚染物質および抽出試薬を除去することが重要です。その開発後、この技術は、実験および翻訳眼科の分野の研究者が、ブタの目をモデルとして使用して眼血管系のプロテオームを徹底的に探求する道を開いた。