Name: 眼微小循環の質量分析法を用いたプロテオミクス解析の前処理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学ぶ、眼微小循環の質量分析法を用いたプロテオミクス解析の前処理法。ブタの後部毛様体短動脈を用いた迅速で頑健なタンパク質抽出法により、眼疾患の分子メカニズム解明に貢献します。

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博士 Manicam は、内部大学研究資金 (Stufe 1) ヨハネス ・ グーテンベルク大学マインツ、ドイツ研究振興協会 (MA 8006/1-1) からの助成金の大学医療センターからによってサポートされます。

<ol><li>Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+proteomics+with+emphasis+on+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.</a> Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).</li>
<li>Gregorich, Z. R., Ge, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+proteomics+in+health+and+disease%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities.</a> Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537, 347-355 (2016).</li>
<li>Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+platforms+in+vitreoretinal+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Analytical platforms in vitreoretinal proteomics.</a> Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).</li>
<li>Manicam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+Unravels+the+Regulatory+Mechanisms+in+Human+Tears+Following+Acute+Renouncement+of+Contact+Lens+Use%3A+A+Comparison+between+Hard+and+Soft+Lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses.</a> Scientific Reports. 8, 11526(2018).</li>
<li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+%28PRR+4%29+in+human+tear+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome.</a> Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).</li>
<li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+human+tears+from+aqueous-deficient+and+evaporative+dry+eye+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients.</a> Scientific Reports. 6, 29629(2016).</li>
<li>Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+reflex+tear+proteome+reveals+high+expression+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+%28PRR4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4).</a> Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).</li>
<li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+aqueous+humour+proteome%3A+A+comparison+of+the+genders%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders.</a> PloS ONE. 12, 0172481(2017).</li>
<li>Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+ciliary+artery+circulation+in+health+and+disease+the+Weisenfeld+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).</li>
<li>Zeitz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glaucoma+progression+is+associated+with+decreased+blood+flow+velocities+in+the+short+posterior+ciliary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery.</a> British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).</li>
<li>Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+use+of+Sus+scrofa+%28pig%29+as+a+model+system+for+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies.</a> Proteomics. 11, 776-793 (2011).</li>
<li>Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porcine+model+of+selective+retinal+capillary+closure+induced+by+embolization+with+fluorescent+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).</li>
<li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parameters+of+the+porcine+eyeball%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).</li>
<li>Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+insight+into+the+proteome+landscape+of+the+porcine+short+posterior+ciliary+arteries%3A+Key+signalling+pathways+maintaining+physiologic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions.</a> Scientific Reports. 6, 38298(2016).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).</li>
<li>Feist, P., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+challenges%3A+sample+preparation+techniques+for+microgram-quantity+protein+analysis+from+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).</li>
<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+mouse+liver+plasma+membrane%3A+use+of+differential+extraction+to+enrich+hydrophobic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins.</a> Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+and+identification+of+membrane+proteins+from+rat+hepatic+cells+using+a+centrifugal+proteomic+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111(2011).</li>
<li>de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+proteomics+to+the+management+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Contribution of proteomics to the management of vascular disorders.</a> Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).</li>
<li>Cottingham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1DE+proves+its+worth...+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">1DE proves its worth... again.</a> Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

包括的プロテオームの多様な眼のサンプルのプロファイリングは、分子メカニズムと健康と病気に関与するシグナル伝達経路を解明する重要かつ不可欠な最初のステップです。Mandal らによって詳細な説明のレビューで強調されるように、前のサンプルの準備の手順が欠かせない質の高いデータを取得するために、これらの解析から得られた結果の再現性を確保するため、サンプルの処理手順目の別の部分は、二次元ゲル電気泳動および質量分析戦略1を採用しています。これらの調査行は、私たちの現在の研究はモデル眼微小循環としてブタの sPCA を使用して急速な堅牢で非常に効率的な MS 互換試料の最適化手順プロトコルを提供します。この調査は、次の高品質 MS データを生成する数量限定の動脈血サンプルからタンパク質の十分な量を抽出するための具体的方法論の不足を開始されました。本手法はまた優秀なプロテオーム マッピング18を可能にするマイクロ スケール技術の使用に関する知識の既存のボディに貢献する試みです。
定量的プロテオーム解析...

許可は、統合されたデータ収集力を卓越した、プロテオミクスの分野の進歩が大幅同様反射のように特定の病態の分子機構の理解に革命をもたらしました、特定の生理学的状態のセル人口や組織1,2,3,4。プロテオミクスは感度ととして最終的な診断と予後のための潜在的な疾患マーカーの同定を促進する別の眼サンプルの公平な分析により眼科研究の重要なプラットフォームであることも証明しています。証明されてエレガントな多くの研究が近年、私たちのいくつかを含む1,5,6,7,8,9,10。ただし、プロテオーム解析では特に信頼性の高い比較分析の健全な個人からの制御材料の必要性を考慮して、倫理的な理由のための人間のサンプルを得ることが困難、多くの場合。その一方で、最適かつ信頼性の高い質量分析のためのサンプルの十分な量を取得するは困難ですも。これ目のマイクロ血管など質量限定生物学的材料の特に重要です。眼血流の調節に重要な役割を果たしているようなの 1 つの主要な球血船は短後毛様体動脈 (sPCA)。緑内障と通院の前部虚血性視神経症 (NAION)11などいくつか視力を脅かす疾患の発症につながることができる深刻な臨床影響可能性があります任意摂動またはこの血管床の異常,12です。 しかし、上記の欠点のためこの動脈のベッドのプロテオーム変化の解明研究の欠如があります。そのため、近年、家豚 (イノシシイエバエ Linnaeus, 1758) として浮上している良い動物モデル眼科研究では人間とブタ13、間高い形態学的および系統学的類似点のおかげで 14,15。ブタの眼のサンプルが簡単に利用できる最も重要なことは、人間のティッシュのより正確な表現と。
これらの微小血管からの効率的な蛋白質の抽出と解析用の仕出し料理の方法論の不足と同様、目の血管の重要な役割を考慮した我々 は以前特徴付けられる社内を使用して豚の sPCA のプロテオーム解析高蛋白質16数の特定につながったプロトコル。この調査に基づき、さらに最適化して深い説明モデル組織としてブタの sPCA を用いた試料の微量からプロテオーム解析を可能にするこの記事で我々 の方法論。本研究の主な目的は、質量限定眼血管の MS 互換の方法論を確立、とはいえ実質的な実験的証拠を説明したワークフローも広くに適用できるさまざまな組織ベースのサンプルを提供しております。
このワークフローの高品質 MS 互換少量包括的プロテオーム解析のための材料の採取の準備のために尽力されると想定されます。

<table><tbody><tr><td>A. Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1, 4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.11474</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2)&nbsp;</td><td>&nbsp;カール・ロス&nbsp;</td><td>5239.1</td><td>2.5 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸 (CH2O2)</td><td>AppliChem</td><td>A0748</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレード アセトニトリル (ACN, C2H3N)</td><td>AppliChem</td><td>A1605</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレード メタノール (CH3OH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>HPLCグレードの水&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1589</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)&nbsp;</td><td>&nbsp;カール・ロス&nbsp;</td><td>6781.1</td><td>4.7 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム(KH2PO4)</td><td>&nbsp;カール・ロス&nbsp;</td><td>3904.2</td><td>1.2 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>LC-MSグレードの酢酸</td><td>&nbsp;カール・ロス&nbsp;</td><td>AE69.1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO4)&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;カール・ロス&nbsp;</td><td>261.2</td><td>1.2 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE抗酸化剤</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS サンプルバッファー&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Invitrogen)</td><td>NP0007</td><td>4x</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE サンプル還元剤&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>NP0004</td><td>10x</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Invitrogen)</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシンググレード修飾トリプシン</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム(NaCl)</td><td>&nbsp;カール・ロス&nbsp;</td><td>9265.2</td><td>118.3 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)</td><td>&nbsp;カール・ロス&nbsp;</td><td>965.3</td><td>25 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸(TFA,&nbsp;C2HF3O2)</td><td>Merck Millipore</td><td>108178</td><td></td></tr><tr><td>&α;-(D)-(+)- グルコース一水和物</td><td>&nbsp;カール・ロス&nbsp;</td><td>6780.1</td><td>11 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>B. 試薬&キット</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm酸化ジルコニウムビーズ&nbsp;</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm 酸化ジルコニウムビーズ&nbsp;</td><td>Next Advance</td><td>ZROB10</td><td></td></tr><tr><td>コロイドブルー染色&nbsp;キット</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>LC6025</td><td>To stain 25 mini gels per kit</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10-well</td></tr><tr><td>Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK</td><td>Merck Millipore</td><td>71772-3</td><td>20 reactions per kit</td></tr><tr><td>組織タンパク質抽出試薬 (T-PER)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78510</td><td></td></tr><tr><td>C. Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well V-bottom plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td>コーニング 96ウェル平底プレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3595-50EA</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル ミクロトームブレード</td><td>pfm メディカル</td><td>207500014</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルメス #21</td><td>pfm メディカル</td><td>200130021</td><td></td></tr><tr><td>解剖ピン&nbsp;</td><td>カール・ロス</td><td>PK47.1</td><td></td></tr><tr><td>エクストラファイン ボン はさみ</td><td>&nbsp;ファインサイエンスツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン円錐形遠心チューブ (50 mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>メイヨーハサミ、タフカット</td><td>&nbsp;ファインサイエンスツール</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>&nbsp;ファインサイエンスツール</td><td>11251-10</td><td>タイプ5</td></tr><tr><td>精密ピンセット、ストレート、極細チップ付き</td><td>カール・ロス</td><td>LH53.1</td><td>タイプ5</td></tr><tr><td>マイクロプレート用自己接着シールフィルム</td><td>レシオラボ (vWR)</td><td>RATI6018412</td><td></td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>&nbsp;ファインサイエンスツール</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>学生バンナス春はさみ</td><td>&nbsp;ファインサイエンスツール</td><td>91501-09</td><td></td></tr><tr><td>バンナス嚢切開はさみ&nbsp;&nbsp;</td><td>Geuder</td><td>19760</td><td>&nbsp;ストレート、77 mm</td></tr><tr><td>ZipTipC18 ピペットチップ</td><td>Merck Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>D. 機器およびデバイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 &times; 0.5 mm BioBasic C18 カラム</td><td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td><td>72105-150565</td><td></td></tr><tr><td>30 &times; 0.5 mm BioBasic C18 pre-column&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td><td>72105-030515</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 3K遠心フィルター装置&nbsp;</td><td>メルクミリポア</td><td>UFC500396</td><td>96個入りパック。</td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>ザルトリウス</td><td>H51</td><td></td></tr><tr><td>オートサンプラー&nbsp;</td><td>CTC Analytics AG、ツヴィンゲン、スイス</td><td>HTS Pal</td><td></td></tr><tr><td>BBY24M Bullet Blender Storm&nbsp;</td><td>次へ アドバンス</td><td>NA-BB-25</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ濃縮器、モデル 5301</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z368172</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ微量遠心分離機、モデル 5424</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-403-93</td><td>非冷蔵</td></tr><tr><td>ヘレウス プリモ R 遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィ</td>ック <td>75005440</td><td>冷蔵</td></tr><tr><td>ラボソニック M 超音波ホモジナイザー&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8535027</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS ポンプ、モデル Rheos Allegro</td><td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td><td>22080</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap XL 質量分析計&nbsp;</td><td>Thermo Scientific、ブレーメン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiskan Ascent プレートリーダー&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>v2.6</td><td></td></tr><tr><td>ローテーター (ボルテックス付き) &nbsp;</td><td>neoLab</td><td>7-0045</td><td></td></tr><tr><td>チタンプローブ (&Oslash; 0.5 mm, 80 mm long)</td><td>ザルトリウス</td><td>BBI-8535612</td><td></td></tr><tr><td>超音波浴、タイプ RK 31</td><td>バンデリン</td><td>329</td><td></td></tr><tr><td>Xcell Surelock Mini Cell</td><td>Life Technologies</td><td>El0001</td><td></td></tr></tbody></table>

眼微小循環の質量分析法を用いたプロテオミクス解析の前処理

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

分離の眼血管高度な科学技術のアプローチを使用して眼の病態生理学的状態を解読する生体外での使用ある特定の病気の私達の理解を大きく拡げた。質量分析法 (MS)-基づくプロテオミクスの分子機構、蛋白質シグナリング経路健康および病気の血管のベッドでの変化を解明するための強力なツールとして浮上しています。ただし、MS 分析前にサンプル準備の手順が再現性のある結果と複雑なプロテオームの詳細な解明を取得する重要です。これは眼微小循環、分析に利用可能なサンプル量が多いし、したがって、最適な蛋白質の抽出のための挑戦を提起の準備のため特に重要です。この記事は、ブタの短後毛様体動脈を採用の模範的な球の眼の血管床からのサンプル準備のための効率的で高速かつ堅牢なプロトコルを提供するよう努力します。現在法清次の均質化、サンプルのペレットからのタンパク質抽出手順当ててサンプル次元ゲルの電気泳動およびペプチッドの浄化の前に、遠心ろ過デバイスのクリーニング液体クロマトグラフィー-エレクトロ スプレー イオン化線形イオン トラップ Orbitrap MS におけるラベル無料定量化のための手順。このメソッドは、眼血管のプロテオミクス解析のために特別に開発されているが説得力のある証拠、それも容易に使用できる他組織ベースのサンプルも用意いたしました。

限られたサンプル可用性は、眼科研究の主な欠点の 1 つです。同様に、抽出収量の法最適なタンパク質サンプルの少量から眼の血管は議論の余地が多いよう。日には、特に球血管からの蛋白質の抽出のための仕出し料理の方法の不足があります。したがって、メソッドの最適化の最初のステップとして、一般的効果、いくつかの信頼性を比較する - 原則の証拠として比較的新しい試薬、T にタンパク質抽出洗剤を採用-あたり、心臓組織を用いた予備的研究を行ったマウス (のために簡単かつ十分なサンプル可用性の最適化手順のため)。総蛋白濃度とその次の試薬を使用して識別される総蛋白を比較することによってタンパク質の収量を比較した: T-0.02 %n-ドデシル-β-D-maltoside (DDM) 1 %3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio あたり]-1-プロパンのスルフォン酸<...

眼の血管ベッドのプロテオーム解析は人間の多くの眼の病態の詳細な理解のため極めて重要です。本研究は、蛋白質の抽出と質量分析法を用いたプロテオミクス解析のモデル船としてブタの短後毛様体動脈を用いた微小血管からのサンプルの準備のため、迅速、効率的で堅牢なメソッドを示します。

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

眼サンプルの総合的なプロテオーム解析のための高品質の質量分析適合サンプルの調製は、健康と病気に関係する分子メカニズムとシグナル伝達経路を解明するために重要です。記載された作業フローは、眼微小血管などの質量限定サンプルの分析のために特別に提供される厳格なサンプル調製ステップに対する単純かつ堅牢なアプローチを表す。研究の主な目的は、眼血管のMS適合方法論を確立することであるが、記載された作業フローは、様々な細胞および組織ベースのサンプルに広く適用することができる。一般的に、この方法に新しい個人は、選択された短い後毛様動脈、またはSPCA枝の同定と分離が困難であり得るので、苦労する可能性があります。新鮮なブタの目は、視神経および眼外組織と共に、すぐに死後に局所アバトワールから得られた。氷冷クレブス-ヘンセレイトバッファーを含む解剖チャンバーに目の地球儀を配置します。鋭いマヨハサミで周囲の筋肉や組織を慎重に切り取ります。メスで切開し、目が前半分と後部に分離されるまで鋭いマヨハサミで赤道平面に沿って地球を切断します。標準的なパターン鉗子のペアを使用して、目の後半分からできるだけ多くの亜光体を取り除きます。解剖ピンを使用して目の後部を慎重に固定した後、視神経を取り巻く結合組織をそっと切り取り、基礎となる後部のレトロブルバー血管構造を学生のVannasスプリングハサミで露出させます。5種類の精密ピンセットとVannasカプトロトミーはさみで、周囲の結合組織と一緒にパラオプティックおよび遠位後毛様動脈を分離します。余分な細かい先端のピンセットとはさみを使用して動脈セグメントから結合組織を静かに除去してから、氷冷PBSで孤立した動脈をすすいで汚染物質および血液残留物を除去する。2つの目から動脈をプールして1つの生物学的複製を得て、次に分析バランスを使用してサンプルを計量する。各チューブに、0.5と1ミリメートルの酸化ジルコニウムビーズの混合物を加え、続いて組織タンパク質抽出試薬を加えます。次に、サンプルチューブをブレンダーホモジナイザーにロードします。タイマーを 2 分に設定し、速度レベルを 6 に設定し、均質化を開始します。実行後、サンプルの均質化を確認し、各実行の間に氷の上にサンプルを保管してください。サンプルが完全に均質化されるまでサイクルを繰り返します。ピペットホモネートを新鮮なマイクロ遠心チューブに入念に調整します。試料を10,000倍Gで4°Cで20分間ペレット不溶性タンパク質に遠心分離する。ペレット層に触れることなく可溶性タンパク質を含む上澄み物を慎重にピペットし、新鮮なマイクロ遠心チューブに移します。各ペレットサンプルに抽出バッファー2A 2Aの200マイクロリットルとプロテアーゼ阻害剤カクテルの5マイクロリットルを加えます。その後、ペレットをピペットで数回懸濁します。ペレットを完全に均質化するために超音波ホモジナイザーを使用してください。振幅を 60 に設定し、サイクルを 1 に設定します。少量のサンプルの均質化に適したチタン製プローブを使用してください。プローブをペレットに浸し、抽出バッファー混合物を氷の上に浸し、スタートボタンを押します。ペレットの塊が完全に均質化されるまでサンプルを超音波処理し、各超音波処理の間に数秒間一時停止します。完全な均質化を視覚的に確認します。ホモジュネートをピペットと数回混ぜて、塊がないことを確認します。この手順では、3キロダルトンカットオフの遠心フィルタデバイスを使用します。3キロダルトンカットオフフィルターユニットをマイクロ遠心チューブに挿入します。ピペット200マイクロリットルのサンプルホモジネートを1つのフィルター装置に加え、200マイクロリットルの脱イオン水を同じフィルターに加えます。しっかりとキャップした後、フィルターユニットを遠心分離機に入れ、摂氏4度で15分間14,000回Gを回転させます。遠心分離後、試料濃縮物を含むフィルターユニットを、濾液を含むマイクロ遠心チューブから分離し、濾液を廃棄する。400マイクロリットルの脱イオン水をフィルターユニットに加えて濃縮物を再構成します。濾過を3回繰り返した後、洗浄したサンプル濃縮物を清浄なマイクロチューブに慎重にピペットします。テキストプロトコルに記載されている1次元ゲル電気泳動用サンプルを準備し、ピペットとよく混ぜます。乾燥ブロックヒーターで70°Cでサンプルを15分間加熱し、室温まで冷却します。ピペットを用いて1レーンあたり50マイクログラムのサンプルを慎重にロードし、分子マスマーカーとして予めタンパク質標準を使用します。ゲルを175ボルトの定電圧で約60分間動かします。ランの最後に、ゲルナイフを用いてカセットプレートからゲルを慎重に取り出し、ゲルをゲル染色ボックスに移します。テキストプロトコルに記載されているようにゲルの固定と染色を行います。最良の全体的な結果を得るには、染色液中のゲルを一晩振ります。慎重に染色液をデカントし、バックグラウンドをクリアするために水で少なくとも7〜8時間ゲルを振る前に、200ミリリットルの脱イオン水に置き換えます。きれいな新しいミクロトームブレードでゲルからタンパク質バンドを物品切り。バンドを小さく切り、ゲル片を慎重に1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。重炭酸アンモニウム100ミリモルとアセトニトリルを含む500マイクロリットルの脱染色溶液を加えます。時折揺れで、室温で30分間インキュベートします。慎重に脱染溶液をピペットアウト。残りの汚れのあるチューブを視覚的に確認し、ゲル片がまだ青色に染まっている場合は、このステップを繰り返します。約400マイクロリットルの新しく調製したDTT溶液を加え、摂氏56度で30分間インキュベートします。還元液をピペットで廃棄した後、約400マイクロリットルの作製したIAA溶液を加え、暗い温度で30分間インキュベートします。ピペットでアルキル化バッファーを取り出し、廃棄します。ゲル片が収縮して不透明になるまで、室温で500マイクロリットルのきちんとしたアセトニトリルを10〜15分間加えます。アセトニトリルをピペットアウトし、ボンネットの下でゲル片を5〜10分間空気乾燥させます。次いで、各チューブに50マイクロリットルのトリプシン溶液をピペットしてゲル片を完全に覆い、チューブを摂氏4度でインキュベートする。30分後、必要に応じてゲル片を完全に覆うのに十分な量のトリプシンバッファーを加える。摂氏37度で一晩サンプルをインキュベートします。ペプチド抽出を行うために、抽出したペプチド溶液をチューブから慎重にピペットし、きれいなマイクロチューブに移す。遠心式真空蒸発器で上清を乾燥させます。ゲル片を用いて各チューブに100マイクロリットルの抽出バッファーを加え、振盪で30分間インキュベートします。ピペットをそれぞれのバンドに従って抽出したペプチドを含む同じマイクロチューブに上澄み、真空遠心分離機で乾燥させる。テキストプロトコルに記載されているように、ペプチド精製および液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化MS/MS分析に進みます。各タイプの洗剤で抽出したサンプル中のタンパク質の総量を以下に示します。最も高い収率は、組織タンパク質抽出バッファーで抽出された組織から来て、次いでDDM、CHAPS、ASB-14、およびACNおよびTFAからの最低収量が続いた。一貫して、同定された全タンパク質は、抽出されたサンプルの組織タンパク質抽出バッファーにおいても最も高く、総収量と同じ傾向に従った。ここに示されているのが、最適化されたサンプル調製および洗浄工程に供される前後のSPCAの一次元ゲル電気泳動タンパク質プロファイルの比較である。全体として、レーン3ではタンパク質バンドの高い塗りつぶしと分離不良が観察された。このプロファイルは、サンプルが抽出試薬、および脂質および細胞破片などの汚染物質を含んでいてもよいことを示しています。しかしながら、上清とペレットに分離されたSPCA試料を、次に最適化されたプロトコルに供した結果、例示的な1次元ゲル電気泳動プロファイルが得られた。眼マイクロ血管からの迅速で堅牢で効率的なタンパク質抽出のための最適化された方法は、他の組織ベースのサンプルにも容易に適用できます。ここに示されているのは、上清のタンパク質プロファイルとマウス脳および心臓組織サンプルのペレットである。この手順を試みている間、試料を対象に均質化を完了し、ペレットから上澄みを分離し、汚染物質および抽出試薬を除去することが重要です。その開発後、この技術は、実験および翻訳眼科の分野の研究者が、ブタの目をモデルとして使用して眼血管系のプロテオームを徹底的に探求する道を開いた。

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生物学

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この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV...

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眼微小循環の質量分析法を用いたプロテオミクス解析の前処理

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